Een strategie om de rol van callose gemedieerde Plasmodesmal Poortsignalen in de Tropic Response valideren
17 april 2016
Dit artikel beschrijft de methoden voor het screenen van de genen die plasmodesmal doorlaatbaarheid en dus auxine verloop tijdens trope respons. Dit omvat het meten van de mate van respons in tropische hypocotyl van Arabidopsis thaliana en controleren plasmodesmal permeabiliteit door 8-hydroxypyreen-1,3,6-trisulfonzuur (HPTS) laad- en tenslotte callose niveau assessment.
Het algemene doel van deze procedure is om de genen te screenen die betrokken zijn bij callose-gemedieerde plasmodesmale gating tijdens tropische respons. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van plantenontwikkelingsbiologie, zoals welke onbekende genen de cel-naar-cel communicatie via plasmodesmata tijdens tropische respons controleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig is, werkt en herhaalbaar is.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het hanteren van de Arabidopsis etiolerende hypocotyls zonder enige schade gedurende het hele proces een uitdaging is. We hadden eerst het idee voor deze methode toen we de regel van GSL8, een glucosesynthase in plasmodesmale gating, vaststelden. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de procedures die in het audio zijn genoemd, de kritieke stappen niet hebben uitgelegd die moeilijk uit te voeren zijn omdat ze speciale opstelling en behandeling vereisen.
Bereid Murashige en Skoog, of MS-medium, een dag voor het experiment voor. Steriliseer het en vul 125 millimeter vierkante platen met 50 milliliter medium per plaat. De volgende dag, dot zaden die gesteriliseerd zijn met 1,1% natriumhypochloriet op halfdroge platen.
Vanuit een micropipettip van 1 millimeter, dot zaden met 200 microliter water. Schik de zaden in vijf rijen, 1,8 centimeter uit elkaar, met de zaden minimaal 0,1 centimeter uit elkaar in de rijen. Laat wat water verdampen voordat je de platen bedekt en afsluit met chirurgisch plakband.
Vervolgens wikkel je de platen in folie en plaats ze in een doos. Incubeer de doos gedurende drie dagen bij vier graden Celsius. Na drie dagen koude behandeling, verplaats je de doos met zaden naar 22 graden Celsius gedurende drie dagen.
Na nog eens drie dagen, controleer in een donkere kamer de ontkiemingsstatus van de zaden onder groen licht. Meestal groeien drie dagen oude Col-0 etiolerende zaailingen tot 1,6 centimeter lang. Onder het groene licht, analyseer je de veranderde fototropische en gravitropische respons.
Gebruik een gesteriliseerde pincet om soortgelijke zaailingen met een rechte, verticale groei te selecteren. Til de zaailingen voorzichtig op vanaf het laagste deel van hun hypocotyl zonder enige andere delen aan te raken. Breng vervolgens de geselecteerde zaailingen voorzichtig over naar een verse MS-agarplaat.
Op de nieuwe plaat, richt de haken van de zaailingen op dezelfde manier. Selecteer minimaal 20 zaailingen van elke genetische achtergrond om elke rij te maken, en maak een duplicaat van elke plaat. Elke plaat bevat twee genotypen in twee rijen.
Om de fototropische respons te controleren, plaats je de platen in een zwarte doos zodat de zaailingen verticaal georiënteerd zijn. Laat een zijde van de doos open staan tot aan de rand van de platen. Incubeer vervolgens de doos in een plantengroeikamerbehuizing met eenzijdige witte verlichting.
Om de gravitropische respons te controleren, wikkel je de platen in folie en plaats ze in een zwarte doos zodat de zaailingen horizontaal staan. Op verschillende tijdstippen, meestal beginnend bij 90 minuten en uitlopend tot 12 uur, beeld je de platen af onder lage lichtomstandigheden. Gebruik een scanner ingesteld om JPEG-afbeeldingen met 600 DPI te verzamelen.
Om de buigingshoek van de zaailingen te meten, laad je hun afbeeldingen in ImageJ-software. Gebruik het vergrootglas om in te zoomen en scroll naar een zaailing om te analyseren. Gebruik vervolgens het hoekgereedschap om de hoek te meten waaronder de zaailing gebogen is.
Dit doe je door dubbel te klikken op het originele hypocotylgroeidrichtingpunt A en de muis naar het buigingsbeginpunt B te slepen. Gebruik vervolgens een linkerklik om de eerste lijn te tekenen. Sleep vervolgens de muis van punt B naar het buigingseindpunt C en gebruik een linkerklik om de tweede lijn te tekenen, waardoor een hoek A ontstaat. De ware buigingshoek is hoek B, die gelijk is aan 180 graden minus hoek A. Meet en noteer nu hoek A door op M op het toetsenbord te drukken. Het resultaatbestand opent afzonderlijk.
Herhaal de vorige stap voor het meten van de rest van de zaailingen en meet de gemiddelde hoek van twee verschillende achtergronden met behulp van de dataset spreadsheet-bestand. De voorbereiding van de HPTS agarose-blokken die nodig zijn voor deze test wordt behandeld in het tekstprotocol. Begin met het voorbereiden van de plantenmonsters.
In dit voorbeeld worden mutanten met een veranderde plasmodesmata grootte uitsluitingslimiet geanalyseerd. Maak eerst een platform voor de test. Plaats een microscoopdekglas op een nieuw MS-mediumplaat.
Vervolgens, vanaf MS-platen met drie dagen oude etiolerende zaailingen, gebruik je scherpe chirurgische schaar om de zaailingen voorzichtig uit de basis van de haak te snijden en over te brengen naar het dekglas. Breng minimaal vijf zaailingen per genetische achtergrond over. Richt de zaailingen zo dat er slechts 0,5 centimeter hypocotyl vanaf de snijplaats op het dekglas overblijft en de rest van de hypocotyl het medium raakt.
Plaats vervolgens een HPTS agarose-blok bovenop de uitgesneden zaailingen zodat het uitgesneden gebied in contact komt met de HPTS-blok. Zorg ervoor dat het contact gemaakt is. Laat de blok vijf minuten op de hypocotyls zitten.
Breng vervolgens de hypocotyls over naar een 10 millimeter petrischaaltje met dubbel gedistilleerd water en was ze met schudden gedurende 15 minuten. Breng vervolgens de gewassen zaailingen over naar een schuifje. Plaats elke mutant naast een controle om directe vergelijkingen te maken.
Bedek de hypocotyls met 100 tot 150 microliter dubbel gedistilleerd water en breng een dekglas aan. Analyseer nu de schuifje met behulp van confocale microscopie zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik voor deze test versbereide kleurstof die minder dan twee dagen oud is en in het donker wordt bewaard.
Om de novo callosesynthese te remmen, voeg je 1,5 millimolair 2-Deoxy
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel schetst een methode voor het screenen van genen die de plasmodesmale permeabiliteit en auxinegradiënten tijdens tropische reacties bij planten reguleren. De focus ligt op Arabidopsis thaliana-hypocotyls, waarbij de plasmodesmale permeabiliteit en calloseniveaus worden beoordeeld.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Plantontwikkelingsbiologie
- Cel-tot-cel-signalering
- Genetisch screenen
Achtergrond
- Het begrijpen van plasmodesmale gating is cruciaal voor plantsignaaloverdracht.
- Callose speelt een belangrijke rol bij het reguleren van plasmodesmale permeabiliteit.
- Tropische reacties bij planten omvatten complexe genetische interacties.
- Arabidopsis thaliana dient als modelorganisme voor deze studies.
Doel van het onderzoek
- Om onbekende genen te identificeren die plasmodesmale signalering tijdens tropische reacties regelen.
- Om het begrip van callose-gemedieerde plasmodesmale gating te verbeteren.
- Om een eenvoudige methodologie voor onderzoekers in het veld te bieden.
Gebruikte methoden
- Meting van tropische reactie in Arabidopsis-hypocotyls.
- Beoordeling van plasmodesmale permeabiliteit met behulp van HPTS-lading.
- Evaluatie van calloseniveaus in plantweefsels.
- Visuele demonstraties om de uitvoering van de methode te ondersteunen.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van belangrijke genen betrokken bij plasmodesmale gating.
- Succesvolle meting van tropische reacties onder gecontroleerde omstandigheden.
- Demonstratie van de effectiviteit en herhaalbaarheid van de methode.
- Belichting van uitdagingen bij het hanteren van Arabidopsis-hypocotyls.
Conclusies
- De methode biedt inzichten in de genetische controle van plantsignaaloverdracht.
- Visuele hulpmiddelen zijn essentieel voor een succesvolle implementatie van de techniek.
- Verder onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om andere genetische factoren te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding gene-mediated regulation of plasmodesmal connectivity provides mechanistic insight into auxin gradient formation, a foundational process in plant developmental signaling. This strategy enables systematic identification of genetic regulators of symplasmic gating, supporting target validation in plant signaling pathways. Such knowledge aids in de-risking hypotheses about intercellular communication mechanisms relevant to crop trait development and stress response modeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic hypotheses linking plasmodesmal callose synthesis to tropic response phenotypes.
- Operational Value: Uses aberrant tropic response screening in seedlings to prioritize genes affecting symplasmic connectivity.
- Scientific Value: Supports functional validation of candidate genes via symplasmic tracer movement and callose deposition assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes quantitative plasmodesmal permeability readouts using HPTS agarose block assays.
- Operational Value: Standardizes callose synthesis inhibition via 2-Deoxy-D-glucose treatment for comparative analysis.
- Scientific Value: Enables confocal microscopy-based signal intensity measurement to assess plasmodesmal gating dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links gene modulation to altered symplasmic connectivity during tropic responses, informing mechanistic models.
- Operational Value: Facilitates cross-genetic background comparison using duplicate plate designs and standardized hypocotyl excision.
- Scientific Value: Supports phenotypic screening workflows for genes influencing cell-to-cell signaling in developmental contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by connecting genetic screening to functional validation of plasmodesmal regulators, informing downstream target confidence assessments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes controlling cell-to-cell signaling via plasmodesmata during tropic responses.
- Screening: Enables assay readiness through standardized HPTS loading and callose staining protocols for permeability and gating quantification.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (bending angle, signal intensity) enabling condition comparison and hit validation.
- Translational Research: Provides mechanistic continuity from gene perturbation to symplasmic connectivity changes in tropic response models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable screening platform for genes modulating symplasmic signaling in plant developmental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking gene function to plasmodesmal gating mechanisms.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized seedling handling, plate duplication, and blinded angle measurement.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target prioritization by reducing mechanistic ambiguity in signaling pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates with validated roles in symplasmic connectivity regulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Arabidopsis seedling sterilization, plating, and hypocotyl handling without mechanical damage.
- Dependent on instrumentation for confocal microscopy, ImageJ analysis, and controlled light/temperature growth chambers.
- Necessitates cross-team standardization for tropic response imaging, callose staining, and symplasmic tracer assay execution.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different genetic backgrounds or developmental stages.
- Includes practical limitations such as seedling transfer sensitivity and the need for precise agar-hypocotyl contact during loading assays.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Screening for Altered Phototropic or Gravitropic Responses
4:09
Analysis of Seedling Bending Angles
5:32
Hypocotyl Assay: HPTS Dye-loading
7:30
Callose Aniline Blue Staining
8:44
Analysis of Callose Signal
9:45
Results: Screening AtGSL8 RNAi Plants
11:06
Conclusion
