Radioactief en kwantificering van cellulaire niveaus van fosfoinositiden door High Performance Liquid Chromatography-gekoppeld Flow Scintillation
January 6th, 2016
Phosphoinositides signaleren lipiden waarvan de relatieve abundantie snel verandert in reactie op verschillende stimuli. Dit artikel beschrijft een methode om de overvloed aan phosphoinositides meten door metabolisch labelen van cellen met 3H-myo-inositol, gevolgd door extractie en deacylering. Geëxtraheerd glycero-inositiden omgezet worden vervolgens gescheiden door hoge-prestatie vloeistofchromatografie en gekwantificeerd door flow scintillatieteller.
Het algemene doel van deze procedure is om de hoeveelheid van elke fosfo-inositiedensoort in cellen te meten onder verschillende genetische en omgevingscondities om de functie en regulatie van fosfo-inositiden te begrijpen. Fosfo-inositiden lipiden controleren celfuncties zoals migratie, replicatie en geheugenverkeer. Deze methode identificeert genetische en omgevingscondities die fosfo-inositiden beïnvloeden en vergroot onze kennis over hun regulatie en functie.
Het grote voordeel van deze techniek is dat het nauwkeurige, gelijktijdige meting van alle fosfo-inositiden in cellen mogelijk maakt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de regulatie van fosfo-inositiden in gisten, kan het ook worden toegepast op gekweekte zoogdiercellen. Personen die nieuw zijn met deze methode zullen worstelen vanwege de vele stappen die nodig zijn voor labeling, verwerking en analyse.
We raden aan om eerst te oefenen zonder het radioactieve label. Om te beginnen, kweek een 20 milliliter vloeibare cultuur van de gistaand SEY6210, in compleet synthetisch medium bij 30 graden Celsius met constant schudden tot mid-log fase. Breng vervolgens een totaal van 10 tot 14 OD van de gistencellen over naar een 12 milliliter centrifugeerbuis met ronde bodem en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 800 keer G.
Decanteer het medium. En suspendeer het pellet opnieuw in 2 milliliter inositol-vrij medium. Centrifugeer de cellen opnieuw.
En suspendeer vervolgens het pellet in 440 microliters inositol-vrij medium. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Na de incubatie, voeg 60 microliters tritium-gelabelde myo-inositol toe en laat de cellen gedurende één tot drie uur groeien bij 30 graden Celsius met constant schudden.
Breng de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis met 500 microliters 9% perchloorzuur en 200 microliters zuur-gewassen glaskralen. Meng door de buis herhaaldelijk te keren en incubeer vervolgens gedurende vijf minuten op ijs. Daarna vortex de buis op maximale snelheid gedurende 10 minuten.
Breng vervolgens het lysate over naar een nieuwe microcentrifugebuis met behulp van een gel-laadtip om te voorkomen dat de glaskralen worden aangezogen. Centrifugeer de buis vervolgens en gooi het supernatant weg. Soniceer het pellet in één milliliter ijskoud 100 millimolair EDTA tot het volledig is verspreid, en centrifugeer opnieuw.
Na het centrifugeren, aspireer de EDTA uit de buis met het radioactief gelabelde pellet. Voeg 50 microliters water toe en soniceer om het pellet opnieuw te suspenderen. Bereid vers deacylatiereiniging volgens het tekstprotocol voor.
Voeg vervolgens 500 microliters van het deacylatiereiniging toe aan de buis en soniceer om te mengen. Incubeer het monster gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Breng vervolgens het monster over naar een verwarmingsblok bij 53 graden Celsius gedurende 50 minuten.
Plaats vervolgens het monster in een vacuümcentrifuge en laat het minimaal drie uur drogen. Suspendeer het pellet opnieuw door soniceren in 300 microliters water en incubeer het gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Droog daarna het monster volledig in een vacuümcentrifuge gedurende minimaal drie uur.
Na het drogen, voeg 450 microliters water toe aan de buis en suspendeer het pellet door soniceren tot het volledig is verspreid. Bereid vers extractiereiniging volgens het tekstprotocol voor. Voeg 300 microliters extractiereiniging toe en vortex gedurende vijf minuten op maximale snelheid.
Centrifugeer de buis gedurende twee minuten bij 18000 keer G en pipet de onderste waterige laag voorzichtig in een nieuwe buis. Droog vervolgens de laatste waterige fractie door vacuümcentrifugering gedurende minimaal drie uur. Disperseer vervolgens het pellet volledig door soniceren in 50 microliters water en bewaar het monster bij 20 graden Celsius.
Bepaal ten slotte de radioactiviteit van het monster door twee microliters toe te voegen aan vier milliliter scintillatievloeistof in een 6 milliliter polyethyleen scintillatieflesje. Neem de CPM van de fles op met behulp van een vloeistofscintillatieteller met een open venster. Om het HPLC-systeem in te stellen voor scheiding van de tritium-gelabelde glycero-inositiden, bereid eerst buffers A en B en chromatografiekolom volgens het tekstprotocol voor.
Laad vervolgens 10 miljoen CPM van het monster in een injectiebuisje van twee milliliter, voorzien van een veerbelaste 250 microliter inzet, en voeg water toe voor een totaal volume van 55 microliters. Sluit de buis af met een schroefdop voorzien van een PTFE siliconen septum en plaats het in de automatische bemonsteringslade van het HPLC-systeem, samen met een water-blank in een vergelijkbaar buisje. Gebruik de software op het HPLC-systeem om een elutieprotocol te programmeren.
Een procent buffer B gedurende vijf minuten, een tot 20 procent B gedurende veertig minuten, 20 tot 100 procent B gedurende tien minuten, 100%B gedurende vijf minuten, 100 tot één procent B gedurende twintig minuten, en vervolgens één procent B gedurende tien minuten. Stel de pompstroomsnelheid in op 1,0 milliliter per minuut gedurende 90 minuten en de drukgrens op 400 bar. Volg dit door een detectieprotocol in te stellen op de flow scintillator om 60 minuten te lopen, met een scintillatievloeistof stroomsnelheid van 2,5 per minuut en een verblijfstijd van 8,57 seconden.
Programmeer vervolgens een geautomatiseerde injectiesequentie op de HPLC om te beginnen met de water-blank die het evenwichtsprotocol uitvoert, gevolgd door het radioactief gelabelde monster op het elutieprotocol. Voordat het evenwichtsprotocol is voltooid, creëer een batchsequentie op de flow scintillator om alle monsters te meten met behulp van het detectieprotocol, dat wordt geactiveerd door het elutieprotocol. Om de HPLC-gegevens te analyseren, opent u eerst het ruwe gegevensbestand voor elk monster met behulp van de chromatograafkwantificeringssoftware.
In het chromatogrammentabblad, zoom in om de kleinere pieken te strekken terwijl de tijdresolutie wordt gehandhaafd. Gebru
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het meten van de abundantie van fosfo-inositiden in cellen door ze metabolisch te labelen met 3 H-myo-inositol. De techniek omvat extractie, deacylatie en hoogprestatievloeistofchromatografie voor kwantificering.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Biochemie
Achtergrond
- Fosfo-inositiden zijn cruciale signaallipiden.
- Hun abundantie verandert als reactie op verschillende stimuli.
- Ze spelen rollen in celfuncties zoals migratie en geheugenverkeer.
- Het begrijpen van hun regulatie is essentieel voor inzichten in cellulaire processen.
Doel van het onderzoek
- Om fosfo-inositidensoorten onder verschillende omstandigheden te meten.
- Om genetische en omgevingsfactoren te identificeren die fosfo-inositiden beïnvloeden.
- Om het begrip van de functie en regulatie van fosfo-inositiden te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Metabolische labeling van cellen met 3 H-myo-inositol.
- Extractie en deacylatie van glycero-inositiden.
- Afscheiding van geëxtraheerde lipiden door hoogprestatievloeistofchromatografie.
- Kwantificering met behulp van flow scintillatie.
Belangrijkste resultaten
- Accurate meting van alle fosfo-inositidensoorten in cellen.
- Identificatie van omstandigheden die fosfo-inositidenniveaus beïnvloeden.
- Inzichten in de regulatie van fosfo-inositiden in gist- en zoogdiercellen.
- Mogelijke uitdagingen voor nieuwe gebruikers vanwege de complexiteit van de methode.
Conclusies
- De methode biedt waardevolle inzichten in de regulatie van fosfo-inositiden.
- Het kan worden toegepast op verschillende celtypen, waardoor het nut ervan wordt vergroot.
- Verder onderzoek kan voortbouwen op deze techniek om cellulaire signalering te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of phosphoinositide species enables mechanistic de-risking in early discovery by linking lipid signaling dynamics to cellular phenotypes such as migration and replication. This method supports target validation by providing quantitative, condition-dependent readouts that clarify pathway involvement and regulatory mechanisms. Concurrent measurement of all seven phosphoinositides enhances predictive confidence in lead identification and preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying how genetic or environmental perturbations affect specific phosphoinositide pools.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for assessing lipid-mediated target engagement across experimental conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying conditions that significantly alter phosphoinositide signaling linked to disease-relevant phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, HPLC-resolved readouts that enable assay standardization for compound screening in lipid signaling pathways.
- Operational Value: Produces reproducible extraction and deacylation steps suitable for adaptation to high-throughput formats.
- Assay Readiness: Delivers normalized, background-subtracted peak areas that allow direct comparison of phosphoinositide levels between control and treated samples.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by connecting changes in phosphoinositide abundance to cellular functions like memory trafficking and replication.
- Translational Continuity: Enables cross-species application from yeast to mammalian cells, supporting extrapolation of target validation data.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria by quantifying lipid signaling changes that correlate with phenotypic outcomes in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early hypothesis screening to lead optimization, where quantitative lipid signaling data informs target confidence and pathway selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how genetic knockouts or chemical treatments alter specific phosphoinositide species.
- Screening: Enables assay development through standardized extraction, HPLC separation, and flow scintillation detection of radiolabeled glycero-inositides.
- Analytics: Generates peak area data that, after background subtraction and normalization, allows comparison of lipid levels across conditions.
- Translational Research: Connects lipid signaling changes to phenotypic outcomes in disease models, supporting biomarker alignment and mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for quantifying phosphoinositide dynamics in diverse cell types under varying experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing ambiguity in lipid signaling mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized precipitation, deacylation, extraction, and HPLC-flow scintillation protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in phosphoinositide-regulated pathways.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking lipid signaling changes to functional readouts in preclinical systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radiolabel handling, lipid extraction, and HPLC operation.
- Depends on access to scintillation counters, vacuum centrifuges, and HPLC systems with flow scintillation detection.
- Necessitates standardization of labeling duration, cell density, and deacylation conditions across experiments.
- Involves adaptation considerations when transferring from yeast to mammalian cell systems due to differences in lipid metabolism.
- Involves practical limitations including radioactivity safety protocols, multi-day processing time, and loss of acyl chain structural information.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Yeast Cell Culture and Radiolabeling of Phosphoinositides
2:58
Deacylation and Extraction of the Radiolabeled Phosphoinositides
5:14
Separation of Tritium-labeled Glycero-inositides by High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
7:15
Data Analysis
8:55
Results: HPLC Analysis of Radiolabeled Phosphoinositides
9:55
Conclusion
