Name: Een strategie om de rol van callose gemedieerde Plasmodesmal Poortsignalen in de Tropic Response valideren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Leer een methode om genen te screenen die callose-gemedieerde plasmodesmale gating reguleren tijdens tropische reacties in Arabidopsis thaliana. Deze techniek helpt onderzoekers bij het begrijpen van cel-tot-cel signalering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door de National Research Foundation Korea (NRF-2015R1A2A1A10053576), en door een subsidie ​​van de Next-Generation BioGreen 21 Program (SSAC verlenen PJ01137901), plattelandsontwikkeling Administration, de Republiek Korea. RK, WS, ABB en DK werden ondersteund door Brain Korea 21 Plus-programma (BK21 +).

1. Screening van mutanten met veranderde fototropische en gravitropic Responses <ol><li> Bereid 1x Murashige en Skoog (MS) Medium, pH 5,7, met 0,8% Agar Een dag voor het experiment. <ol><li> Voeg 800 ml dubbel gedestilleerd water om een ​​2 L erlenmeyer en roer met een magneetstaaf. </li><li> Voeg 4,4 g MS zout in de conische kolf. </li><li> Voeg 0,5 g 2- (N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) en roer totdat al het zout is opgelost. </li><li> De pH van het medium op 5,7 met 1 M KOH. </li><li> Breng het medium tot een massa cilinder en breng uiteindelijke volume tot 1 L met DDH 2 O. </li><li> Giet terug het medium in een 2 L erlenmeyer en voeg 8 g van plantaardige agar. </li><li> Wikkel de mond van de kolf goed af met aluminiumfolie. </li><li> Autoclaaf het MS medium en DDH 2 O 15 minuten bij 121 ° C, 15 psi en na autoclaveren, houdt het medium in een 60 ° C incubator en DDH 2 O bij KT. </li><li> Na afkoelen tot 60 ° C, giet het medium in 125 x 125 x 20 mm 3 vierkante platen op een laminaire stroming bank (50 ml per plaat). </li><li> Laat de agar gestold bij kamertemperatuur gedurende 1 uur door het houden van de platen gedeeltelijk open. Indien de platen niet direct worden gebruikt, verzegelen met plastic folie en bewaar bij 4 ° C in een koelkast. </li></ol></li><li> Oppervlakte-steriliseren van de zaden met 1,1% natriumhypochloriet en de puntjes op de zaden op 1x MS agarplaten die werden opgesteld in paragraaf 1.1. Opmerking: Hier, Arabidopsis thaliana {Col-0 seeds, dsGSL8 (Col-0)} 15 worden gebruikt voor tropische respons, callose kleuring en HPTS laden Arabidopsis thaliana {Col-0 en dsGSL8 (Col-0) EMS mutant} zaden (. ongepubliceerd) worden gebruikt voor tropische respons in figuur 2. <ol><li> Autoclaaf 300 ml van DDH 2 O in een fles. </li><li> Voeg ongeveer honderd zaden per achtergrond, dwzmutant / overexpressie lijn en wild type (Col-0) zaden, om een 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Neem 1x MS agarplaten van een 4 ° C koelkast en droog ze op een laminaire stroming bankje in een gedeeltelijk open positie. </li><li> Oppervlakte-steriliseren van de zaden door toevoeging van 1 ml van een 0,2 x bleekwater oplossing (1,1% natriumhypochloriet) en houd de microcentrifugebuizen op schudinrichting bij 250 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Laat de zaden naar de bodem door de zwaartekracht en verwijder het bleekmiddel oplossing van micropipet. </li><li> Voeg 1 ml vers DDH 2 O (geautoclaveerd) om de zaden en goed meng door de microcentrifugebuis meerdere malen. Laat de zaden weer af te wikkelen en verwijder het water. </li><li> Herhaal stap 1.2.6 5-6 keer. </li><li> Voeg dubbele hoeveelheid water om het volume van de zaden die bleven na de laatste wasbehandeling. </li><li> Dot de gesteriliseerde zaden op een semi-gedroogde 1x MS agar plaat met behulp van een 1 ml micropipet tip die 200 ul van zaden (inclusief water). <ol><li> Houd ongeveer 0,1 cm afstand tussen twee zaden en minimaal 1,8 cm tussen twee rijen zaden. Puntjes op de zaden in vijf horizontale rijen per vierkante plaat (125 x 125 x 20 mm 3). Laat het water iets te drogen voordat u het deksel op de plaat. </li></ol></li><li> Dicht de platen met chirurgische tape, stapelen alle van de platen verticaal, en wikkel met aluminiumfolie. </li><li> Breng de verpakte platen naar een donkere doos (die geen toegang hebben tot licht). Blijf dan de donkere doos in een 4 ° C kamer / koelkast voor 3 dagen. </li><li> Vanaf deze stap gaat richting platen ongewijzigd. Na 3 dagen koudebehandeling, houden de donkere box aan een installatie kweekkamer bij 22 ° C gedurende de volgende 3 dagen. Na 3 dagen, controleer dan de kieming status van de zaden onder groen licht in een donkere kamer. LET OP: Meestal 3 dagen oude Col-0 geëtioleerde zaailingen kunnen groeien tot 1,6 cm in lengte. </li></ol></li><li> Analyseer de veranderde phototropic eennd gravitropic respons in mutanten of overexpressie lijnen van een specifiek gen. Selecteer alleen vergelijkbare grootte en verticaal gegroeid recht zaailingen onder groen licht in een donkere kamer. Transfer geselecteerd zaailingen vers 1x MS agarplaat met de punt van een steriele tandenstoker. <ol><li> de zaailingen van het laagste deel van de hypocotyl selecteren zacht zonder andere onderdelen aanraakt. Zorg ervoor dat alle van de zaailingen hebben dezelfde zaadlob / hook oriëntatie, en na het overbrengen, dat de oriëntatie van de zaailing haken blijven hetzelfde. Gebruik ten minste 20 zaailingen per achtergrond in elke rij en ten minste twee platen voor elk tijdstip voor verdere analyse. Opmerking: Vier verschillende achtergronden kunnen worden vergeleken in elke plaat (4 rijen). Optioneel: Tijdens het gebruik van dexamethason (Dex) induceerbare RNAi / overexpressie lijnen, de overdracht van de hierboven zaailingen een 1x MS plaat samen met de + dex MS plaat (plaat met 1x MS, 0,8% agar medium, aangevuld met 20 uM dex) for 3 uur en houden de platen verticaal in donkere doos. </li><li> Om phototropic reactie te controleren, de overdracht van de bovenstaande borden verticaal om een ​​zwarte doos met slechts één kant geopend. Breng de zwarte doos met platen om een ​​plantengroei kamer met een unilaterale wit licht. Eenzijdige licht te garanderen, plaatst u de rand van de plaat in de richting van de lichtbron (niet de voorkant). Raadpleeg de opstelling in figuur 1. </li><li> Ook de gravitropic reactie te controleren, houden de platen met overgedragen zaailingen verticale, en dek af met aluminiumfolie. Vervolgens verandert de plaat oriëntatie verticaal tot 90 ° en hou het binnen de zwarte doos bedekt van alle kanten. Raadpleeg de opstelling in figuur 1. </li><li> Na de gegeven tijd punten (meestal 1,5 uur, 3 uur, 6 uur en 12 uur) het scannen van de platen met een scanner, en sla de foto&#39;s in JPEG-formaat. </li><li> Meet de buighoek van de zaailingen met behulp van ImageJ software (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Figure 2). <ol><li> Start het ImageJ programma door dubbel te klikken (Figuur 2A). Opmerking: De belangrijkste instrumenten die gebruikt werden in de hoekmeting worden getoond in figuur 2B. </li><li> Klik op de optie &quot;file&quot;, gevolgd door sub-optie &quot;open&quot; in de werkbalk ImageJ, open foto&#39;s zijn opgeslagen in JPEG-bestandsformaat naar de tropen buighoek (figuur 2C) te meten. </li><li> Klik op het vergrootglas instrument in of uit te zoomen op de foto door te klikken op de linker of rechter muisknop, respectievelijk zoals weergegeven in figuur 2B. </li><li> Klik op het scrollen gereedschap te slepen en de positie van de foto (figuur 2D) .Next, klikt u op de hoek instrument om de hoek van het buigen (figuur 2E) te meten. <ol><li> Maak een dubbele klik links op de originele hypocotyl groeirichting punt &#39;a&#39;, sleep de muis naar de buigende initiatie punt &#39;b&#39; (figuur 2F), en klik op de linker kontop de eerste lijn (figuur 2G) te trekken. </li><li> Sleep de muis vanaf punt b om het buigen eindpunt &#39;c&#39;, en klik op de linker knop om de tweede lijn (figuur 2H) tekenen en vormen een vast <img alt="hoek" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> A. Opmerking: De ware buigen hoek <img alt="hoek" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> B, die gelijk is aan 180 ° is - <img alt="hoek" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> A. (figuur 2F). </li><li> Meet en opnemen <img alt="hoek" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> Een door op &#39;M&#39; op het toetsenbord. Het resultaat bestand zal afzonderlijk te openen zoals weergegeven in figuur 2I. Meet en alle zaailingen, geregistreerd voor één. Bijvoorbeeld eerst meten van de buighoek van alle hypocotylen van Col-0 en vervolgens voor mutant lijnen. </li></ol></li></ol></li><li> Breng de dataset van ImageJ naar spreadsheet-bestand naar de av makendelde van buighoeken van elke achtergrond. </li><li> Voor kwantitatieve analyse maakt een staafdiagram diagram statistische testresultaten, waaronder standaard foutbalken en waarschijnlijkheidswaarden (zie figuur 2). <ol><li> Bereken de ware buigen <img alt="hoek" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> B, en het ontwerpen van een formule met behulp van spreadsheet, dat wil zeggen, <img alt="hoek" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> B = 180 ° - <img alt="hoek" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> Een briefje: <img alt="hoek" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> A is de waarde die was afgeleid van ImageJ analyse. </li><li> Meet de gemiddelde Buigingshoek <img alt="hoek" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> B voor elke achtergrond met behulp van spreadsheet gereedschappen (figuur 2J). </li><li> Analyseer de standaardafwijking tussen herhalingen voor elke meting met behulp van de spreadsheet &quot;formules&quot; tool (figuur 2J). </li><li> Test de sigkenis van de resultaten door een t-test om de gemiddelde buighoek en standaarddeviatiewaarden berekend zoals hierboven vermeld. </li><li> Teken een staafdiagram met behulp van de bovenstaande waarden grafisch vertegenwoordigen de kwantitatieve verschil in de buigende hoek tussen twee verschillende achtergronden met behulp van de spreadsheet &quot;insert&quot; tool (figuur 2K). Opmerking: Mutant / overexpressie lijnen van de sterke kandidaat-genen zouden duidelijke verschillen ten opzichte van wild type, zoals geen buigen tonen, snel buigen of langzaam buigen. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Screen Plant Lijnen met Defecte Tropic Responses gevolg van veranderingen in PD SEL met een veranderde PD callose Level <ol><li> Voer een hypocotyl Laden Assay met 8-hydroxypyreen-1,3,6-trisulfonzuur (HPTS) Dye laden op de top van Zaailingen met HPTS Agarose Blocks en vergelijk de Beweging van Dye Tussen Mutant / Over-expressie Lines en Col-0. <ol><li> Bereid HPTS Agarose blokken voor het laden hypocotyl assay. <ol><li> Neem 10 ml DDH 2 O in een 50 ml conische kolf en voeg 0,1 g agarose met een 1% agarose gel te bereiden. Kook de agarose in een magnetronoven gedurende 1-2 minuten met onderbroken schudden en laat het afkoelen 5 minuten. </li><li> Voeg 50 mg HPTS tot 10 ml van 1% agarose-oplossing en meng goed totdat de oplossing groen wordt. </li><li> Giet het bovengenoemde mengsel van een 10 mm petrischaal, en laat het stollen gedurende 15 minuten. </li><li> Snij de gestolde HPTS agarose met een scherp mes dissectie kleine agarose blokken (0,5 x 2 cm 2) te maken. </li></ol></li><li> Bereid plantaardige monsters voor de HPTS dye-loading assay. <ol><li> Stel een platform voor de HPTS dye laden assay; Plaats een microscoop dekglaasje (24 x 50 mm 2) op een nieuwe MS-medium plaat zoals getoond in figuur 3A. </li><li> Accijnzen 3 dagen oude geëtioleerde zaailingen van de basis van de haak met een scherp chirurgische schaar. </li><li> Per directBreng de hierboven zaailingen (minimaal 5 zaailingen van elke achtergrond) aan het oppervlak van een microscopisch dekglas zodanig dat slechts 0,5 cm van hypocotyl van de excisie positie dekglaasje moet blijven, en de rest van de hypocotyl zou aanraken het medium zoals getoond in figuur 3B. </li><li> Plaats de HPTS agarose blok boven de hypocotyl (met een uitgesneden haak) gedurende 5 min op een zodanige wijze dat het uitgesneden gebied aanraakt HPTS agarose blok. </li><li> Na 5 minuten van het laden, verwijder de agarose blok van de hypocotyl oppervlak, de overdracht van de hypocotylen aan de 10 mm petrischaal met DDH 2 O en was hypocotylen in DDH 2 O gedurende 15 minuten onder voortdurend schudden. </li></ol></li><li> Bereid Monsters voor confocale microscopie. <ol><li> Selecteer minimaal 5 zaailingen van elke achtergrond voor observatie onder de confocale laser scanning microscoop. </li><li> In de laser-kanaal, stel de golflengte van 488 nm voor specifieke excitation en 500-550 nm voor band-pass-emissie. </li><li> Overdracht zaailingen in 2 sets (een Col-0 + één mutant) in nieuw microscopisch preparaat na wassen met DDH 2 O. Voeg 100-150 ul van dubbel gedestilleerd water aan de dia, en dek af met een deksel glijbaan. Schuif de schuif naar de fase van de confocale microscoop. </li><li> Focus de hypocotyl regio (met een 20x of 40x objectief) met behulp van bright-veld (wit licht) verlichting. Vervolgens scant de dia&#39;s voor fluorescentie. </li><li> Maak opnamen gedurende minimaal 10 sets, en de twee achtergronden vergelijken door eerst de mate van kleurstof vanop het laadpunt. Opmerking: Mutant / overexpressie lijnen met gewijzigde symplasmic beweging verschillende patronen kleurstof laden in vergelijking met wildtype Col-0 tonen. </li></ol></li></ol></li><li> Analyseer de callose Level in Mutant / Over-expressie lijnen die Altered fototropische en gravitropic Response en Resultaat Distinct HPTS Dye Movement Compared Col-0. <ol><li> Bereid aniline blauw callose kleuring kleurstof. <ol><li> Voeg 1 M glycine, pH 9,5 en 0,1% (W / V) aniline blauw geautoclaveerd DDH 2 O. </li><li> Maak de vlekken buffer door het mengen van 0,1% aniline blauw en 1 M glycine in 2: 3 volume ratio&#39;s. Bijvoorbeeld, voor 50 ml vlekken buffer, neem 20 ml 0,1% aniline blauw en 30 ml 1 M glycine. Let op: Maak de vlekken buffer minimaal 48 uur voorafgaand aan het gebruik en op te slaan in het donker. </li></ol></li><li> Stain gebogen of niet-gebogen zaailingen met callose-specifieke aniline blauwe kleurstof. <ol><li> De de novo synthese callose blokkering tijdens het kleurproces, voeg het eindvolume van 1,5 mM 2-deoxy-D-glucose (DDG) tot 50 ml vlekken buffer. </li><li> Neem 3 dagen oude geëtioleerde zaailingen voor callose kleuring (met of zonder tropische respons). </li><li> Snijd de zaailingen uit de haak regio met behulp van dunne chirurgische schaar. </li><li> Overdracht van de zaailingen in een kleine petrischaal bevattening 2 ml vlekken buffer met de punt van een tandenstoker. </li><li> Incubeer de zaailingen met kleurbuffer in het donker gedurende 2 uur onder voortdurend schudden bij 30 rpm. </li><li> Na het kleuren, was de zaailingen met DDH 2 O 2 min om het overtollige vlekken buffer te verwijderen. </li><li> Selecteer minste 5 zaailingen elke plant achtergrond voor observatie onder de confocale laser scanning microscoop. </li></ol></li><li> Bereiden monsters voor confocale microscopie: <ol><li> Breng de zaailingen in set (één Col-0 + een mutant) aan de microscoop schoon dia&#39;s na het wassen met DDH 2 O. </li><li> Voeg 100-150 ul van DDH 2 O en dek af met een deksel glijbaan. Schuif de schuif naar de fase van de confocale microscoop. </li><li> In een laser kanaal ingesteld als golflengte 405 nm specifieke excitatie en 500-550 nm emissie voor de beeldvorming van aniline blauwe fluorescentie. </li><li> Breng de hypocotyl regio in beeld, eerst met 10X en later met 20X of 40X objectief lenzen met behulp van bright-veld (wit licht) verlichting. </li><li> Schakel dan over gefilterd licht, scan de dia&#39;s voor fluorescentie, en sla de afbeeldingen. </li><li> Meet de callose signaalintensiteit met ImageJ software (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (zie figuur 4). <ol><li> Verander het formaat van confocale microscopie foto&#39;s van Olympus Image Binary-formaat (* .oib) naar JPEG-bestandsformaat. Opmerking: Alleen JPEG-formaat wordt ondersteund door ImageJ software. </li><li> Start het ImageJ programma door dubbel te klikken (Figuur 4A). Opmerking: Pijlen geven de rechthoek gereedschap voor gebruik in de callose intensiteitsmeting (figuur 4B). </li><li> Klik op de optie &quot;file&quot;, gevolgd door de sub-optie &quot;open&quot; in de werkbalk ImageJ, open microscopie foto&#39;s die in JPEG-formaat zijn opgeslagen op de callose intensiteit (Figuur 4C) te meten. </li><li> Klik op het rechthoekige symbool op de ImaGej werkbalk (figuur 4D). </li><li> Om de intensiteit van het signaal te analyseren, sleep de cursor over het beeld en selecteer het gebied te onderzoeken (Figuur 4E) </li><li> Meet en de numerieke waarden voor de intensiteit van het signaal opnemen door op &#39;M&#39; op het toetsenbord (Figuur 4E). Opmerking: Het resultaat bestand wordt afzonderlijk (Figuur 4F) te openen. </li><li> Meet en noteer de intensiteit waarden één voor één voor elk van de zaailingen van elke plant achtergrond. Opmerking: In ImageJ, het resultaat bestand &quot;Mean&quot; geeft het signaal intensiteit van de geselecteerde &quot;Area&quot;. </li></ol></li><li> Kopieer de gemiddelde waarden van de ImageJ resultaat bestand, en plakken in spreadsheet-bestand voor de kwantitatieve analyse. </li><li> Voor kwantitatieve analyse maakt een staafdiagram diagram met statistische tests, waaronder standaard foutbalken en waarschijnlijkheidswaarden (figuur 4). <ol><li> Meet de gemiddelde signaalintensiteit(gemiddelde van ImageJ) voor elke achtergrond met behulp van de spreadsheet &quot;formules&quot; tool (figuur 4G). </li><li> Analyseer de standaardafwijking tussen herhalingen voor elke meting met behulp van de spreadsheet &quot;formules&quot; tool (figuur 4G). </li><li> Bereken de standaardfout (SE) met behulp van thespreadsheet &quot;formules&quot; tool. Opmerking: SE = s / √ n, waarbij (s) is de standaarddeviatie van de populatie, en (n) is de grootte (aantal waarnemingen) van het monster. </li><li> Test de significantie van de resultaten door een t-test om de gemiddelde signaalintensiteit en standaardfouten berekend zoals hierboven vermeld. </li><li> Teken een staafdiagram diagram met behulp van de bovenstaande waarden grafisch vertegenwoordigen de kwantitatieve verschil in callose niveau tussen twee verschillende achtergronden met behulp van de spreadsheet &quot;insert&quot; tool (figuur 4H). Opmerking: Mutant / overexpressie lijnen van sterke kandidaten shoe verschillende niveaus van callose in vergelijking met wild-type, zoals geen callose, weinig callose of hyper PD callose accumulatie. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Went, F. W., Thimann, K. V., et al. Phytohormones. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWent%2C+FW+%22Experimental+biology+monographs%22">Experimental biology monographs</a>. Bard, P., et al. , The Macmillan Company. New York. 204(1937).</li>
<li>Bennett, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+AUX1+gene%3A+a+permease-like+regulator+of+root+gravitropism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism.</a> Science. 273 (5277), 948-950 (1996).</li>
<li>Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+auxin+response+by+the+protein+kinase+PINOID%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID.</a> Cell. 100 (4), 469-478 (2000).</li>
<li>Jurgens, G., Geldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high+road+and+the+low+road%3A+trafficking+choices+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The high road and the low road: trafficking choices in plants.</a> Cell. 130 (6), 977-979 (2007).</li>
<li>Michniewicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+regulation+of+PIN+phosphorylation+by+PP2A+and+PINOID+directs+auxin+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux.</a> Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).</li>
<li>Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gravi-+and+phototropism+in+plant+mdr+mutants+mislocalizing+the+auxin+efflux+protein+PIN1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1.</a> Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).</li>
<li>Weijers, D., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snap+Shot%3A+auxin+signaling+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Snap Shot: auxin signaling and transport.</a> Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).</li>
<li>Wisniewska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+PIN+localization+directs+auxin+flow+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polar PIN localization directs auxin flow in plants.</a> Science. 312 (5775), 883(2006).</li>
<li>Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+purification%2C+and+molecular+cloning+of+N-1-naphthylphthalmic+acid-binding+plasma+membrane-associated+aminopeptidases+from+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).</li>
<li>Kleine-Vehn, J., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+targeting+and+endocytic+recycling+in+auxin-dependent+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).</li>
<li>Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. P., Nielsen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+auxin+transport+by+the+AUX1+influx+carrier+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-affinity auxin transport by the AUX1 influx carrier protein.</a> Curr. Biol. 16 (11), 1123-1127 (2006).</li>
<li>Geisler, M., Murphy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+of+auxin+transport%3A+the+role+of+p-glycoproteins+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development.</a> FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).</li>
<li>Band, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+gravitropism+is+regulated+by+a+transient+lateral+auxin+gradient+controlled+by+a+tipping+point+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.USA%22%5BJournal%5D)">Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).</li>
<li>Vanneste, S., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin%3A+a+trigger+for+change+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Auxin: a trigger for change in plant development.</a> Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin-callose-mediated+plasmodesmal+gating+is+essential+for+tropic+auxin+gradient+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling.</a> Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).</li>
<li>Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Players+at+plasmodesmal+nano-channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Players at plasmodesmal nano-channels.</a> J. Plant Biol. 58, 75-86 (2015).</li>
<li>Chen, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+callose+synthase+gene+GSL8+is+required+for+cytokinesis+and+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning.</a> Plant Physiol. 150, 105-113 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen mededelingen.

In dit manuscript, een strategie voor mutant / overexpressie lijnen die defect in phototropic en gravitropic reacties zijn vanwege veranderde PD callose en derhalve PD SEL wordt beschreven screenen. PD callose synthese en afbraak wordt vooral bereikt door callose synthases en β-1,3-glucanasen, maar regulering van deze enzymen wordt door vele factoren upstream. Om te zoeken naar een dergelijke upstream factoren of kandidaten die rechtstreeks betrokken zijn bij PD regelgeving, hebben we het opzetten van deze methode voor ...

Planten, sessiele levende organismen hebben een zeer geavanceerde netwerk van cel-cel signalering naar diverse omgevingsstimuli aanpakken ontwikkeld. Trope reacties zijn een van de verschijnselen waarbij planten reageren op prikkels uit de omgeving. Planten vertonen twee belangrijke tropische reacties phototropism en gravitropisme. Fotosynthetische planten buigen in de richting van de lichtbron door phototropism om maximale energie te oogsten. Evenzo gravitropisme maakt de planten groeien naar het zwaartepunt. De fundamentele mechanisme dat leidt tot zulke tropische reacties impliceert asymmetrische gradiënt vorming van het plantenhormoon auxine 1. De handeling van de lokale auxine gradient formatie goed gekarakteriseerd; de genen die betrokken zijn bij dit mechanisme te voorzien van een routekaart voor hormoon actie 2-8. De specifieke positie van auxine efflux dragers, zoals PIN-GEVORMD (PIN) en P-glycoproteïnen, voert de beweging van auxine van het cytoplasma naar de celwand van donorcellen 9,10. Furthermore, door de actieve H + / IAA symport activiteit van auxine instroom dragers, zoals AUX1 / LAX familie eiwitten, auxine is eindelijk geleverd aan de naastgelegen ontvanger cellen 2,11,12. Deze gerichte beweging van auxine is bekend als polaire auxine transport (PAT). PAT leidt tot een differentiële auxine verdeling tijdens verschillende ontwikkelingsstadia en in reactie op verschillende omgevingsstimuli 13,14. Bovendien, de verstoring van lokalisatie of expressie van een van deze auxine influx of efflux dragers leidt tot ernstige verandering in PAT, waarbij een verstoring van de auxine gradiënt oorzaken, wat leidt tot defecten in de ontwikkeling. Onlangs, Han et al. gemeld dat plasmodesmal verordening Ook moet de auxine gradiënt 15 handhaven. Tot op heden zijn meer dan 30 plasmodesmal eiwitten geïdentificeerd 16. Van deze eiwitten is AtGSL8 gemeld als een sleutelenzym voor callose klanksynthese plasmodesmata (PD) en daardoor een belangrijke rol speelt in maintaining de PD uitsluiting op grootte limiet (SEL). Onderdrukte AtGSL8 expressie resulteerde in een vervormd auxine gradiëntpatroon leidt tot geen tropische reactie in tegenstelling tot wild type zaailingen 15. In dit manuscript, methoden om nieuwe kandidaat-genen die betrokken zijn bij PD regelgeving zijn voorzien verkennen. AtGSL8 werd gebruikt als een modeleiwit deze methoden te testen, omdat het een sleutelenzym bijdraagt ​​aan callose biosynthese PD. Door de zaailing-dodelijkheid van gsl8 knock-out mutanten 17 werden dexamethason (Dex) induceerbare RNAi lijnen gebruikt volgens een eerder gepubliceerd rapport 15. De strategie die hier kan worden aangepast aan genen die zijn betrokken bij hypocotyl tropische reactie gecontroleerd door PD SEL screenen.

<table><tbody><tr><td>HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)</td><td>Sigma</td><td>H1529-1G</td><td>Fluorescente kleurstof als symplasmisch tracer</td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>Dongin-Genomic</td><td>GEL001-500G</td><td>Gebazig voor HPTS agaroseblok</td></tr><tr><td>Microgolfoven</td><td>LG-Goldstar</td><td></td><td>Apparaat voor het koken van agarosegel</td></tr><tr><td>100 ml glazen kegelkolf</td><td>Dong Kwang</td><td>A0205</td><td>Gebazig voor het koken van HPTS agarosegel</td></tr><tr><td>Petrischaal (35 mm x 10 mm)</td><td>SPL life sciences</td><td>SPL10035</td><td>Gebazig voor het maken van HPTS agaroseblokken en het wassen van plantmonsters</td></tr><tr><td>Microscoopdekselglazen en glasplaatjes (24 mm x 50 mm)</td><td>Marienfeld Laboratory Glassware</td><td>101222</td><td>Gebazig voor HPTS agaroseblokken en microscopische monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>MS medium platen 125 mm x 125 mm x 20 mm</td><td>SPL life sciences</td><td>SPL11125</td><td>Platen om MS agarmedium te maken</td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Germany Stainless</td><td>HSB 942-11</td><td>Gebazig om de haakregio van plantmonsters te exciseren</td></tr><tr><td>Murashige en Skoog (MS) basale zoutmix</td><td>Duchefa</td><td>P10453.01</td><td>MS medium inclusief vitaminen.</td></tr><tr><td>(N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) monohydraat</td><td>Bioshop</td><td>3G30212</td><td>Om MS media te maken.</td></tr><tr><td>Planten agar</td><td>Duchefa</td><td>P1001.1000</td><td>Om MS media te bevestigen.</td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td>ALP</td><td>CL-40L</td><td></td></tr><tr><td>Schudler</td><td>Wise Mix</td><td>SHO-1D</td><td>Om de anilineblauwe kleuringsbuffer en HPTS kleurstof rustig af te wassen.</td></tr><tr><td>1 ml Blauwe tips</td><td>Sorenson</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipet</td><td>BioPette</td><td>L-1101-2</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch tape</td><td>MIcropore</td><td>1530-0</td><td>Om de MS plaat te verzegelen</td></tr><tr><td>Aniline blauw (Methyl blauw)</td><td>Sigma</td><td>M5528-25G</td><td>Gebazig om aniline blauwe kleuringsbuffer voor te bereiden.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td>Gebazig om aniline blauwe kleuringsbuffer voor te bereiden.</td></tr><tr><td>DDG</td><td>Sigma</td><td>D8375-1G</td><td>Gebazig voor het remmen van callose synthases.</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE SIM</td><td>Om anilineblauwe kleuring en HPTS kleurstof ladingsresultaat te controleren.</td></tr><tr><td>Roerder</td><td>I lab</td><td>K400</td><td>Om mediaoplossing te mengen.</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>SW kookfolie</td><td></td><td>Om platen in donkere omstandigheden te wikkelen.</td></tr><tr><td>Natriumhypochloriet</td><td>Samjin Industry</td><td></td><td>Om zaden oppervlakkige gesteriliseerd te maken</td></tr></tbody></table>

een strategie om de rol van callose gemedieerde plasmodesmal poortsignalen in de tropic response valideren

A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response

Het plantenhormoon auxine speelt een belangrijke rol in veel groei en ontwikkelingsprocessen, waaronder tropische reacties op licht en zwaartekracht. De oprichting van een auxine gradiënt is een belangrijke gebeurtenis die leidt tot phototropism en gravitropisme. Voorheen polaire auxine transport (PAT) bleek een auxine gradiënt vestigen in verschillende cellulaire domeinen van planten. Echter, Han et al. Onlangs aangetoond dat juiste auxine gradiënt vorming plasmodesmal-gemedieerde callose symplasmic verbinding tussen aangrenzende cellen is ook een kritische factor. In dit manuscript, de strategie om de rol van bepaalde genen, die phototropism en gravitropisme kan beïnvloeden door het veranderen van symplasmic verbinding via moduleren plasmodesmal callose synthese verheldering besproken. De eerste stap is om afwijkende tropische antwoorden van 3 dagen oude geëtioleerde zaailingen mutanten of overexpressie lijnen van een gen te screenen met het wildtype. Deze eerste screeningkan leiden tot de identificatie van een reeks genen functioneren in PAT of het regelen van symplasmic connectiviteit. Het tweede onderzoek betreft de sortering van kandidaten die veranderde tropische reacties door het beïnvloeden van symplasmic connectiviteit te tonen. Om dergelijke kandidaten pakken, de beweging van een symplasmic tracer en de afzetting van plasmodesmal callose onderzocht. Deze strategie zou nuttig zijn om nieuwe kandidaat-genen die symplasmic verbinding direct of indirect tijdens de tropische reacties en andere ontwikkelingsprocessen kunnen reguleren verkennen.

In de huidige setup, dexamethason (Dex) induceerbare RNAi lijnen van AtGSL8 [hierna dsGSL8 (+ dex / -dex)] werden gebruikt, zoals homozygote gsl8 T-DNA insertie mutanten worden zaailing dodelijk 18. Drie dagen oude geëtioleerde zaailingen van dsGSL8 en wild type zaailingen met ± dex werden blootgesteld aan phototropic en gravitropic stimuli. We vonden dat dsGSL8 (+ dex) zaailingen waren defectief in phototropism en gravitropisme <su...

Dit artikel beschrijft de methoden voor het screenen van de genen die plasmodesmal doorlaatbaarheid en dus auxine verloop tijdens trope respons. Dit omvat het meten van de mate van respons in tropische hypocotyl van Arabidopsis thaliana en controleren plasmodesmal permeabiliteit door 8-hydroxypyreen-1,3,6-trisulfonzuur (HPTS) laad- en tenslotte callose niveau assessment.

Een strategie om de rol van callose gemedieerde Plasmodesmal Poortsignalen in de Tropic Response valideren

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The ...

Het algemene doel van deze procedure is het screenen van de genen die betrokken zijn bij callose-gemedieerde plasmodesmatale gating tijdens de tropische respons. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de plantontwikkelingsbiologie, zoals welke onbekende genen de cel-naar-cel signalering via plasmodesmata tijdens de tropische respons controleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig is, effectief werkt en reproduceerbaar is.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het uitdagend is om de geëtioleerde hypocotylen van Arabidopsis gedurende het hele proces zonder beschadigingen te hanteren. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we de rol van GSL8, een glucosesynthase in de gating van plasmodesmata, vaststelden. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de in de audio genoemde procedures de kritieke stappen niet hebben toegelicht, die moeilijk uit te voeren zijn omdat ze een speciale opstelling en hantering vereisen.Bereid Murashige and Skoog-medium, of MS-medium, één dag voor het experiment. Autoclaveer het medium en vul vier

a-strategy-to-validate-role-callose-mediated-plasmodesmal-gating

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kwantificering van ziekteverwekkergroei is een krachtig hulpmiddel om verschillende Arabidopsis thaliana (hierna: Arabidopsis) immuunresponsen te karakteriseren. De hier beschreven methode presenteert een geoptimaliseerde spuitinfiltratie-assay om de groei van Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 in volwassen Arabidopsis-bladeren te kwantificeren.

Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Op subcellulair niveau worden signaleringsgebeurtenissen dynamisch gemoduleerd door ontwikkelings- en omgevingssignalen. Hier beschrijven we een protocol dat het tabaks-transiente expressiesysteem gebruikt om dynamische eiwit-eiwitinteracties te monitoren en om de ruimtelijke organisatie van signaaltransductie in plantencellen bekend te maken.

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

Plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata (Pd), spelen een centrale rol in plant fysiologie en plant-virus interacties. Kritische Pd vervoer zijn signalen dat rechtstreekse eiwitten aan Pd sorteren. Onze kennis over deze sequenties is echter nog in de kinderschoenen. Beschrijven we een strategie om te identificeren Pd lokalisatie signalen in Pd-gerichte eiwitten.

Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta

Het doel van dit protocol is om aan te tonen hoe voor het opwekken van geclusterde stoma in zaadlobben van Arabidopsis thaliana zaailingen door onderdompeling behandeling met een suiker-bevattende middellange oplossing en hoe waarnemen van intracellulaire structuren zoals chloroplasten en microtubuli in de geclusterde guard cellen met behulp van confocale laser microscopie.

Een inductie systeem voor geclusterde stoma door suiker oplossing onderdompeling behandeling in Arabidopsis thaliana zaailingen

Extracellulaire glutamaat-geactiveerde systemische calcium signalering is van cruciaal belang voor de inductie van plantenverdedigingsreacties op mechanische wond- en herbivore-aanval in planten. Dit artikel beschrijft een methode om de ruimtelijke en temporele dynamiek van beide factoren te visualiseren met behulp van Arabidopsis thaliana-planten die calcium- en glutamaatgevoelige fluorescerende biosensoren uitdrukken.

Wide-Field, Real-Time Beeldvorming van lokale en systemische wondsignalen bij Arabidopsis

Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode voor de histologische observatie van gallen geïnduceerd door Plasmodiophora brassicae. Vibratome-secties van hypocotylen worden gewist vóór fluorescentiebeeldvorming om de betrokkenheid van transcriptiefactoren en fytohormonen tijdens ziekteprogressie te bestuderen. Dit protocol overwint de beperkingen van de inbedding van hars, waardoor planta-visualisatie van fluorescerende eiwitten mogelijk wordt.

Clearing en fluorescentiemicroscopie combineren voor het visualiseren van veranderingen in genexpressie en fysiologische reacties op Plasmodiophora brassicae

Verschillende veelgebruikte methoden worden hier geïntroduceerd om de membraanhandelgebeurtenissen van een plasmamembraanreceptorkinase te bestuderen. Dit manuscript beschrijft gedetailleerde protocollen, waaronder de bereiding van het plantmateriaal, de farmacologische behandeling en de confocale beeldvorming.

Op afbeeldingen gebaseerde methoden om membraanhandelgebeurtenissen in somatale afstammingscellen te bestuderen

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale reacties op bacteriële invasie in Arabidopsis thaliana. Deze methode maakt gebruik van een draagbaar stomatale beeldvormingsapparaat, samen met een beeldanalysepijplijn die is ontworpen voor bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd.

Directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale responsen op Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 in Arabidopsis thaliana

Dit protocol beschrijft de selectie van optimale plasmodesmale markers voor confocale microscopie-gebaseerde analyses van eiwit gericht op plasmodesmata tijdens virus-plasmodesmata interacties of plasmodesmaal transport.

Confocale microscopieanalyse van eiwitsortering naar plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

Dit protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het evalueren van plantionenlekkage, peroxidaseactiviteit en calloseproductie in hetzelfde monster.

Evaluatie van bladreacties op microbiële secundaire metabolieten met behulp van een high-throughput formaat

Leer een methode om genen te screenen die callose-gemedieerde plasmodesmale gating reguleren tijdens tropische reacties in Arabidopsis thaliana. Deze techniek helpt onderzoekers bij het begrijpen van cel-tot-cel signalering.

Een strategie om de rol van callose gemedieerde Plasmodesmal Poortsignalen in de Tropic Response valideren

Meer video's verkennen