Functionele klonen behulp van een Xenopus Eicel Expression System
January 30th, 2016
We beschrijven een Xenopus eicel en dierlijk kapsysteem voor de expressie-klonering van genen die in staat zijn om een respons te induceren in competent ectoderm, en bespreken technieken voor de daaropvolgende analyse van dergelijke genen. Dit systeem is nuttig bij de functionele identificatie van een breed scala aan genproducten.
Het algemene doel van deze procedure is om een Xenopus-eicel, een dierlijk dopje-systeem, te demonstreren dat geschikt is voor de identificatie van genproducten die in staat zijn om een respons te induceren in competent ectoderm. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontwikkelingsbiologie, zoals welke genen nodig zijn om een inductieve respons op te wekken. Het grote voordeel van deze techniek is het gebruik van de Xenopus-eicel als expressiesysteem om inductoren te produceren en te identificeren die op een doelweefsel inwerken, of zelfs genen die stroomopwaarts van inductoren werken.
Visuele demonstratie van deze methode is uiterst nuttig, omdat de dissectie- en recombinatiestappen sterk fase-afhankelijk zijn en een verfijnde techniek vereisen. Na het verzamelen van ovariumweefsel van onder narcose gebrachte vrouwelijke kikkers, scheurt u het weefsel in kleine stukken, elk met ongeveer 10 tot 20 eicellen. Breng deze fragmenten eerst over naar verse OR2-oplossing en vervolgens naar OR2-bevattende 2,0 milligram per milliliter collagenase A. Roer het weefsel bevattende mengsel gedurende één uur zachtjes op een shaker.
Breng vervolgens de fragmenten over naar verse collagenase-oplossing en schud nog een uur. Verwacht aan het einde van deze behandeling gedeflocculeerde eicellen te zien. Was de eicellen vervolgens 10 keer in compleet OR2 en vervolgens twee keer in eicelcultuurmedium, afgekort als OCM.
Plaats daarna de eicellen in vers OCM en inspecteer ze visueel onder een dissectiemicroscoop. Isoleer die in stadium zes door de kleinere, onrijpe eicellen weg te gooien. Plaats vervolgens de eicellen in een met agarose beklede petrischaal bevattende OCM en bewaar ze bij 18 tot 20 graden Celsius tot injectie.
Om voorbereiding op micro-injectie te maken, plaats u glas capillaire buizen in een naaldtrekker, trekt hem uit en breekt vervolgens de uiteinden van het glas af om naalden van ongeveer 20 micrometer in diameter te maken. Meet de naalduiteinden op een samengestelde microscoop met een gekalibreerd oculaire micrometer. Duw vervolgens klei in een uniforme laag op de bodem van een 35 bij 10 millimeter petrischaal.
En creëer vervolgens parallelle groeven in deze laag, met behulp van een malvormige sonde-achtige tool. Vul de met klei beklede schaal met ongeveer 2 milliliter 3% Ficoll in 1x gemodificeerd Barth's-zout, of MBS. Breng vervolgens de eicellen over naar deze oplossing, met behulp van een breedbuisige pipet.
Plaats de eicellen in de groeven zodat ze tijdens de daaropvolgende micro-injectie op hun plaats worden gehouden. Gebruik een micro-injector om een naald te vullen met ongeveer twee microliter van een eerder gegenereerd pool van mRNA en pas de balans aan om lichte positieve druk te produceren, wat voorkomt dat het cytoplasma van de eicel in de naald wordt gezogen tijdens de injectie. Injecteer vervolgens elke eicel met 20 nanoliter RNA in het equatoriale gebied.
Laat vervolgens de eicellen een uur in de Ficoll MBS en breng ze vervolgens voorzichtig over naar 1x MBS. Ga door met het incuberen van de eicellen gedurende acht tot 24 uur bij 20 graden Celsius. Om de dierlijke dop-test te beginnen, verzamelt u 3/4x normaal amfibieënmedium, afgekort als NAM-oplossing, fijne pincetten, een haarlus, eerder geïnjecteerde eicellen en xenopus-embryo's in stadium 11 tot 11,5.
Breek vervolgens glazen deksels in fragmenten van ongeveer één millimeter bij twee millimeter groot en passeer deze stukken door een vlam tot de randen glad en getrokken zijn. Druk vervolgens klei in een enkele laag in een schaal, zoals eerder beschreven. Gebruik een mal sonde om individuele komvormige impressies in deze coating te maken.
Ga door met het vullen van de schaal met ongeveer twee milliliter 3/4x NAM. En breng de geïnjecteerde eicellen over naar deze oplossing, waarbij u ervoor zorgt dat er meerdere in een enkele indruk worden geïmmobiliseerd. Om de embryo's klaar te maken, brengt u ze over in een schaal bevattende 3/4x NAM-oplossing.
Selecteer een subset van gastrula's om als stadia-controle voor de leeftijd van het ectoderm te worden gebruikt en breng ze over naar een andere schaal bevattende dezelfde oplossing. Zet deze plaat opzij. Voor embryo's die zullen worden gebruikt in de dierlijke dop-assay, verwijdert u hun vitelline membranen met twee paar fijne pincetten.
Breng vervolgens de gastrula's over naar de met klei beklede schaal met de eicellen. Om te beginnen, snijdt u de dierlijke kappen van de embryo's met twee paar fijne pincetten, waarbij u voorzichtig bent om het equatoriale weefsel te vermijden. Om recombinanten te genereren met behulp van de eerste methode, positioneert u een dierlijke kap zodat het binnenoppervlak contact maakt met de dierlijke hemisfeer van een eicel, die al in een indruk is gepositioneerd.
En herhaal dit proces voor verschillende van de geïnjecteerde eicellen. Om ervoor te zorgen dat deze recombinanten bij elkaar worden gehouden, plaatst u een gebogen fragment van een glasdeksel bovenop elk van hen en oefent u naar beneden drukken uit totdat het dier is afgeplat en het deksel contact maakt met de klei. Om recombinanten te genereren met behulp van de tweede methode, plaatst u dierlijke kappen en eicellen samen in lege individuele indrukken in de klei.
En zorg ervoor dat de binnenoppervlakken van de dierlijke kappen naar de eicel gericht zijn. Bevestig vervolgens de twee weefsels samen met kleine uitsteeksels van klei. Zodra er meerdere recombinanten zijn gegenereerd met behulp van een van beide methoden, kweekt u deze en de opzij gezette controle-embryo's bij 20 graden Celsius.
Wanneer de controle-embryo's het gewenste stadium bereiken, verwijdert u de deksels van de recombinanten en isoleert u de dierlijke dop-ectoderm met behulp van pincetten en een haarlus. Fixeer vervolgens beide ectodermfragmenten en controle-embryo's gedurende één
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een Xenopus-oöcyt en dierenkap-systeem voor de expressie-klonen van genen die responsen induceren in competent ectoderm. De methode is bijzonder nuttig voor het identificeren van genproducten en het analyseren van hun functies in de ontwikkelingsbiologie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Genexpressie
- Functionele genoomkunde
Achtergrond
- Xenopus-oöcyten zijn een waardevol model voor het bestuderen van genfunctie.
- Het dierenkap-systeem maakt de analyse van inductieve responsen in ectoderm mogelijk.
- Het begrijpen van geninteracties is cruciaal voor ontwikkelingsprocessen.
- Visuele technieken zijn essentieel vanwege de complexiteit van het dissectieproces.
Doel van de studie
- Om genen te identificeren die responsen in ectoderm induceren.
- Om de mechanismen van genwerking in ontwikkelingscontexten te verkennen.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor genproductanalyse.
Gebruikte methoden
- Verzameling van ovariumweefsel van verdoofde vrouwelijke kikkers.
- Dissectie van weefsel in kleine fragmenten die oöcyten bevatten.
- Gebruik van collagenase A om de isolatie van oöcyten te vergemakkelijken.
- Beweging van weefselmengsels om de oöcytenrecuperatie te verbeteren.
Belangrijkste resultaten
- Het Xenopus-oöcytsysteem identificeert effectief geninductoren.
- Getoonde technieken maken nauwkeurige manipulatie van ectodermweefsels mogelijk.
- Visuele hulpmiddelen verbeteren het begrip van de experimentele procedures.
- Resultaten dragen bij aan de bredere kennis van ontwikkelingsgenregulatie.
Conclusies
- Het Xenopus-oöcytsysteem is een krachtig hulpmiddel voor genexpressiestudies.
- Het identificeren van inductoren kan leiden tot inzichten in de ontwikkelingsbiologie.
- Toekomstig onderzoek kan op deze methoden voortzetten voor verdere ontdekkingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables functional screening of gene products that elicit inductive responses in competent ectoderm, supporting target validation in developmental pathways. By linking molecular overexpression to phenotypic readouts in a tissue context, it provides mechanistic de-risking for early-stage target hypotheses. The Xenopus oocyte expression system offers a scalable platform for identifying paracrine, juxtacrine, or transcriptional regulators relevant to signal transduction cascades.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether candidate genes can induce a specific developmental response in naïve tissue.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of cDNA libraries using a quantitative readout (foxe3 expression) to prioritize functional hits.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by distinguishing inducers acting directly on target cells from those requiring upstream regulators or binding partners.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated biological systems (oocyte-animal cap recombinants) for downstream assay standardization and reproducibility testing.
- Operational Value: Facilitates preparation of inducible tissue models suitable for high-content screening of signaling modulators or pathway inhibitors.
- Scientific Value: Enables measurement of ligand-independent or juxtacrine signaling activities not captured in soluble factor assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Assesses developmental progression following target overexpression or knockdown, informing phenotypic consequence and pathway placement.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system (ectodermal competence) for evaluating target modulation in a physiological context.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by correlating molecular perturbation with early lineage marker induction (e.g., foxe3).
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation to lead identification, particularly for targets operating via extracellular or juxtacrine mechanisms.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of gene function by measuring inductive capacity in competent ectoderm, clarifying pathway roles and reducing mechanistic ambiguity.
- Screening: Produces standardized, quantifiable outputs (percentage of animal caps expressing foxe3) that support assay reproducibility and hit confirmation across screening campaigns.
- Analytics: Delivers functional readouts based on spatial and temporal marker expression, enabling comparison of inducer potency and structure-activity relationships.
- Translational Research: Connects early gene discovery to phenotypic outcomes in developing tissue, supporting risk-adjusted advancement decisions based on inductive fidelity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening diverse cDNA or ORF libraries against multiple inductive phenotypes in ectoderm or other competent tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking genotype to inductive phenotype in a tissue-based functional assay.
- Operational Value: Promotes standardization through defined oocyte preparation, mRNA injection, and co-culture parameters, enhancing cross-lab reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by filtering targets based on demonstrable inductive capacity, reducing investment in non-functional candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets demonstrating consistent lens-inductive or ectopic tissue responses across biological replicates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Xenopus embryology, microsurgery, and mRNA handling for successful oocyte isolation and injection.
- Dependent on instrumentation for microinjection, agarose plate preparation, and fluorescence or chromogenic detection of marker expression.
- Necessitates cross-team standardization of embryo staging, animal cap isolation, and fixation protocols to ensure assay consistency.
- Adaptation to other model systems may require optimization of co-culture conditions and tissue competence windows.
- Practical limitations include the low throughput of manual recombinant assembly and the stage-specific nature of ectodermal competence.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Preparation of Oocytes
2:21
Injection of Library Transcripts
4:08
Preparing the Animal Cap Asssay
5:48
Generation and Culture of Recombinants
7:35
Results: Identification of a Gene Product that Elicits a Lens-Inductive Response in Animal Cap Ectoderm
9:11
Conclusion
