Name: Functionele klonen behulp van een Xenopus Eicel Expression System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Leer functioneel klonen met het Xenopus eicel-expressiesysteem om genproducten te identificeren die inductieve reacties in ectoderm veroorzaken. Deze methode ondersteunt onderzoek naar genregulatie in de ontwikkelingsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Professional Development Grant aan C.Z.P. van de Shepherd University Foundation. De auteurs willen Brett Zirkle en Malia Deshotel bedanken voor de nuttige discussies over de protocollen, en Dr. Carol Hurney voor haar genereuze assistentie.

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van Virginia Institutional Animal Care en gebruik Comite. Opmerking: Figuur 1 toont een schematisch overzicht van de experimentele procedures. 1. Bereiding van eicellen <ol><li> Pre-prime X. laevis vrouwen met 150 U van drachtige merrie Serum Gonadotropin (PMSG) ongeveer een week van tevoren van eicel isolatie. Injecteer 1 ml 150 U / ml PMSG in dorsale lymfe zak met 1 cc steriele spuit met een 29 G naald. </li><li> Bereid oplossingen voor injectie en eicel eicel dieren cap assay. <ol><li> Bereid Ca ++ / Mg ++ -vrij OR2 (OR2-): 82 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM HEPES pH 7,2. </li><li> Bereid OR2: OR2- plus 1 mM CaCl2 en 1 mM MgCl2. </li><li> Bereid OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml BSA, 100 ug / ml gentamycine, pH 7,8. </li><li> Prepare 1x MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCI, 0,7 mM CaCl2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES (pH 7,8), 2,5 mM NaHCO 3. </li><li> Bereid 3% Ficoll in 1x MBS. </li><li> Bereid 1x NAM: 110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7,4. </li></ol></li><li> Verdoven van de vrouw in een oplossing 0,03% van ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaatzout (MS222) in 0,1x MBS (eerste ontbinden 0,3 g MS222 in 10 ml 95% ethanol en vervolgens verdund in 1 L 0,1x MBS) door het plaatsen van kikker in oplossing voor 10 - 15 minuten of tot reageert. <ol><li> Controleer of de verdoving is voltooid door te draaien verdoofde kikker op zijn rug om ervoor te zorgen dat niet reageert (onvolledig verdoofde kikkers bewegen ledematen of draai lichaam over). </li></ol></li><li> Chirurgisch isoleren ovariale fragmenten door een abdominale incisie door de huid en lichaamswand met scalpel, isoleren eierstokweefsel met een pinceten schaar. Plaats ovariële fragmenten in OR2-. Sluit de lichaamswand met een 3-0 zijden hechtdraad op een 24 mm gekromde naald en afzonderlijk sluit de huid met dezelfde hechtingen. Sta herstel van de vrouwelijke in 1 g / l aquarium zout water. </li><li> Met behulp van fijne tang, scheur eierstokweefsel in kleine (10-20 eicellen) stukken en transfer naar verse OR2-. </li><li> Defolliculate ovariële fragmenten in 2,0 mg / ml collagenase A in OR2- door roeren zachtjes op shaker gedurende 1 uur, het overbrengen van de frisse collagenase en roeren gedurende een extra uur. </li><li> Was eicellen 10 keer in OR2 [met Ca ++ / Mg ++], teruggooien kleinere eicellen. </li><li> Was eicellen in OCM twee keer en over te dragen aan verse OCM. Isoleer Fase VI oöcyten grootteklasse bij visuele inspectie en gooi onrijpe (kleiner) oöcyten: Fase VI oöcyten zijn groter dan onrijpe eicellen met nog pigmentatie in het dier halfrond en ongeveer 1,2-1,4 mm in diameter. </li><li> Behouden eicellen bij 18-20 ° C in OCM vóór injectie. Opmerking: Agarose-gecoate petrischalen kunnen worden gebruikt om het kleven van eicellen minimaliseren schotel. </li></ol> 2. Injectie van Bibliotheek Afschriften <ol><li> Bereid een directionele cDNA-bibliotheek 15 gebruikt RNA geëxtraheerd in een geschikt stadium van ontwikkeling (bijvoorbeeld neurale plaat stap 14 10). Koop een cDNA bibliotheek of de bouw van een met behulp van een commerciële kit per het overzicht in de vier stappen hieronder. <ol><li> Isoleer ongeveer 5 ug mRNA met behulp van een product te verrijken poly (A) + RNA (zie Tabel Materials) en volgens instructies van de fabrikant. Opmerking: De transcripten worden gebruikt om de cDNA-bibliotheek kan worden beperkt tot een inducerend weefsel te produceren (zoals de neurale plaat na microdissectie van het gewenste weefsel), of kunnen uit vol embryo&#39;s in een bepaalde fase. </li><li> Opbrengst cDNA met een commerciële kit volgens de aanwijzingen van de fabrikant. </li><li> Ligeren ongeveer 20 ng cDNA in een vector die bij de commerciële kit of een andere geschikte vector. Een geschikte plasmidevector sequenties voor stabiliteit van mRNA als 5 &#39;β-globine en 3 poly (A) sequenties (pCS2 +, pTnT, pCS105). </li><li> Transformeren ligatie in competente bacteriële cellen met behulp van aanbevolen protocol leverancier voor heat shock transformatie. Opmerking: Als alternatief kan een verzameling van open reading frame (ORFeoom) klonen is in de handel verkrijgbaar en kunnen worden gebruikt om transcripten voor injectie genereren. </li></ol></li><li> Bereid 10 verzamelingen van plasmiden van 10 om 10 3 4 complexiteit (10 4 10 5 om de totale complexiteit). Dit vertegenwoordigt 10 platen met 1000 - 10.000 kolonies per. <ol><li> Plaat bibliotheek cultuur op 10 15-cm LB-ampicilline platen, groeien 12-18 uur bij 37 ° C, en de kolonies van elkaar door zachte druk met een glas spreader verzamelen in 7 ml LB. </li><li> Bereid een glycerol voorraad van 0,5 ml (voeg toe aan 0,2 ml steriele glycerol en bewaar bij -20 &amp;# 730, C), en gebruikt de resterende 6,5 ml DNA te bereiden met een in de handel verkrijgbare DNA miniprep kit volgens de aanwijzingen van de fabrikant. </li></ol></li><li> Lineariseren samengevoegd plasmide DNA (1,0 - 2,0 ug) met geschikte restrictie-enzym digest 16 bij 37 ° C gedurende 1 - 1,5 uur. Isoleer het gelineariseerde DNA met fenol / chloroform extractie gevolgd door ethanol precipitatie en resuspensie in water volgens de specificaties van de RNA-polymerase kit gebruikt. Synthetiseren sense RNA met een commerciële kit RNA polymerase volgens de aanwijzingen van de fabrikant. </li><li> Bereid naalden voor micro-injectie (met een naald trekker met glazen capillaire buis) van ongeveer 20 urn diameter; meten naald tips op een samengestelde microscoop met een gekalibreerde oculaire micrometer. Opmerking: Naald puller instellingen moeten empirisch vastbesloten om een ​​naald te produceren met een fijne punt zodanig dat wanneer gebroken met fijne tang levert de gewenste tip grootte. </li><li> Bereid (push klei inuniforme laag op de bodem van de schaal) klei bekleed 35 x 10 mm petrischaaltjes met parallelle groeven om eicellen in plaats te houden tijdens de micro-injectie; produceren groeven met een winkelcentrum sonde of pasteurpipet gefuseerd aan het uiteinde in vlam. Als alternatief voor klei bereiden agarose schotels maken indrukkingen met een elastomeer matrijs 17. Transfer eicellen met een brede boring pipet tot 3% Ficoll in 1 x MBS (ongeveer 2 ml) in rijen in de klei beklede schotels. </li><li> Met behulp van microinjector, vul naald met 1 ng / nl RNA en pas evenwicht tot lichte positieve druk te produceren (om te voorkomen dat de opstelling van de eicel cytoplasma). </li><li> Injecteren eicellen met ongeveer 20 nl RNA in de equatoriale regio. Laat 1 uur voor geïnjecteerde oöcyten te blijven Ficoll-MBS, vervolgens over voorzichtig 1x MBS. Incubeer gedurende 8 - 24 uur bij 20 ° C vóór dier cap assay. </li></ol> 3. Animal Cap Assay <ol><li> Bereid 3 / 4x NAM en het verkrijgen van fijne tang, haar loop, gebogen dekglaasje fragmenten, met klei bekleed dishes met komvormige inkepingen om eicellen te houden. Maak gebogen dekglaasje fragmenten door het breken van elkaar dekglaasjes in kleine fragmenten (ongeveer 1-2 mm x 2 - 4 mm) en passeren van de vlam tot randen polish en hangen, het produceren van een gebogen stuk. </li><li> Bevruchten X. laevis eieren 18 door middel van in vitro of natuurlijke bevruchting en cultuur podia gastrula (10 - 11 uur na de bevruchting bij RT) in 0,1x MBS voorafgaand aan het sorteren op het podium; verzamel mid-gastrulastadium (fase 11-11,5) 10 embryo&#39;s. </li><li> Transfer embryo&#39;s naar een petrischaaltje ongeveer de helft vol met 3 / 4x NAM. Met behulp van twee paar fijne tang, verwijder de bevruchting (vitelline) membraan van gastrulae. </li><li> Transfer eicellen tot 3 / 4x NAM (ongeveer 2 ml) in klei bekleed gerechten en immobiliseren in individuele indrukken in de klei, het produceren van indrukken individuele embryo geschikt als groeven hierboven zijn beschreven. </li><li> Transfer embryo&#39;s naar de klei beklede gerechten en snijd dier caps off gastrulae gebruik van twee paar fijne tang. Zorg ervoor dat dier dop ectoderm alleen en niet equatoriale weefsel 18 te isoleren. </li><li> Plaats een dier dop op het dier halfrond van elke oöcyt met het binnenvlak van het dier dop met de eicel. Houd recombinanten elkaar door toepassing gebogen glazen dekglaasje fragment en het aanbrengen neerwaartse druk op het glas, afvlakking van de ectoderm als dekglaasje contacten klei (dier caps kunnen openen met de binnenlaag blootgesteld aan het oppervlak van de eicel tot 6 blijven - 8 uur of langer ). Opmerking: Als alternatief, plaats het dier dop in een klei inkeping met zijn binnenste oppervlak naar boven en zet een eicel op de dop; zet de recombinante met kleine uitbreidingen van klei. </li><li> Kweken bij 20 ° C totdat control embryo reach gewenst stadium voor de test. </li><li> Aparte recombinant door het verwijderen van dekglaasje / klei en isoleren ectoderm met een tang en een haar lus. </li><li> Fix ectodermale fragmenten gedurende 1 uur in MEMFA (3,8%formaldehyde in MEM [0,1 M MOPS pH 7,4, 2 mM EGTA en 1 mM MgSO 4]). </li><li> Transfer fragmenten (en controle embryo&#39;s) uit MEMFA in ethanol en bewaar bij -20 ° C. </li></ol> 4. Analyse van de respons in Ectoderm door in situ hybridisatie (ISH) <ol><li> Bereid oplossingen voor het ISH. <ol><li> Bereid 1x PBS: 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing, 0,138 M NaCl, pH 7,4 </li><li> Bereid PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% Tween-20 </li><li> Bereid 100x Denhart&#39;s oplossing: 2% BSA, 2% polyvinylpyrrolidon, 2% Ficoll </li><li> Bereid Hybridization Buffer: 50% formamide, 5x SSC, 1 mg / ml Torula gist RNA, 1 ug / ml Heparine, 1 x Denhart&#39;s oplossing, 0,1% Tween-20, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA, DEPC-H2O </li><li> Bereid maleïnezuur buffer (MAB): 100 mM maleïnezuur, 150 mM NaCl, pH 7,5 </li><li> Bereid MAB + blok: MAB, 2% blokkerende reagens (warmte tot 60 ° C op te lossen) </li><li> Bereid alkalisch fosfatase (AP) buffer: 100 mM TrispH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween, dH 2 O </li></ol></li><li> Maak de RNA-Probe. <ol><li> Met behulp van een commercieel RNA polymerase kit en graven-NTP mix, aan een 1,5 ml buis (50 pi reactie): 25,5 pi DEPC-H2O, 10 ui 5X Transcription Buffer, 2,5 gl 10x dig-NTP mix, 5 pl 100 mM DTT, 2 pl RNAsin, 2 pl gelineariseerd DNA matrijs (~ 1 ug / ul), 3 ui RNA polymerase en incubeer 37 ° C gedurende 90 min. </li><li> Voeg 2 pi RNA Polymerase en incubeer 37 C gedurende 60 min. </li><li> Controle 2 pl reactiemengsel op 1% agarose gel. </li><li> Voeg 1 ul RQ1 RNase-Free DNase en incubeer 37 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Precipiteren de probe door toevoegen 50 ui DEPC-H2O, 25 gl 10 M ammoniumacetaat en 313 pl ethanol. Bewaren bij -20 ° C gedurende de nacht (O / N), dan herstellen RNA door centrifugeren bij 13.800 xg gedurende 20 minuten. Wassen met 500 ul 75% ethanol, kort draaien, verwijderenethanol en laat de pellet aan de lucht drogen. Voeg 50 pi DEPC-H2O </li><li> Voeg Hybridization Buffer tot een uiteindelijke concentratie van ~ 0,5 ug / ul. </li></ol></li><li> Bereid weefsel voor hybridisatie. Tenzij anders vermeld, vul ampullen boven met elke oplossing veranderingen beschreven (ongeveer 4 ml). <ol><li> Verwijder ethanol uit flesjes en overdracht van embryo&#39;s in 75% ethanol / PTW, dan is 50% ethanol / PTW gedurende 10 minuten elk, horizontaal op de wip. </li><li> Was drie keer in PTW gedurende 5 minuten elk op rocker. </li><li> Transfer naar 10 ug / ul proteïnase K behandeling PTW; rots buizen verticaal 15 min. </li><li> Twee keer 10 minuten elk spoelen in 0,1 M Triethanolamine pH 7,8 - rock buizen verticaal. </li><li> Voeg 12,5 pi azijnzuuranhydride buizen en Rock verticaal 5 min. Herhaal extra 12,5 pi azijnzuuranhydride gedurende 5 min. </li><li> Wassen in PTW 5 min verticaal op rocker. </li><li> Refix in 4% paraformaldehyde 20 min op rocker. Heat Hybridization Buffertot 60 ˚C. </li><li> Was drie keer in PTW gedurende 5 minuten elk op rocker. </li><li> Verwijder alles behalve ~ 1 ml PTW van elke buis en voeg 250 ul Hyb Buffer; zachtjes wervelen buizen te mengen. Rock buizen verticaal 5 min. </li><li> Vervangen door 60 ˚C Hyb Buffer (0,5 ml) en schud zachtjes op 60 ° C 10 min. Vervang met verse Hyb Buffer en schud bij 60 ˚C twee tot 4 uur. </li><li> Warmtesonde (1 ml bij 0,5 ug / ul in Hyb buffer) tot 60 ° C (3 min). Verwijder Hyb Buffer toevoegen probe buizen. Schud zachtjes O / N op 60 ˚C. </li></ol></li><li> Bereid weefsel voor antilichaam. <ol><li> Warm Hyb buffer en 2 x SSC + 0,1% Tween-20 oplossing tot 60 ° C. </li><li> Vervang sonde oplossing Hyb Buffer (sparen sondes bij -20 ° C gedurende 2 - 3x hergebruik). Wassen bij 60 ° C gedurende 10 min. </li><li> Was drie keer met 60 ° C in 2 x SSC-Tween (20 min elk onder roeren). </li><li> Was drie keer met 60 ° C in 0,2 x SSC-Tween (20 min elk onder roeren). </li><li> Was tweemaal in MAB (RT) gedurende 15 minuten elk horizontaal op rocker. </li><li> Voeg 1 ml MAB + blok. Was 2 uur verticaal op rocker. </li><li> Transfer naar 1 ml MAB + blok met daarin een 1/2000 Anti-digoxygenine-AP. Rock verticaal op 4 CO / N. </li></ol></li><li> Bereid weefsel voor Color reagens. <ol><li> Vervang antilichaam oplossing met MAB; Was driemaal in MAB 5 minuten elk horizontaal op rocker. </li><li> Was driemaal MAB 1 uur elk horizontaal op rocker. </li><li> Was tweemaal in AP-buffer 10 min elk horizontaal op rocker. </li><li> Transfer weefsel om meerdere goed plastic bakje, verwijder AP buffer en voeg BM Purple reagens (~ 1 ml). Laat reactie te laten verlopen in het donker 5 min op O / N. </li><li> Wanneer geschikte kleuring wordt bereikt, transfer weefsel flacons van PTW. Was twee keer 10 minuten elk in PTW op rocker. </li><li> Fix in oplossing Bouin bij 4 CO / N op de rocker. </li><li> Spoel Bouin met drie 70% ethanol / 30% PTW wasbeurten bij RT. Overgaan to beeld vast te leggen met behulp van epi-verlichting en een microscoop gemonteerde camera, bleken indien nodig 18. </li></ol></li></ol> 5. Sib Selectie en klonen <ol><li> Selecteer zwembad met de hoogste activiteit (grootste respons in ectodermale weefsel). </li><li> Titreer (verdunnen met LB passende dichtheid) de glycerol voorraad voor het zwembad met de hoogste activiteit en de plaat uit tien nieuwe platen met ongeveer een tiende van de kolonies van de vorige stap (met behulp van deel 2 in protocol hierboven). </li><li> Verminder grootte van het zwembad totdat activiteit wordt herleid tot enkele kolonie. </li><li> Verkrijgen DNA-sequentie met standaard primers in de vector. </li></ol>

<ol><li>Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetic+Screens+in+Xenopus.+Using+Transposon-Mediated+Insertional+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).</li>
<li>Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+tropicalis.+as+a+Model+Organism+for+Genetics+and+Genomics%3A+Past%2C+Present+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).</li>
<li>Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Efficient+CRISPR%2FCas9-Mediated+Targeted+Mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51, 835-843 (2013).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis.</a> Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+Genetic+Studies+Using+Antisense+Morpholino+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).</li>
<li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injected+Xwnt-8.+RNA+acts+early+in+Xenopus.+embryos+to+promote+formation+of+a+vegetal+dorsalizing+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center.</a> Cell. 67, 753-765 (1991).</li>
<li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin.%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+in+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+of+induction+of+anterior+head+ectodermal+properties+in+Xenopus.+embryos+are+mediated+by+transcriptional+cofactor+ldb1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus.+ectoderm%3A+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Development. 112, 177-188 (1991).</li>
<li>Nieuwkoop, P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+P+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).</li>
<li>Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+Siamois.%2C+a+Xenopus.+homeobox+gene+expressed+in+dorsal-vegetal+cells+of+blastulae+and+able+to+induce+a+complete+secondary+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis.</a> Cell. 81, 85-94 (1995).</li>
<li>Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+a+Xenopus+T.-related+gene+%28Xombi.%29+involved+in+mesodermal+patterning+and+blastopore+lip+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation.</a> Development. 122, 4001-4012 (1996).</li>
<li>Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus.+dorsalizing+factor+Gremlin+identifies+a+novel+family+of+secreted+proteins+that+antagonize+BMP+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities.</a> Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).</li>
<li>Lustig, K., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+oocyte+expression+assay+to+reconstitute+inductive+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li>
<li>Viczian, A., Zuber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Determination+Using+the+Animal+Cap+Transplant+%28ACT%29+Assay+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis.</a> J. Vis. Exp. (39), e1932(2010).</li>
<li>Sive, H., Grainger, R., Harland, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+H+%22Early+development+of.Xenopus+laevis.%3A+A+laboratory+manual%22">Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).</li>
<li>Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+activation+during+early+stages+of+lens+induction+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus.</a> Development. 125, 3509-3519 (1998).</li>
<li>Medina-Martinez, O., Jamrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxe+view+of+lens+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Foxe view of lens development and disease.</a> Development. 134, 1455-1463 (2007).</li>
<li>Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+in+the+tetraploid+Xenopus.laevis.+enables+genome-wide+insight+in+a+classic+developmental+biology+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism.</a> Methods. 66, 398-409 (2014).</li>
<li>Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+large+set+of+full-length+clones+from+a+Xenopus+tropicalis+EST+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project.</a> Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).</li>
<li>Karpinka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus.+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signaling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PLoS ONE. , e79469(2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De hier beschreven methode voor de functionele klonering van genen kan induceren reaktie bevoegde ectoderm kan worden gebruikt om een ​​breed scala van genproducten te identificeren. Deze methode breidt uit op het verleden door het combineren van werk-tissue-inducerende assays met expressie kloontechnieken. We maken gebruik van de metabole routes van de Xenopus oöcyt als bron van productie inducerende factoren, direct of indirect volgende RNA injectie. Dit, in combinatie met het gebruik van vastgestelde werkwij...

Voorwaartse genetische benaderingen om genen van belang te identificeren door hun functie of functieverlies1,2 zijn een integraal onderdeel van het begrijpen van complexe patroonontwikkelingsgebeurtenissen. Gecombineerd met krachtige omgekeerde genetische technieken die beschikbaar zijn voor een steeds groter wordend scala aan systemen en onderzoekers3-5, is het nu mogelijk om genen met een sleutelfunctie in een pad te identificeren en vervolgens die functie op cellulair niveau en in interactie met andere genproducten te verduidelijken. Een benadering voor het functioneel identificeren van genen van belang die in het verleden veel belangrijke ontdekkingen heeft opgeleverd, is expressie-klonen6,7.
Ons recente doel8 was om vroege lens-inductieve factoren te identificeren, aangezien is aangetoond dat de initiële stappen in het lens-inductieve proces van gewervelde dieren al in de gastrula-stadia optreden. Hiervoor gebruikten we het tijdelijk lens-competente9 dierlijke kap-ectoderm (stadium 11-11.510) van Xenopus-embryo's als reagerend weefsel voor inductie, en de stadië VI Xenopus-eiceldon als bron van productie voor de inducerende factoren.
Het volgende protocol is gebaseerd op de expressie-klonen en sib-selectieprotocollen van Smith en Harland6,7, ook met succes gebruikt door anderen11-13. In ons oöcytexpressiesysteem (voor het eerst gebruikt voor de productie van inducerende factoren door Lustig en Kirschner14), worden groepen geïnjecteerde transcripten die rechtstreeks of indirect de oöcyten kunnen laten factoren produceren die een lens-inductieve respons in dierlijk kap-ectoderm veroorzaken, geselecteerd en geïdentificeerd. Aangezien het systeem nuttig is voor het rechtstreeks tot expressie brengen van uitgescheiden inducerende moleculen (oöcyt-geïnjecteerd INHBB mRNA veroorzaakt mesoderminductie in mesoderm-competent dierlijk kap-ectoderm8), verwachtten we oorspronkelijk dat de screeningsprocedure voornamelijk nuttig zou zijn voor de identificatie van paracriene factoren. Aangezien we echter een nucleair factor in onze screening hebben geïdentificeerd (ldb18), is het duidelijk dat het systeem kan worden gebruikt om een breed scala aan moleculen te identificeren, zoals transcriptionele of translationele regulerende factoren, miRNA's, cofactoren of juxtacriene factoren.

<table><tbody><tr><td>12/101 Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>12/101</td><td>Monoclonaal antilichaam voor detectie van spierweefsel</td></tr><tr><td>20x SSC Buffer</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma</td><td>A6404</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>Anti-Dig-AP</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>Aurum Plasmid Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6400</td><td>Plasmid DNA-zuivering</td></tr><tr><td>Blocking Reagent</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>BM Purple</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>Boekel Hybridization Oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-245-121</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>Bouin's Solution</td><td>Sigma</td><td>HT10132</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>voor OCM</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C3023</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>Defolliculatie van eicellen</td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C121800</td><td>Dejelly-embryo's</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP5611</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>Dig-RNA Labeling Mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td>voor ISH-probes</td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td>voor het verwijderen van de vitelline-omhulsel</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>MS222 anesthetisch middel</td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma</td><td>F4375</td><td>voor injectiemedia</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>voor OCM</td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td>3,5" lang, I,D, 0,530 mm</td></tr><tr><td>Glass sample vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-408B</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>Hair loop</td><td></td><td></td><td>Haar bevestigd in pasteurpipet voor weefselmanipulatie</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>Injector Nanoliter 2010</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nanoliter 2010</td><td>Microprocessorgestuurde micro-injector</td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Carolina</td><td>972433</td><td>Aquariumzout voor kikkerherstel</td></tr><tr><td>IRBG XGC Xenopus geverifieerde volledige lengte cam cDNA</td><td>Source Bioscience</td><td>989_IRBG</td><td>cDNA-bibliotheek&nbsp;</td></tr><tr><td>LB Agar platen met 100 &micro;g/ml Ampicilline</td><td>Teknova</td><td>L5004</td><td>150 mm voorgegoten LB-Amp platen voor sib selectie</td></tr><tr><td>LB Luria Broth</td><td>Teknova</td><td>L8650</td><td>LB voor het verzamelen van kolonies in sib selectie van platen en verdunning van culturen</td></tr><tr><td>Magnetic mRNA Isolation Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>S1550S</td><td>voor isolatie van poly(A)-verrijkt RNA</td></tr><tr><td>Maleic Acid</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>Manual Microfil Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3310R</td><td>Manuele micromanipulator</td></tr><tr><td>Nutating Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-152</td><td>Rocker voor ISH</td></tr><tr><td>Permoplast</td><td>Nasco</td><td>SB33495M</td><td>Klei voor injectie- en dissectiekommen</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>om oöcyte-ontwikkeling te stimuleren</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon</td><td>Sigma</td><td>PVP40</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>Programmable Puller</td><td>World Precision Instruments</td><td>PUL-1000</td><td>Micropipet-naaldtrekker</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>pTnT Vector</td><td>Promega</td><td>L5610</td><td>cDNA-bibliotheekconstructie</td></tr><tr><td>Riboprobe Combination System</td><td>Promega</td><td>P1450</td><td>in vitro transcriptie</td></tr><tr><td>Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit</td><td>Life Technologies</td><td>18248013</td><td>kit voor cDNA-bibliotheekconstructie</td></tr><tr><td>Sutures, 3-0 zijde</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td>Sutuurdraad en naald voor post-oöcyte-verwijdering</td></tr><tr><td>Torula RNA</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>voor ISH</td></tr><tr><td>Universal RiboClone cDNA Synthesis System</td><td>Promega</td><td>C4360</td><td>alternatieve kit voor cDNA-bibliotheekconstructie</td></tr><tr><td>Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration</td><td>Source Bioscience</td><td>5055_XenORFeome</td><td>ORFeome-klonen</td></tr><tr><td>XL2-Blue Ultracompetent Cells</td><td>Agilent Technologies</td><td>200150</td><td>cellen voor transformatie van cDNA-bibliotheek</td></tr></tbody></table>

functionele klonen behulp van een<em&gt; xenopus</em&gt; eicel expression system

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

De identificatie van genen die verantwoordelijk zijn voor embryonale inductie stelt een aantal uitdagingen; om er een paar te noemen, kunnen uitgescheiden moleculen van belang laag in abundantie zijn, kunnen ze niet uitgescheiden worden maar vastgebonden zijn aan de signaalcel(len), of kunnen ze de aanwezigheid van bindingspartners of stroomopwaartse regulerende moleculen vereisen. Dus in een zoektocht naar genproducten die in staat zijn om een vroege lens-inductieve respons in competent ectoderm teweeg te brengen, gebruikten we een expressie-kloonse systeem dat de identificatie van paracriene of juxtacrine factoren evenals transcriptionele of andere regulerende eiwitten zou toestaan. Pools van mRNA werden geïnjecteerd in Xenopus eicellen, en het reagerende weefsel werd direct op de eicellen geplaatst en geco-cultiveerd. Na functionele kloning van ldb1 uit een neurale plaat-stadium cDNA-bibliotheek op basis van zijn vermogen om de expressie van de vroege lensplacode marker foxe3 in lens-competent dierlijk kap-ectoderm teweeg te brengen, karakteriseerden we het mRNA-expressiepatroon, en beoordeelden we de ontwikkelingsprogressie na overexpressie of knockdown van ldb1. Dit systeem is geschikt in een zeer brede verscheidenheid aan contexten waar identificatie van een inductor of zijn stroomopwaartse regulerende moleculen wordt gezocht met behulp van een functioneel antwoord in competent weefsel.

In reactie op expressie van mRNA geïnjecteerd in oöcyten, reageert dierlijk cap weefsel werd onderzocht op expressie van otx2 door in situ hybridisatie (Figuur 2 en Tabel 1) otx2 wordt uitgedrukt in de vermoedelijke lens ectoderm (PLE) van neurale buis sluiting door lens placode verdikking 19. Aangezien otx2 zich ook in de voorste neurale ectoderm als niet-neurale head ectoderm buiten de PLE wordt geassocieerd met zowel neur...

We beschrijven een Xenopus eicel en dierlijk kapsysteem voor de expressie-klonering van genen die in staat zijn om een respons te induceren in competent ectoderm, en bespreken technieken voor de daaropvolgende analyse van dergelijke genen. Dit systeem is nuttig bij de functionele identificatie van een breed scala aan genproducten.

Functionele klonen behulp van een<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van een Xenopus-oöcyt, een animal cap-systeem, dat geschikt is voor de identificatie van genproducten die in staat zijn een respons in competent ectoderm op te wekken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de ontwikkelingsbiologie, zoals welke genen noodzakelijk zijn om een inductieve respons uit te lokken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van de Xenopus-oöcyt als expressiesysteem om induceerders die inwerken op een doelweefsel, of zelfs genen die stroomopwaarts van induceerders werken, te produceren en te identificeren.Een visuele demonstratie van deze methode is uiterst nuttig, aangezien de dissectie- en recombinatiestappen sterk stadiumafhankelijk zijn en een verfijnde techniek vereisen. Scheur na het verzamelen van eierstokweefsel van genarceerde vrouwelijke kikkers het weefsel in kleine stukjes, die elk ongeveer 10 tot 20 oocyten bevatten. Breng deze fragmenten eerst over naar verse OR2-oplossing en vervolgens naar OR2 met 2,0 mg/mL collagenase A. Ga verder door het mengsel met het weefsel gedurende één uur zachtjes te agiteren op een schudmachine.Breng de fragmenten vervolgens over naar een verse collagenase-oplossing en schud deze nog een uur lang. Aan het einde van deze behandeling moeten de oocyten gedeflocculeerd zijn. Was de oocyten vervolgens 10 keer in compleet OR2 en daarna twee keer in oocytkweekmedium, afgekort als OCM.Plaats de oocyten vervolgens in verse OCM en inspecteer deze visueel onder een dissectiemicroscoop. Isoleer de oocyten in stadium zes door de kleinere, onrijpe oocyten te verwijderen. Plaats de oocyten daarna in een met agarose gecoate Petrischaal met OCM en houd deze op 18 tot 20 °C tot aan de injectie.Ter voorbereiding op de micro-injectie plaatst u glazen capillaire buisjes in een naaldtrekker, trekt u deze uit en breekt u vervolgens de punten van het glas af om naalden te verkrijgen met een diameter van ongeveer 20 micrometer. Meet de naaldpunten op een compound-microscoop met een gekalibreerde oculairmicrometer. Druk vervolgens klei in een uniforme laag op de bodem van een Petri-schaal van 35 bij 10 millimeter.Maak vervolgens met een instrument dat lijkt op een sonde parallelle groeven in deze laag. Vul de met klei beklede schaal met ongeveer 2 milliliters 3%Ficoll in 1x gemodificeerde Barth's saline, of MBS. Draag daarna de oocyten hiernaartoe over met een pipet met een wijde opening.Plaats de oocyten in de groeven zodat ze op hun plek blijven tijdens de daaropvolgende microinjectie. Vul met een micro-injecteur een naald met ongeveer 2 µL van een eerder gegenereerde pool mRNA en stel de balans zo in dat er een lichte positieve druk ontstaat, waardoor wordt voorkomen dat oocytcytoplasma in de naald wordt getrokken tijdens de injectie. Injecteer vervolgens elke oocyt met 20 nL RNA in het equatoriale gebied.Laat de oocyten daarna één uur in de Ficoll MBS rusten en breng ze vervolgens voorzichtig over naar 1x MBS. Incubeer de oocyten daarna gedurende acht tot 24 uur bij 20 °C. Om de animal cap assay te starten, verzamelt u 3/4x normal amphibian medium, afgekort als NAM-oplossing, fijne pincetten, een haarloop, eerder geïnjecteerde oocyten en Xenopus-embryo's in stadium 11 tot 11,5.Breek vervolgens glazen dekglasplaatjes in fragmenten van ongeveer één millimeter bij twee millimeter en houd deze stukjes in een vlam tot de randen gepolijst en afgerond zijn. Druk vervolgens klei in een enkele laag in een schaaltje, zoals eerder beschreven. Gebruik een kleine sonde om individuele kopvormige indrukkingen in deze laag te maken.Vul de schaal vervolgens met ongeveer twee milliliter 3/4x NAM. Breng daarna de geïnjecteerde oocyten over naar de schaal en positioneer er enkele zodanig dat elke oocyt gefixeerd is in een enkele inkeping. Om de embryo's klaar te maken, brengt u ze over naar een schaal met 3/4x NAM-oplossing.Selecteer een subset gastrulae die als stadieringscontroles voor de leeftijd van het ectoderm zullen dienen en breng deze over naar een andere schaal met dezelfde oplossing. Zet deze plaat apart. Verwijder bij de embryo's die gebruikt zullen worden voor de animal cap-assay de vitellijnmembranen met twee paren fijne pincetten.Breng vervolgens de gastrula over naar de met klei beklede schaal met de oocyten. Snijd eerst de animale kappen van de embryo's af met twee paren fijne pincetten, waarbij voorzichtig moet worden vermeden om het equatoriale weefsel te raken. Om recombinanten te genereren via de eerste methode, positioneert u een animale kap zodanig dat het binnenoppervlak in contact komt met het animale hemisfeer van een oocyt die reeds in een inkeping is geplaatst.Herhaal dit proces voor meerdere van de geïnjecteerde oocyten. Om ervoor te zorgen dat deze recombinanten bij elkaar blijven, plaatst u een gebogen fragment van een glazen dekglas bovenop elk van hen en oefent u neerwaartse druk uit totdat het dier is platgedrukt en het dekglas de klei raakt. Om recombinanten te genereren met behulp van de tweede methode, plaatst u animal caps en oocyten samen in lege individuele inkepingen in de klei.Zorg ervoor dat de binnenoppervlakken van de animal caps naar de oocyten zijn gericht. Bevestig vervolgens de twee weefsels aan elkaar met kleine stukjes klei. Zodra er met een van beide methoden meerdere recombinanten zijn gegenereerd, worden deze samen met de apart gehouden controle-embryo's gekweekt bij 20 degrees celsius.Wanneer de controle-embryo's het gewenste stadium hebben bereikt, worden de dekglasjes van de recombinanten verwijderd en wordt het ectoderm van de animal cap geïsoleerd met een pincet en een haarlus. Fixeer vervolgens zowel de ectodermale fragmenten als de controle-embryo's gedurende één uur in MEMFA. Breng ze daarna over naar ethanol en bewaar dit weefsel bij -20 °C.Hierbij werden sets oocyten geïnjecteerd met pools mRNA die overeenkwamen met progressief kleinere aantallen klonen of kolonies, om vervolgens te worden gekweekt met animal caps. Vervolgens werd het aantal animal caps in elke set bepaald dat foxe3 tot expressie bracht, een marker die normaal wordt waargenomen in het presumptieve lensectoderm vanaf de vroege neurale plaatstadia tot aan de blaasvorming, en hier werd gebruikt om het lensinducerend vermogen te evalueren. Deze methode identificeerde een gen dat codeert voor een nucleaire factor, ldb1, dat een lensinducerende respons kan opwekken in 50 van de 179, oftewel 28% van de beoordeelde animal caps.Hier worden onze in situ hybridisatiebeelden getoond, waarop het foxe3-signaal, aangegeven door pijlpunten, zichtbaar is in animal caps die zijn gekweekt met ldb1-geïnjecteerde oocyten van ongeveer stadium 11 tot stadium 23. Er is geen foxe3-expressie waargenomen in de overeenkomstige controle-animal caps die op niet-geïnjecteerde oocyten zijn geplaatst. Wanneer er coupes werden gemaakt van deze animal caps, werd foxe3-expressie waargenomen in zowel de binnenste als de buitenste ectodermale lagen.Expressie in de binnenlaag is kenmerkend voor een lensrespons. Wanneer expressie in beide lagen wordt gesignaleerd, is dit indicatief voor andere structuren, zoals de olfactorische placode. Na deze procedure kunnen methoden zoals immunohistochemie, in situ hybridisatie of directe detectie van een fluorescent reportergen worden uitgevoerd om een inductieve respons in het ectoderm van de dierpoolkap te beoordelen.

functional-cloning-using-a-xenopus-oocyte-expression-system

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier laten we zien cytoplasmatische micro-injectie...

Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen

Bemesting van Xenopus oöcyten Het gebruik van de Host Transfer Methode

Xenopus embryonale epitheel is een ideaal modelsysteem om cel gedrag, zoals polariteit ontwikkeling en vorm veranderen tijdens epitheliale morfogenese bestuderen. Traditionele histologie van vaste monsters wordt in toenemende mate aangevuld door live-cell imaging confocale. Hier laten we zien methoden om de kikker weefsel te isoleren en te visualiseren live-epitheliale cellen en hun cytoskelet met behulp van live-cell confocale microscopie.

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Deze video toont een protocol methode voor het genereren van...

De productie van transgene Xenopus laevis Door restrictie-enzym Mediated Integratie en nucleaire transplantatie

We beschrijven methoden om onrijpe eicellen van Xenopus laevis te manipuleren, in vitro rijping van eicellen tot eieren, en intracytoplasmatische sperma-injectie. Dit protocol maakt degradatie van sommige maternale eiwitten en overexpressie van interessante genen bij bevruchting mogelijk, en is daarom waardevol om de rollen van specifieke factoren in de vroege embryonale ontwikkeling te bestuderen.

Manipulatie en<em&gt; In Vitro</em&gt; Rijping van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eicellen, Gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling

In Xenopus embryo's, cellen van het dak van de blastocoel zijn pluripotent en kunnen worden geprogrammeerd om verschillende weefsels te genereren. Hier beschrijven we protocollen om uitstrijkjes van de amfibische blastocoel-dak als een assaysysteem te gebruiken om belangrijke in vivo en in vitro kenmerken van vroege neurale ontwikkeling te onderzoeken.

Stamcelachtige<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantaten om te studeren Early Neural Developmental Kenmerken<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Geoptimaliseerde procedures voor de isolatie van enkele follikels, cytoplasmatische RNA-microinjecties, het verwijderen van omliggende cellagen en eiwitexpressie in Xenopus eicellen worden beschreven. Daarnaast wordt een eenvoudige methode gepresenteerd voor snelle oplossingsveranderingen in elektrofysiologische experimenten met ligand-gebonden ionenkanalen.

Xenopus Eicellen: Geoptimaliseerd Methoden voor Micro-injectie, Verwijdering van folliculaire Lagen en Fast Solution Veranderingen in elektrofysiologische experimenten

Genen essentieel voor overleving vormen technische hindernissen voor het maken van mutant lijnen. Sprongen omzeilt letaliteit door het combineren van genoom bewerken met primordiale geslachtscellen transplantatie wild-type dieren uitvoering germline mutaties maken. Sprongen maakt ook de efficiënte generatie homozygoot null mutanten in de F1 generatie. Hier, wordt de transplantatie stap aangetoond.

Primordiale geslachtscellen transplantatie voor CRISPR/Cas9 gebaseerde sprongen in Xenopus

Door encapsulating ei extracten van Xenopus laevis in water-in-olie micro presenteren we een methode voor het genereren van in vitro zichzelf onderhoudende mitotische oscillaties op het niveau van eencellige.

Reconstructie van de celcyclus oscillaties in Micro van cel-vrije Xenopus ei extracten

Dit artikel is bedoeld om het gebruik van parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen aan te tonen als vervanging voor sperma voor de bouw van semi-gekloonde embryo's.

Toepassing van muis parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen als een substituut van sperma

Embryologische manipulaties zoals uitroeiing en transplantatie van cellen zijn belangrijke hulpmiddelen om vroege ontwikkeling te bestuderen. Dit protocol beschrijft een eenvoudig en effectief transplantatieapparaat om deze manipulaties uit te voeren in zebravisembryo's.

Een eenvoudig en effectief transplantatieapparaat voor zebravisembryo's

Leer functioneel klonen met het Xenopus eicel-expressiesysteem om genproducten te identificeren die inductieve reacties in ectoderm veroorzaken. Deze methode ondersteunt onderzoek naar genregulatie in de ontwikkelingsbiologie.

Functionele klonen behulp van een

Meer video's verkennen