Vergelijkende analyse van menselijk groeihormoon in het serum met behulp spri, Nano-SPRI en ELISA assays

Het algemene doel van deze studie is om het diagnostisch potentieel van directe en versterkte surface plasmon resonance imaging, of SPRi-assays, te beoordelen voor de detectie van biomarkers in serum, en dit direct te vergelijken met de commercieel verkrijgbare enzyme-linked immunosorbent assay-kit. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in het biomedische veld, zoals het signaleren van een vroeg stadium van een ziekte en het bieden van middelen om de therapeutische effectiviteit te monitoren. Het belangrijkste voordeel van SPRi is dat het labelvrije, real-time monitoring en visualisatie van biomoleculaire interacties mogelijk maakt door veranderingen in de brekingsindex nabij het sensoroppervlak te registreren.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose van hGH-spiegels in serum, aangezien endogeen hGH is gekoppeld aan talrijke medische aandoeningen die de menselijke groei en ontwikkeling beïnvloeden. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor de voorbereiding van de oppervlaktechemie van de biochip moeilijk te leren zijn en elke fout de resultaten enorm kan beïnvloeden. Nadat de oplossingen en eiwitmonsters volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, gebruikt u 120 milliliters gestabiliseerde piranha-oplossing om de goudchip te reinigen door middel van sonicatie bij 50 °C gedurende 90 minuten.

Spoel de chip af met water en plaats deze vijf minuten in een ultrasoonbad met water. Spoel de chip vervolgens af met ethanol en droog deze met een stroom stikstof. Plaats de gouden chip gedurende 30 minuten in een UV-ozonkamer om eventuele verontreinigingen te verwijderen.

Voeg vervolgens 150 milligram 11-mercaptoundecanoëzuur toe aan 20 milliliters ethanol in een reageerbuis met een plastic dop om ondersteuning voor de chip te bieden, en een roerdeestokje om de oplossing homogeen te mengen. Plaats de chip in de reageerbuis en sluit deze af. Zet de buis vervolgens in de magnetron op 50 watt en 50 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Spoel de chip met ethanol en laat deze vijf minuten in ethanol weken. Herhaal het spoelen met water en laat de chip vijf minuten weken. Voeg 150 milligram 1-Ethyl-3-carbodiimide toe aan 20 milliliters water in een reageerbuis met een roerstaf.

Plaats de chip in het reageerbuisje en verhit deze in de magnetron zoals zojuist gedemonstreerd. Spoel de chip af met water en laat deze vijf minuten in water weken. Voeg vervolgens 150 milligram N-Hydroxysuccinimide toe aan 20 milliliters water in een reageerbuisje met een roerstafje.

Voeg de chip toe aan de reageerbuis, sluit deze af met een dop en plaats deze in de magnetron. Na het spoelen en weken van de chip in water zoals voorheen, voegt u 250 micromolair polyethyleenglycol in 20 milliliters water toe aan een reageerbuis met een roerstaafje. Voeg de chip toe en plaats deze in de magnetron, spoel vervolgens en week de chip in water zoals voorheen.

Bereid een anti-rhGH antilichaamoplossing voor van 15 µg/mL, en anti-IgG als negatieve controle, en voeg 10 µL van elk toe aan een aparte put in een 384-well plaat. Ontwerp het spotting-patroon in de microarrayer en spot de chip met de antilichamen met behulp van een teflon-getipte pin van 500 µm. Incubeer de gespotte chip gedurende twee uur bij kamertemperatuur en een luchtvochtigheid van 75%.

Nadat het SPRi-experiment is opgezet en de chip volgens het tekstprotocol is geblokkeerd, bereidt u een oplossing van rhGH met de volgende set concentraties in PBS, bevattend 10% serum en één milligram per milliliter BSA. Het is belangrijk om het type blokkeringsmolecuul te benadrukken dat in deze stap is gekozen, aangezien het doel is om aspecifieke interacties te minimaliseren.

Bereid een twee-op-één oplossing voor door één µL van zes µM biotine-gelabelde anti-rhGH detectie-antilichamen toe te voegen aan drie µL van één µM streptavidine-gecoate nabij-infrarode quantum dots in een 0,5 mL microcentrifugebuis. Injecteer 150 µL van een met hGH gespike human serum-oplossing in de injectielus. Een sterke toename van het signaal zal worden gevolgd door een langzame daling doordat het aspecifiek gebonden serum van het oppervlak wordt weggespoeld.

Zodra het signaal stabiliseert, wordt het oppervlak gewassen met een oplossing van 450 millimolar natriumchloride, toegevoegd aan de loopbuffer. Verdun de oplossing van anti-rhGH-detectieantilichamen en quantum dots met loopbuffer tot een concentratie van 10 nanomolar en injecteer deze in de flowcel. Importeer de gegevens in een data-analyseprogramma.

Zet vervolgens het SPRi-signaal uit tegen de tijd en bepaal het verschil tussen de anti-rhGH- en de negatieve controle-antilichaamspots na de wasstap met een hoge zoutconcentratie. Om de ELISA uit te voeren, bereid dan, na het voorbereiden van de reagentia, de met antilichamen gecoate wells en de standaarden volgens het tekstprotocol, de monsters van rhGH-hormoon in 10% menselijk serum voor in de volgende concentraties. Voeg 50 µL van elke standaard, controle en monster in triplikaat toe aan elke well.

Seal vervolgens de wells en incubeer deze gedurende de nacht bij vier graden Celsius met zacht schudden. Verwijder de volgende dag de plaat uit de shaker en laat deze op kamertemperatuur komen. Warm de anti-rhGH HRP, conjugaatbuffer, wasbuffer, chromogeen tetramethylbenzidine, of TMB, en stopreagens op tot kamertemperatuur.

Om de werk reagentia voor te bereiden, gebruik dan conjugaatbuffer om een 40x verdunning van anti-rhGH HRP te maken. Gebruik gedestilleerd water om de wasbuffer 200x te verdunnen. Voeg 50 microliters anti-rhGH HRP conjugaat toe aan elke put.

Sluit de wells af en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Giet de oplossing uit de wells af, keer de plaat om en tik deze droog op absorberend papier. Voeg 200 µL wasbuffer toe aan elke well, voordat deze opnieuw worden leeggegoten en drooggetikt.

Herhaal de wasbeurt drie keer. Het is belangrijk om tegen de 96-wells plaat te tikken om hulpstoffen te verwijderen, aangezien alleen het gebruik van de pipet niet effectief is. Voeg vervolgens, binnen 15 minuten na de wasstap, 100 µL chromogeen toe aan elke well.

Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker onder zachte schudding. De kleurloze oplossingen zullen blauw worden. Voeg 100 µL van het stopreagens toe aan elke well.

De oplossingen zullen van blauw naar geel verkleuren. Gebruik een plaatlezer op 450 nanometer om onmiddellijk de absorbentie van elke well uit te lezen. Zet tot slot de standaardcurve uit voor de meegeleverde standaarden, en zet vervolgens de optische dichtheid van de rhGH in 10% serummonsters uit tegen de concentratie van elk monster.

In deze video werden de prestaties van SPRi en nano-SPRi vergeleken met ELISA voor de detectie van rhGH. Deze figuur toont de titratiecurve van rhGH toegevoegd aan 10% menselijk serum, uitgezet tegen de verkregen OD bij 450 nanometer. Er werd een goede lineaire respons waargenomen, en de detectielimiet werd bepaald op één nanogram per milliliter.

Hier werd de detectie van rhGH beoordeeld met SPRi. Elk punt op de concentratiegradiëntcurve vertegenwoordigt de gemiddelde waarde van het reflectiviteitsverschil, berekend op basis van drie SPRi-kinetiekcurves per concentratie. De detectielimiet, of LoD, werd vastgesteld op 3,61 nanogram per milliliter.

Om de gevoeligheid van de SPRi-biosensor te verhogen, werden nano-enhancers opeenvolgend aan de sensor toegevoegd. In dit experiment versterkten de nano-enhancers de respons van de biosensor tot 7,9%, terwijl de signaalverandering bij de controle minimaal was. De praktische toepasbaarheid van de nano-SPRi-biosensor werd geëvalueerd door het meetbereik van rhGH te bepalen van 30.000 tot 0,25 picogram per milliliter.

De LoD werd berekend op 9,2 picogram per milliliter, en de variatiecoëfficiënt bedroeg 20%. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in één uur worden uitgevoerd voor directe detectie, en in twee uur voor nano-SPRi, mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de condities voor elke stap geoptimaliseerd moeten worden; nadat dit is gebeurd, kunnen de resultaten eenvoudig in een kortere tijd worden gereproduceerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals multi-tuff- en maspeck-analyse, direct op de chip worden uitgevoerd na een SPRi-experiment, om u aanvullende inzichten te verschaffen in het gevangen molecuul.

Na de ontwikkeling zou deze techniek de weg moeten vrijmaken voor onderzoekers in het veld van de medische diagnostiek om de gelijktijdige detectie van meerdere biomarkers te verkennen die gerelateerd zijn aan kanker, neurologische en cardiovasculaire aandoeningen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het opzetten van een SPRi-, een nano-SPRi- en een ELISA-assay voor de detectie van hGH-niveaus in menselijk serum. Vergeet niet dat werken met reagentia uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er bij het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en een beschermende bril.