Name: Genoombrede kartering van Drug-DNA interacties in cellen met kosmische (Crosslinking van kleine moleculen te isoleren chromatine) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Leer de COSMIC-methode om genoombrede bindingsprofielen van DNA-gerichte kleine moleculen te bepalen. Deze techniek meet directe ligand-DNA-interacties en biedt inzicht in werkingsmechanismen voor therapeutische ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de leden van het Ansari-lab en Prof. Parameswaran Ramanathan voor nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies CA133508 en HL099773, de H. I. Romnes-faculteitsbeurs, en de W. M. Keck Medical Research Award aan A.Z.A. G.S.E. werd ondersteund door een Peterson Fellowship van het Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. werd ondersteund door de Morgridge Graduate Fellowship en de Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, en D.B. werd ondersteund door de NSEC-subsidie van NSF.

1. Crosslinking in levende cellen <ol><li> Te beginnen met ~ 2,5x10 7 H1 cellen, of andere gekweekte cellen. OPMERKING: Dit nummer van H1 cellen komt overeen met vijf 10-cm schalen (ongeveer 40% confluentie). </li><li> Groeien cellen in E8 media op schotels op een oppervlak dat pluripotente stamcellen ondersteunt bekleed (zie Materials List) en incubeer ze op 37 ° C in bevochtigde atmosfeer van 5% CO2. Oogst cellen enzymatisch (zie Materials List). Opmerking: Sta niet toe dat H1 cellen tot 90% confluentie overschrijden; confluentie induceert spontane differentiatie van H1 cellen. Om cellen te tellen, groeien een extra 10 cm schotel van cellen, til de cellen enzymatisch, zoals beschreven in paragraaf 1,8-1,10, en tel ze met een hemocytometer. <ol><li> Bereid E8 kweekmedia zoals beschreven in Chen et al. 54 </li></ol></li><li> Voorafgaand aan het toevoegen polyamide, verwijder het gebruikte kweekmedium met een Pasteur pipet bevestigd aan een vacuüm te houden. Voeg verse media met alserological pipet en pipet dispenser (8 ml per 10 cm schaal). OPMERKING: Voeg de media aan de zijkant van de schaal om te voorkomen dat verstoring van de cellen. Vanaf dit punt de cellen te beschermen tegen het licht om voortijdige foto-verknoping te voorkomen. </li><li> Polyamide Voeg met een pipet (8 ul van 400 uM polyamide in DMSO, 400 nM eindconcentratie) direct aan het kweekmedium van elk gerecht. Zwenk de schotel naar het polyamide gelijkmatig te verspreiden in de media. OPMERKING: concentratie kan worden gevarieerd, maar voorkomen dat cellulaire toxiciteit wordt waargenomen voor de geselecteerde behandeling. </li><li> Incubeer de cellen 24 uur 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en zorgen ze beschermd tegen licht. Opmerking: De incubatietijd kan worden gevarieerd om polyamide te meten binding in de tijd. </li><li> Was elke 10 cm schaal met 4 ml PBS (1,05 mM monobasisch kaliumfosfaat, 155,17 mM natriumchloride, 2,97 mM natriumfosfaat dibasisch) met behulp van een serologische pipet en pipet disPenser. Zuig PBS en voeg 3 ml E8 cultuur media. </li><li> Met de lichten gedimd, verwijder het deksel van 5 cultuur gerechten en plaats de cellen op een vlakke ondergrond buiten de kap. Plaats een glas filter over de 5 cultuur gerechten uit te filteren licht met λ &lt;300 nm. Plaats de UV bron boven filter. Crosslink monsters 30 min met 365 nm UV- bestraling (2,4 mW / cm 2). OPMERKING: Verknopende tijd moet empirisch worden bepaald. </li><li> Transfer cultuur gerechten terug naar de kap. Zuig het medium met een Pasteur pipet bevestigd aan een vacuüm te houden. Was elke 10-cm schaal met 4 ml PBS. Zuig het PBS. Voeg 3 ml enzym voor mobiele dissociatie (zie Materials List) per 10 cm schotel om de cellen te scheiden. Incubeer 5 minuten bij 37 ° C. OPMERKING: pre-warm het enzym. </li><li> Quench het enzym met 3 ml E8 media per gerecht. Transfer gescheiden cellen in een 15 ml conische buis. OPMERKING: Plaats cellen op ijs vanaf dit punt verder. </li><li> Centrifuge gescheiden cellen 5 min, 500 x g bij 4 ° C. Zuig supernatant enzym en media te verwijderen. OPMERKING: Pauze punt. Cellen kunnen snel bevroren in vloeibare stikstof, bewaard bij -80 ° C voor verdere verwerking op een later tijdstip. </li></ol> 2. Isolatie van chromatine <ol><li> Voeg 1,2 ml COSMIC buffer (20 mM Tris-HCl [pH 8,1], 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton-X100, 0,1% SDS) en de pipet op en neer meerdere malen de celpellet voor elk monster in hersuspenderen 1,2 ml COSMIC buffer. <ol><li> Voeg 133 ul van elk 100 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 100 mM benzamidine en 150 uM pepstatine proteaseremmers vers tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM van PMSF en benzamidine en 1,5 pM van pepstatine. Split oplossing van cellysaat in twee amber 1,7 ml microcentrifugebuisjes. </li></ol></li><li> Ultrasone trillingen met sonicator 35 min (10 sec op 10 sec af, 60% vermogen) om het genoom te fragmenteren om tussen de 100 and 500 bp. <ol><li> Houd het niveau van chromatine oplossing in de microcentrifugebuis evenwijdig aan het waterniveau in het reservoir. Bevestig dit niveau door visuele inspectie. . OPMERKING: Controleer of DNA werd geknipt met een 1,5% agarosegel 55 </li><li> Optimaliseer de ultrasoonapparaat tijd empirisch. Met een minimale hoeveelheid ijs in het reservoir aan de monsters koelen en zorgen het ijs niet storende tussen de monsters en de cup horn. </li></ol></li><li> Centrifuge het monster 12.000 xg 10 min. Bewaar de oplossing in water oplosbare chromatine bevat door deze naar een nieuwe microcentrifugebuis amber met een pipet. Gooi de pellet. </li><li> Breng 110 pi (10%) van het monster op een nieuwe microcentrifugebuis en label het input-DNA. Bewaren bij -80 ° C. Sla de rest van het chromatine monster op ijs voor gebruik in stap 3.3. </li></ol> 3. Vangst van Ligand-DNA Crosslinks <ol><li> Gebruik een pipet tot 60 pi streptavi afziendin-beklede magnetische kralen in een microcentrifugebuis. Voeg 1 ml COSMIC buffer en meng op een nutator 5 min bij RT. Plaats magnetische kralen aan magnetische scheiding rack 2 min tot kralen te vangen. Verwijder COSMIC buffer met een pipet. OPMERKING: Laat de kralen te drogen. Direct doorgaan naar de volgende stap. </li><li> Voeg chromatine monster (~ 1 ml) aan korrels (60 ui) en resuspendeer de kralen. Incubeer chromatine met met streptavidine beklede magnetische korrels tenminste 4 uur op een roterende, schommelen menger bij 4 ° C. Incubeer desgewenst de monsters O / N. </li></ol> 4. Isolatie van affiniteit-gezuiverde DNA <ol><li> Was kralen met 7 min interval bij kamertemperatuur met de volgende wasbuffers om niet-specifieke interacties te verwijderen. Gebruik een magnetische scheiding rek kralen vangen na elke wasbeurt. Resuspendeer de kralen na elke wijziging in wasbuffer. </li><li> Bereid wasbuffers in gedestilleerd gedemineraliseerd water en filter (0,2 micrometer) voor gebruik. WINKEL wasbuffers 1 en 2 bij 4 ° C gedurende several maanden. Bereid Wash Buffer 3 fris elke dag. Toevoegen en verwijderen wassen buffers uit het monster met een pipet. Voor 2 en 4, voeg 1 en 3 (5 mM), respectievelijk in de wassingen. Monsters kunnen bovendien tweemaal gewassen met COSMIC buffer (na 12 uur, na 4 uur) voor de onderstaande wasbeurten. <ol><li> Eenmaal met Wash Buffer 1 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 3% SDS). Eenmaal met wasbuffer 2 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP40, 1% natriumdeoxycholaat). Tweemaal wassen met wasbuffer 3 (4 M ureum, 10 mM Tris-Cl [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,1% NP-40). Tweemaal wassen met Tris-EDTA (TE) buffer (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA). </li></ol></li><li> Resuspendeer de kralen in 200 gl TE-buffer met een pipet. Dit monster van gevangen DNA wordt aangeduid met affiniteit gezuiverd (AP) DNA. </li><li> Een aanvulling op de Input en AP DNA met 10x Crosslink Reversal buffer (100 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 M KOH, 4 mMEDTA) tot een eindconcentratie 1x. 56,57 Incubeer 30 min bij 90 ° C. OPMERKING: 254 nm UV-bestraling kan ook worden gebruikt voor het verknopen psoraleen, 58 maar cyclobutyl pyrimidine dimeren kunnen worden gevormd door bestraling bij deze golflengte te keren en interfereren met verdere verwerking van DNA. </li><li> AP DNA, plaatst de microcentrifugebuis met het monster op magnetische scheiding rek 2 min bij RT en het isoleren van vloeistof (DNA) met een pipet. Breng de AP DNA (dat is afgegeven uit de korrels) in nieuw amber microcentrifugebuis. Opmerking: De gewenste AP DNA wordt in de vloeistof niet meer gekoppeld aan de korrels. </li><li> Neutraliseer Input en AP DNA met geconcentreerd HCl tot pH 7 door toevoeging van ongeveer 1 ui 6 N HCl per 100 pl monster met een pipet. Bevestig de monsters worden geneutraliseerd door het toevoegen van ~ 0,5 ul op pH-papier met een pipet. WAARSCHUWING: Geconcentreerd HCl is een sterk bijtend zuur. Verwerken volgens uw instelling217; s richtlijnen voor de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. </li><li> Voeg RNase A (100 mg / ml) met 0,2 ug / ul eindconcentratie zowel input en AP DNA. Incubeer 1 uur bij 37 ° C. Voeg Proteinase K (20 mg / ml) met 0,2 ug / ul eindconcentratie zowel Input en AP DNA toe. Incubeer 1 uur bij 55 ° C. </li><li> Zuiveren het DNA met een DNA-kolom opruimen kit (zie Materials List). 55 Elueer DNA in 58 pl DNA-klasse H 2 O. Store Input en AP monsters bij -20 of -80 ° C </li><li> Analyseer AP DNA door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) met een locus-specifieke primers en / of next-generation sequencing. Voor qPCR gebruikt 2 pl AP DNA per locus met de volgende parameters: 1 cyclus van 95 ° C 10 minuten en 40 cycli van 95 ° C 20 sec, 54 ° C of 56 ° C 20 sec, 72 ° C 40 sec. OPMERKING: De annealing temperatuur moet worden aangepast aan de smelttemperatuur van de primerparen gebruikt. Selecteer een gloeien temperatuopnieuw dat minimaliseert de kwantificering cyclus zonder specifieke amplificatie. LET OP: Voor de analyse van next-generation sequencing, streven naar minstens 10 miljoen toegewezen leest. Het aantal toegewezen leest kan worden verhoogd door de hoeveelheid van AP DNA en door het combineren van minder monsters in een run voor sequentiebepaling. Meer leest betere gevoeligheid. Standaard pakketten voor ChIP-seq analyse (bv, Homerus, MACS 59, 60 en 61 SPP) werken met kosmische-seq data. Net als bij andere methoden die vertrouwen op next-generation sequencing, waaronder genoom sequencing en ChIP-seq, repetitieve gebieden creëren onduidelijkheden in uitlijning en assemblage en blijven dus een technische uitdaging. </li></ol>

A.Z.A. is de enige eigenaar van Vista Motif, LLC en WINStep Forward.

Een van de grootste uitdagingen met conventionele ChIP is de identificatie van geschikte antilichamen. ChIP is sterk afhankelijk van de kwaliteit van het antilichaam, en de meeste commerciële antilichamen zijn onaanvaardbaar voor ChIP. In feite ontdekte het Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium dat slechts 20% van de commerciële antilichamen geschikt is voor ChIP-assays.50 Met COSMIC worden antilichamen vervangen door streptavidin. Omdat polyamiden zijn gefunctionaliseerd met biotin, wordt streptavi...

De informatie om elke cel in het lichaam wordt gecodeerd in DNA. Het selectief gebruik van deze informatie bepaalt het lot van een cel. Transcriptiefactoren (TFs) zijn eiwitten die binden aan specifieke DNA-sequenties van een bepaalde subset van de genen in het genoom expressie en de storing van TF is in verband met het ontstaan ​​van een breed scala aan ziekten, waaronder ontwikkelingsstoornissen, kanker en diabetes . 1,2 We hebben interesse in het ontwikkelen moleculen die selectief kan binden aan het genoom moduleren gen-regulerende netwerken zijn. Polyamiden samengesteld uit N -methylpyrrole en N -methylimidazole zijn rationeel ontworpen moleculen die DNA met specificiteiten en affiniteiten die rivaliserende natuurlijke transcriptiefactoren. 3-6 Deze moleculen binden aan specifieke sequenties in de kleine groef van DNA kunnen richten. 4,5,7 -11 Polyamiden zijn gebruikt om zowel Repress en activeren van de expressie van specifieke genes. 4,12-19 Ze hebben ook interessante antivirale 20-24 en antikanker 12,13,25-30 eigenschappen. Een aantrekkelijke eigenschap van polyamiden is hun vermogen om DNA-sequenties die zijn gemethyleerd 31,32 en rond histoneiwitten 9,10,33. Om de doorlopende bindingsspecificiteiten van DNA-bindende moleculen te meten, ons lab gemaakt de verwante plaats identifier (CSI) methode. 34-39 De voorspelde optreden van bindingsplaatsen op basis van in vitro specificiteiten (genomescapes) kan op het genoom worden weergegeven, omdat de in vitro binding intensiteiten zijn recht evenredig met associatie constanten (K a). 34,35,37 Deze genomescapes geven inzicht in polyamide bezettingsgraad over het genoom, maar het meten van polyamide verbindend in levende cellen is een uitdaging. DNA stevig verpakt in de kern, die de toegankelijkheid van bindingsplaatsen kunnen beïnvloeden. De eenccessibility van deze chromatinized DNA sequenties polyamiden blijft een mysterie. Onlangs zijn veel methoden om wisselwerkingen tussen kleine moleculen en nucleïnezuren ontstaan ​​bestuderen. 40-48 De chemische affiniteitsinvangmiddel en massaal parallelle DNA-sequencing (chem-seq) is een dergelijke techniek. Chem-seq gebruikt formaldehyde tot kleine moleculen verknopen een genomische doelwit van belang en een gebiotinyleerd derivaat van een klein molecuul van belang zijn voor de ligand-target interactie vangen. 48,49 Formaldehyde verknoping leidt tot indirect interacties die valse positieven produceren. 50 We ontwikkelden een nieuwe methode, de verknoping van kleine moleculen aan chromatine (COSMIC), 51 isoleren met een fotocrosslinker aan deze zogenaamde &quot;fantoom&quot; pieken elimineren. 50 te beginnen, We ontworpen en gesynthetiseerd trifunctionele derivaten van polyamiden. Deze moleculen bevatten een DNA-bindend polyamide een fotocrosslinker (psoraleen) en affiniteit handvat (biotine, figuur 1). Met trifunctionele polyamiden, kunnen we covalent vastleggen polyamide-DNA interacties met 365 nm UV-straling een golflengte die geen DNA wordt beschadigd of induceert zonder psoraleen-gebaseerde verknoping. 51 Vervolgens fragmenteren we het genoom en zuivert de gevangen DNA onder stringente, semi -denaturing voorwaarden DNA dat niet-covalent gebonden verlagen. Zo zien we COSMIC als een methode soortgelijk aan chem-seq, maar met een meer directe uitlezing van DNA richten. Belangrijk is dat de zwakke (Ka -10 10 3 4 M -1) affiniteit van psoraleen voor DNA niet detecteerbaar effect polyamide specificiteit. 51,52 de verrijkte DNA-fragmenten kan worden geanalyseerd met ofwel een kwantitatieve polymerasekettingreactie 51 (COSMIC-qPCR) of door het next-generation sequencing 53 (COSMIC-volgende). Deze gegevens maken een onpartijdige, genoom-geleide ontwerp van liganden die interhandelen met hun gewenste genomische loci en off-target effecten te minimaliseren. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> Figuur 1. Bioactieve polyamiden en kosmische plan. (A) Hairpin polyamiden 1-2 doelwit van de DNA-sequentie 5&#39;-WACGTW-3 &#39;. Lineaire polyamiden 3 - 4 doel 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &#39;. Ringen van N-methylimidazool worden vet weergegeven voor de duidelijkheid. Open en gevulde cirkels vertegenwoordigen -methylpyrrole N en N -methylimidazole resp. Rechthoek stelt 3-chloorthiofeen en ruiten staan ​​β-alanine. Psoralen en biotine worden aangeduid met P en B, respectievelijk. (B) kosmische plan. Cellen worden behandeld met trifunctionele afgeleiden van polyamiden. Na verknoping met 365 nm UV- bestraling cellen lysed en genomische DNA wordt geschoren. Met streptavidine beklede magnetische parels worden toegevoegd aan polyamide-DNA adducten vangen. Het DNA wordt vrijgegeven en kan worden geanalyseerd door kwantitatieve PCR (qPCR) of next-generation sequencing (NGS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>Andere bronnen kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>We hebben andere fabrikanten van DNA-kolommen met succes geprobeerd.</td></tr><tr><td>TruSeq ChIP Sample Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>IP-202-1012</td><td>Deze Kit kan worden gebruikt om COSMIC DNA voor next-generation sequencing voor te bereiden</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Wordt gebruikt om platen te coaten om H1 ESCs te laten groeien</td></tr><tr><td>pH papier</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>beren microcentrifugebuisjes</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifugebuisjes</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pyrex filter</td><td>elke bron</td><td></td><td>Pyrex bakvormen zijn geschikt</td></tr><tr><td>qPCR master mix</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl (6 N)</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-cm weefselkweekschalen</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetten</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettips</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-ml conische buisjes</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nutator</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetische scheidingsstandaard</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-bron</td><td>CalSun</td><td>B001BH0A1A</td><td>Andere UV-bronnen kunnen worden gebruikt, maar de crosslinkingtijd moet empirisch worden geoptimaliseerd</td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>S4000 met 431C1 cup horn</td><td>Andere sonicators kunnen worden gebruikt, maar de sonicatiecondities moeten empirisch worden geoptimaliseerd</td></tr><tr><td>Bevochtigde CO2 incubator</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biologische veiligheidskast met vacuümuitlaat</td><td>elke bron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

genoombrede kartering van drug-dna interacties in cellen met kosmische (crosslinking van kleine moleculen te isoleren chromatine)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Het genoom is het doelwit van een aantal van de meest effectieve chemotherapeutica, maar de meeste van deze geneesmiddelen missen DNA-sequentie specificiteit, wat leidt tot dosisbeperkende toxiciteit en vele bijwerkingen. Gericht op het genoom met sequentie-specifieke kleine moleculen kan moleculen met verhoogde therapeutische index en minder off-target effecten mogelijk. -methylpyrrole N / N -methylimidazole polyamiden moleculen die rationeel kunnen worden ontworpen om specifieke DNA-sequenties met uitstekende precisie richten. En in tegenstelling tot de meeste natuurlijke transcriptiefactoren, kunnen polyamiden binden aan gemethyleerd en chromatinized DNA zonder een verlies in affiniteit. De sequentie specificiteit van polyamiden is uitgebreid bestudeerd in vitro cognate locatie identificatie (CSI) en traditionele biochemische en biofysische benaderingen, maar de studie van polyamide binden aan genomisch doelen in cellen blijft ongrijpbaar. Hier beschrijven we een werkwijze het verknopen van kleine moleculen Isolate chromatine (COSMIC), dat identificeert polyamide bindende locaties in het genoom. COSMIC is vergelijkbaar met chromatine immunoprecipitatie (ChIP), maar verschilt op twee belangrijke manieren: (1) een fotocrosslinker wordt toegepast om selectief, temporeel-gestuurde opname van polyamide bindingsgebeurtenissen, en (2) het biotine affiniteit handvat wordt gebruikt om polyamide te zuiveren inschakelen -DNA conjugaten onder semi-denaturerende omstandigheden aan DNA dat niet-covalent gebonden verlagen. COSMIC is een algemene strategie die kan worden gebruikt om genoom-brede bindingsgebeurtenissen polyamiden en andere genoom-gerichte chemotherapeutische middelen te onthullen.

Ter compensatie van niet-uniforme genoom fragmentatie en andere variabelen, moet het gezuiverde DNA altijd genormaliseerd tegen een referentie van input-DNA. Primers specifiek voor een locus van belang kunnen worden gebruikt. Het is nuttig om ook te analyseren een locus waarbij het molecuul niet verwacht binden, als negatieve controle. We zien een&gt; 100-voudige toename van polyamide bezettingsgraad bij bestraling met 365-nm licht (Figuur 2). Verrijkte DNA kan ook worden ge...

Het identificeren van de directe doelstellingen van genoom-gerichte moleculen blijft een grote uitdaging. Om te begrijpen hoe DNA-bindende moleculen die aangrijpen op de genoom, ontwikkelden we een methode die is gebaseerd op de verknoping van kleine moleculen aan chromatine isoleren (COSMIC).

Genoombrede kartering van Drug-DNA interacties in cellen met kosmische (Crosslinking van kleine moleculen te isoleren chromatine)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Het algemene doel van deze procedure is het bepalen van de genoombrede bindingsprofielen van polyamiden en andere op DNA gerichte kleine moleculen in cellen. Deze methode kan bijdragen aan de vooruitgang in het vakgebied van de DNA-medicijnchemie door het genoom te gebruiken als leidraad voor het ontwerp van DNA-targeterende moleculen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat directe liganden-DNA-interacties worden gemeten om inzicht te verschaffen in het werkingsmechanisme van liganden die op het genoom inwerken.Een aantal van de meest succesvolle therapeutische middelen zijn kleine moleculen die aan DNA binden en genomische transacties verstoren. Hoewel deze methode is ontwikkeld om polyamiden te bestuderen, kan deze ook worden toegepast op andere klassen DNA-doelmoleculen. De cellen voor dit experiment worden gekweekt in E8 Medium op 10 cm schalen, met een oppervlaktecoating die pluripotente stamcellen ondersteunt bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% koolstofdioxide.Verwijder vóór het toevoegen van het polyamide het gebruikte kweekmedium en voeg 8 ml vers medium per schaal van 10 cm toe. Bescherm de cellen vanaf dit punt tegen licht om voortijdige fotocrosslinking te voorkomen. Voeg met een pipet het polyamide rechtstreeks toe aan het kweekmedium van elke schaal.Wals de schaal om het polyamide gelijkmatig over het medium te verspreiden. Incubeer de cellen 24 uur lang bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer van 5% carbon dioxide en zorg dat ze worden beschermd tegen licht. Was de volgende dag elke 10 cm schaal met 4 ml PBS met behulp van een serologische pipette en een pipetdispenser.Zuig de PBS af en voeg 3 ml E8-kweekmedium toe. Plaats de cellen bij gedimd licht op een vlak oppervlak buiten de zuurkast en verwijder de deksels van de vijf kweekschaaltjes. Plaats een glasfilter over de vijf kweekschaaltjes om licht met een golflengte van minder dan 300 nanometer weg te filteren.Plaats de UV-bron bovenop het filter. Crosslink de monsters gedurende 30 minuten met 365 nanometer UVA-straling. Breng de cultuurschaaltjes na de UVA-straling terug naar de zuurkast.Zuig het medium af met een pasteurpipet die is aangesloten op een vacuümfles en was elke 10 cm schaal met 4 ml PBS. Zuig de PBS af en voeg 3 ml enzym voor celdissociatie per 10 cm schaal toe. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Stop de enzymatische reactie met 3 ml E8 Media per schaal. Breng de gedissocieerde cellen over naar één 15 ml conische buis. Plaats de cellen vanaf dit punt op ijs.Centrifugeer de gedissocieerde cellen bij 500 x g en 4 graden Celsius gedurende vijf minuten. Aspireer het supernatant om het enzym en het medium te verwijderen. Bereid ter voorbereiding op de procedure voor chromatine-isolatie de cosmic-buffer met verse protease-remmers.Voeg telkens 12,1 µL van 100 mM PMSF, 100 mM benzamidine en 150 µM pepstatine protease-remmers vers toe aan de basale cosmic buffer. Voeg 1,2 ml van de cosmic buffer toe aan het celpellet en pipetteer dit meerdere keren op en neer om het opnieuw te suspenderen. Verdeel de celoplossing vervolgens over twee amberkleurige microcentrifugebuisjes van 1,7 ml.Sonicate met een sonicator om het genoom te fragmenteren tot groottes tussen de 100 en 500 basenparen. Houd het niveau van de chromatine-oplossing in de microcentrifugebuis parallel aan het waterniveau in het reservoir. Bevestig dit niveau door middel van visuele inspectie.De sonicatietijd is empirisch geoptimaliseerd; soniceer op 60% vermogen, 10 seconden aan en 10 seconden uit gedurende 35 minuten. Gebruik een minimale hoeveelheid ijs in het reservoir om de monsters te koelen en zorg ervoor dat het ijs de verbinding tussen de monsters en de cup-horn niet hindert. Wanneer de sonicatie is voltooid, centrifugeer het monster bij 12 000 g gedurende 10 minuten.Bewaar de waterige oplossing die het oplosbare chromatine bevat door deze over te brengen naar een nieuwe amberkleurige microcentrifugebuis. Verwijder het pellet. Breng 110 µL of 10% van het monster over naar een nieuwe microcentrifugebuis.Label dit als 'input DNA' en bewaar het bij 80 graden Celsius. Bewaar de rest van het chromatine-monster op ijs voor gebruik in de volgende stappen van dit protocol. Om ligand-DNA-crosslinks te vangen, voegt u het resterende chromatine-monster toe aan de streptavidine-gecoate magnetische beads en resuspendeert u het mengsel.Incubeer het chromatine met de beads gedurende ten minste vier uur op een roterende schudmixer bij 4 °C. De benodigde wasbuffer moet worden bereid in gedestilleerd gedeïoniseerd water en voor gebruik worden gefilterd met een 0,2 µm filter. Buffer 1 en 2 kunnen enkele maanden worden bewaard bij 4 °C, maar Buffer 3 moet dagelijks vers worden bereid.Wanneer de incubatie van het chromatine met de streptavidine-gecoate magnetische beads is voltooid, wordt het monster zeven minuten gewassen met wasbuffer 1. Plaats het monster in een magnetisch scheidingsrek om de beads op te vangen en verwijder wasbuffer 1. Voeg wasbuffer 2 toe en was gedurende nog eens 7 minuten.Was vervolgens twee keer met wasbuffer 3 gedurende zeven minuten per wasbeurt. Was tot slot twee keer met TE-buffer. Resuspendeer de beads na de laatste wasbeurt met TE-buffer in 200 µL TE-buffer.Dit monster van gevangen DNA wordt aangeduid als affiniteitsgezuiverd of AP-DNA. Voeg vervolgens 10x cross-link reversal buffer toe aan het input-DNA en het AP-DNA tot een eindconcentratie van 1x. Incubeer gedurende 30 minuten bij 90 °C.Plaats de microcentrifugebuis met het AP-DNA gedurende twee minuten bij kamertemperatuur in het magnetische scheidingsrek en breng vervolgens de vloeistof met het AP-DNA over naar een nieuwe amberkleurige microcentrifugebuis. Voeg, na het neutraliseren van het Input- en AP-DNA, RNase A toe aan beide DNA-monsters tot een eindconcentratie van 0,2 µg/µL. Incubeer gedurende één uur bij 37 °C.Voeg na één uur Proteinase K toe aan zowel het Input DNA als het AP DNA tot een eindconcentratie van 0,2 µg/µL. Incubeer gedurende één uur bij 55 °C. Vervolgens worden het Input- en AP-DNA gezuiverd met een DNA-kolom reinigingskit en geëlueerd in DNA-grade water.Bewaar het DNA bij 20 of 80 graden Celsius tot het klaar is voor analyse. Het affiniteitgezuiverde DNA moet altijd worden genormaliseerd ten opzichte van een referentie van Input DNA. Representatieve resultaten van kwantitatieve PCR met locus-specifieke primers tonen een meer dan 100-voudige toename in polyamidebezetting na bestraling met 365 nanometer licht.Verrijkt DNA kan ook worden geanalyseerd via next generation sequencing. Zodra de sequencing is voltooid, worden de ruwe DNA-reads uitgelijnd met het genoom en worden dichtheidssporen (density tracks) opgesteld. Dit voorbeeld toont het dichtheidsspoor voor Lineaire Polyamide 4, ontworpen om AAG-herhalingen te targeten.Een analyse van polyamideverdelingen in cellen onthulde dat geclusterde bindingsplaatsen met een breed scala aan affiniteiten de bezettingsgraad in cellen het beste voorspellen. Er werd een algoritme ontwikkeld om het gehele genoom te scoren op binding met behulp van in vitro data voor de identificatie van cognate sites. Deze vioolplots tonen de voorspelde scores voor de binding van Polyamide 2 en Polyamide 4 over het gehele genoom.Representatieve genomescapes voor Polyamide 4 worden ook getoond. Deze scoringsmethode onthulde dat loci met meerdere sequenties met lage en gemiddelde affiniteit een vergelijkbare polyamidebezetting vertonen als loci met weinig sequenties met een hoge affiniteit. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in twee dagen worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de monsters tegen licht beschermd moeten worden totdat het DNA is gezuiverd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals RT-PCR en RNase C, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het effect van binding op de genexpressie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe cosmic kan worden gebruikt om genoombrede bindingsprofielen van polyamiden in kaart te brengen.

genome-wide-mapping-drug-dna-interactions-cells-with-cosmic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De Hi-C methode maakt het mogelijk onpartijdige, genoom-brede identificatie van chromatine interacties (1). Hi-C paren nabijheid ligatie en massaal parallelle sequencing. De resulterende gegevens kunnen worden gebruikt om de genomische architectuur studeren op meerdere schalen: eerste resultaten geïdentificeerd functies zoals chromosoom gebieden, scheiding van open en gesloten chromatine, en chromatine structuur op de megabase schaal.

Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.

De bijbehorende chromosoom val (ACT) assay is een nieuwe onpartijdige methode voor het identificeren van lange-afstands-DNA interacties. De karakterisering van de lange reeks DNA-interacties zal ons toelaten om de relatie van de nucleaire architectuur vast te stellen om genexpressie in zowel de normale fysiologie en in zieke staten.

Associated Chromosoom Trap voor het vaststellen van lange afstand DNA-interacties

We beschrijven hierin een test door het koppelen van DNA adenine methyltransferase identificatie (damid) tot high throughput sequencing (damid-volgende). Deze verbeterde werkwijze een hogere resolutie en een groter dynamisch bereik en maakt analyse damid-seq data in combinatie met andere high throughput sequentiebepaling gegevens zoals ChIP-seq, RNA-seq, etc.

Damid-seq: Genoom-brede kaart brengen van eiwit-DNA-interacties door High Throughput Sequencing van adenine gemethyleerd DNA-fragmenten

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

We presenteren een protocol voor het identificeren van functionele implicaties van niet-Codeer varianten geïdentificeerd door genoom-brede associatie studies (GWAS) met behulp van driedimensionale chromatine interacties.

In kaart brengen van de ziekte van Alzheimer varianten op hun doel genen met behulp van computationele analyse van Chromatin configuratie

Nauwkeurige bepaling van eiwitbindende locaties in het genoom is belangrijk voor het begrijpen van genregulatie. Hier beschrijven we een genomische mapping methode die chromatine-immunogeprecipiteerd DNA behandelt met exonucleasevertering (ChIP-exo) gevolgd door sequencing met hoge doorvoer. Deze methode detecteert eiwit-DNA interacties met near base-pair mapping resolutie en hoge signaal-ruisverhouding bij zoogdierneuronen.

Hoge resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muis stamcel-afgeleide neuronen met behulp van chromatine immunoprecipitation-exonuclease (ChIP-Exo)

Hi-C 3.0 is een verbeterd Hi-C protocol dat formaldehyde en disuccinimidylglutaraat crosslinkers combineert met een cocktail van DpnII en DdeI restrictie enzymen om de signaal-ruisverhouding en de resolutie van chromatine interactie detectie te verhogen.

Chromosoomconformatie vastleggen over lengteschalen

Een protocol voor het in kaart brengen van de driedimensionale genoomorganisatie met nucleosoomresolutie met behulp van de genoomwijde chromosoomconformatie-capture-methode Micro-C-XL wordt hier gepresenteerd.

3D-genoominteracties van zoogdieren in kaart brengen met Micro-C-XL

We presenteren een snelle en efficiënte methode om veel voorkomende fragiele breuken te detecteren door middel van natieve γH2A.X chromatine immunoprecipitatie (ChIP). Deze aanpak vermindert aanzienlijk zowel de tijd als de arbeid die gepaard gaan met traditionele γH2A.X ChIP-assays, terwijl de hoge reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de resultaten behouden blijven.

Het vastleggen van veelvoorkomende fragiele site-onderbrekingen door native γH2A. X Kanaal

Leer de COSMIC-methode om genoombrede bindingsprofielen van DNA-gerichte kleine moleculen te bepalen. Deze techniek meet directe ligand-DNA-interacties en biedt inzicht in werkingsmechanismen voor therapeutische ontwikkeling.

Genoombrede kartering van Drug-DNA interacties in cellen met kosmische (Crosslinking van kleine moleculen te isoleren chromatine) (Video) | JoVE Journal

Genoombrede kartering van Drug-DNA interacties in cellen met kosmische (Crosslinking van kleine moleculen te isoleren chromatine)

Meer video's verkennen