Name: Een studie van de Complexatie van Mercury (II) met Dicysteinyl tetrapeptiden door electrospray ionisatie massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-08T13:00:01.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Leer de karakterisatie van kwik(II)-dicysteïnyl tetrapeptide-complexen met behulp van elektrospray-ionisatie-orbitrap-massaspectrometrie. Deze methode maakt analyse van metaalcomplexen mogelijk met minimale fragmentatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MN-S erkent steun van de National Science Foundation, RUI verlenen CHE 1011859. De auteurs dankbaar erkennen de Triade Massaspectrometrie Facility aan de Universiteit van North Carolina in Greensboro voor het gebruik van de Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL massaspectrometer. De auteurs danken Daniel Todd, Vincent Sica en Brandie Erhmann aan de Universiteit van North Carolina in Greensboro voor nuttige suggesties en opmerkingen met betrekking tot dit werk.

Opmerking: alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) te raadplegen voor gebruik. Kwik chloride is een giftige chemische stof. Persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, veiligheidsbril en laboratoriumjas) moet gedragen worden bij af te voeren en alle bijbehorende oplossingen. Gooi oplossingen duidelijk gelabeld chemisch afval flessen aangewezen voor zware metalen. 1. Bereiding van 5 mM Ontgaste ammoniumformaatbuffer, pH 7,5 <ol><li> Oplossen in 450 ml HPLC kwaliteit water 0,1576 g ammoniumformiaat buffer. Stel de pH van de bovenstaande oplossing met 1 M mierenzuur en 1 M ammoniumhydroxide tot 7,5. Breng deze oplossing over in een maatkolf van 500 ml en voeg HPLC water om de kalibratie lijn naar een 5 mM ammoniumformiaatoplossing maken. </li><li> Ontgas de 5 mM ammoniumformaatbuffer onder vacuum voor 10 min en spoelen met argon. Tweemaal herhalen en opslag oplossing onder argon. Op de dag van gebruik, filteren de buffer oplossing door een filter van 0,2 micron before gebruik. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Mercury (II) Chloride Solutions <ol><li> Weeg 0,2375 g kwik (II) chloride. Oplossen in 25 ml van 5 mM ammoniumformaatbuffer een 0,035 M kwik (II) chloride oplossing leidt. </li><li> Voeg 0,214 ml van 0,035 M kwik (II) chloride-oplossing met 9,785 ml van 5 mM ammoniumformaatbuffer een 7,5 x 10 -4 M oplossing te creëren. Deken van de 7,5 x 10 -4 M kwik (II) oplossing met argon gas. </li></ol> 3. Bereiding van CGGC voorraadoplossing <ol><li> Los 2,0 mg van het tetrapeptide dicysteinyl, CGGC in 0,118 ml HPLC kwaliteit acetonitril en voeg 1,0647 ml van 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer die werd ontgast in argon tot een 5 mM voorraadoplossing CGGC verkregen. </li><li> Voeg 225 ul van 5 mM CGGC stockoplossing aan 1.275 ui 5 mM ammonium vorming pH 7,5 buffer tot een 7,5 x 10 -4 M CGGC oplossing. </li></ol> 4. VoorbereidingVerschillende reactiemengsels van kwik (II) en CGGC <ol><li> Bereiding van 1: 0,5 verhouding van kwik (II): CGGC oplossing <ol><li> Plaats 255 pl 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 30 ul van 7,5 x 10 -4 M kwik (II) chloride-oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis met ammoniumformiaat buffer. </li><li> Vortex de oplossing gedurende 10 sec. Voeg dan 15 pi van 7,5 x 10 -4 M CGGC oplossing in de 1,5 ml microcentrifuge. Vortex de oplossing gedurende 10 sec. Laat de oplossing gedurende 10 minuten staan ​​vóór injectie in de massaspectrometer. </li></ol></li><li> Bereiding van 1: 1 verhouding van kwik (II): CGGC oplossing <ol><li> Plaats 240 pl 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 30 ul van 7,5 x 10 -4 M kwik (II) chloride-oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis met ammoniumformiaat buffer. </li><li> Vortex de oplossing gedurende 10 sec. DanVoeg 30 ul van 7,5 x 10 -4 M CGGC oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal op dezelfde wijze als beschreven in paragraaf 4.1. </li></ol></li><li> Bereiding van 1: 2 verhouding van kwik (II): CGGC oplossing <ol><li> Plaats 210 pl 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 30 ul van 7,5 x 10 -4 M kwik (II) chloride-oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis met ammoniumformiaat buffer. </li><li> Vortex de oplossing gedurende 10 sec. Voeg vervolgens 60 ul van 7,5 x 10 -4 M CGGC oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal op dezelfde wijze als beschreven in paragraaf 4.1. </li></ol></li></ol> 5. Voorbereiding van de LMOE Stock Solution <ol><li> Los 3,5 mg van het tetrapeptide dicysteinyl, LMOE in 0,145 ml HPLC kwaliteit acetonitril aan het peptide te lossen. Voeg 13,067 ml van 5 mM ammoniumformiaat Dan, pH 7,5 buffer die is ontgast argon produceren 0,5 mM LMOE oplossing. </li><li> Vortex de oplossing totdat al peptide wordt opgelost. Voeg 1,125 ml 0,5 mM LMOE-oplossing en 0,375 ml van 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer tot een 1,5 ml microcentrifugebuis een 7,5 x 10 -5 M LMOE oplossing. Vortex tot gemengd. </li></ol> 6. Voorbereiding van de verschillende reactiemengsels van Mercury (II) en LMOE Solution <ol><li> Bereiding van 1: 0,5 verhouding van kwik (II): LMOE oplossing <ol><li> Plaats 255 pl 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 30 ul van 7,5 x 10 -4 M kwik (II) chloride-oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis met ammoniumformiaat buffer. </li><li> Vortex de oplossing gedurende 10 sec. Voeg vervolgens 15 ul van 7,5 x 10 -4 M MOEL oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal op dezelfde wijze als beschreven in paragraaf 4.1. </li></ol></li><li> Bereiding van 1: 1 verhouding van kwik (II): LMOE oplossing <ol><li> Plaats 24081, l van 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 30 ul van 7,5 x 10 -4 M kwik (II) chloride-oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis met ammoniumformiaat buffer. </li><li> Vortex de oplossing gedurende 10 sec. Voeg vervolgens 30 ul van 7,5 x 10 -4 M MOEL oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal op dezelfde wijze als beschreven in paragraaf 4.1. </li></ol></li><li> Bereiding van 1: 2 verhouding van kwik (II): LMOE oplossing <ol><li> Plaats 210 pl 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 30 ul van 7,5 x 10 -4 M kwik (II) chloride-oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis met ammoniumformiaat buffer. </li><li> Vortex de oplossing gedurende 10 sec. Voeg vervolgens 60 ul van 7,5 x 10 -4 M MOEL oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal op dezelfde wijze als beschreven in paragraaf 4.1. </li></ol></li></ol> 7. Analyzing de reactiemengsels van Mercury (II) en CGGC Monsters door Orbitrap ESI massaspectrometrie <ol><li> De voorbereiding van de ESI massaspectrometer 16 <ol><li> Teken 100 ul kalibratienormen in een 500 ul glazen spuit. </li><li> Plaats de spuit in de spuit bakermat van de MS pomp, sluit de buis, en injecteer in de massa spectrofotometer. </li><li> Stel de bestandsnaam van de run door het selecteren van het pictogram van het bestand en het typen van de bestandsnaam. </li><li> Selecteer verwerven gegevens knop in de data-acquisitie module en het verzamelen van 150 scans. </li><li> Analyseer het chromatogram de kalibratienormen controleren door het openen dataverwerkingsmodule van de software. Open de module, ga naar het menu Bestand en selecteer &quot;open&quot; en selecteer het bestand in het dialoogvenster. Controleer dat de pieken in het chromatogram correleren met de massa&#39;s van de standaarden in rekening. </li><li> Reinig de 500 ul glazen spuit door het opstellen van 500 pi HPLC kwaliteit methanol en vervolgens afzien van de methanol in een bekerglas. </li><li> Opstellen van 500 pi van HPLC-kwaliteit methanol in het glas spuit en spoel het systeem per stap 7.1.2. </li><li> Selecteer de methode setup module van de software om de parameters. Kies de scan mode menu en identificeren van de analysator als FTMS, en klik vervolgens op &quot;OK&quot;. Dan door te klikken op de verschillende iconen op het real-time overzicht spectrum pagina, stel de volgende parameters: schede gasstroom: 10, Bron temperatuur: 0, capillaire spanning: 37 V, Tube lens: 95 V, Spray spanning: 4,20 kV , debiet 10,00 pl / min, Analyzer: FTMS, Aantal scans: 150. </li></ol></li><li> Running CGGC samples op ESI massaspectrometer <ol><li> Voer het 5 mM ammoniumformiaat pH 7,5 buffer. <ol><li> Plaats 500 pi van 5 mM ammoniumformiaat buffer in de 500 pi glas spuit, plaats deze in de spuit bakermat van de MS-pomp, en bevestig de slang. </li><li> Lopen buffer door de slang voor 1-2 min. </li><li> Stel de bestandsnaam van de rundoor het selecteren van het pictogram van het bestand en het typen van de bestandsnaam. </li><li> Selecteer verwerven gegevens knop in de module en het verzamelen van 150 scans. </li><li> Klik op de run knop om collectie te stoppen na 150 scans worden verzameld. </li><li> Open de data browser module, ga dan naar het menu Bestand en selecteer &quot;open&quot; en selecteer het bestand in het dialoogvenster. Controleer of er geen pieken op 483, 683, 1163 en 1363 m / z aanwezig dat het peptide of kwik (II) peptide complexen lijken zijn. </li></ol></li><li> Start het 1: 0,5 kwik (II): CGGC verhouding oplossing. <ol><li> Plaats 250 pl van 1: 0,5 kwik (II): CGGC verhouding van het monster in de spuit. </li><li> Plaats de spuit in de spuit bakermat van de MS pomp, sluit de buis en prime het apparaat. </li><li> Selecteer een bestandsnaam voor de run door het selecteren van het pictogram van het bestand en het typen van de bestandsnaam. </li><li> Druk op de te verwerven gegevens knop in de data-acquisitie module en het verzamelen van 150 scans en klik op de run-knop om de collectie te stoppen. </li><li> Open de module, ga naar het menu Bestand en selecteer &quot;open&quot; en selecteer het bestand in het dialoogvenster. Controleer of het chromatogram bevat pieken waaronder de één voor de CGGC peptide alleen. </li><li> Was de spuit door opzuigen met 500 gl buffer ammoniumformiaat en vervolgens afgeven van de ammoniumformaatbuffer in een bekerglas. </li><li> Selecteert u de knop afval op het MS en spoel de slang drie keer met 500 ul ammoniumformaat buffer. </li><li> Was de spuit door opzuigen met 500 pl methanol en vervolgens afgeven van de methanol in een bekerglas. </li><li> Spoel de buis één keer met 500 pi methanol. </li><li> Select knop load detector op de MS. </li><li> Voeg 500 ul van ammoniumformiaat buffer op de spuit. </li><li> Plaats de spuit in de spuit bakermat van de MS pomp, sluit de buis en prime het apparaat. </li><li> Selecteer een bestandsnaam voor de buffer wordt beheerd door het selecteren van het pictogram van het bestand en het typen van de bestandsnaam. </li><li> Pershet verwerven data-knop en het verzamelen van 150 scans en klik vervolgens op de stop-run-knop. </li><li> Open de data browser module, ga naar het menu Bestand en selecteer &quot;open&quot; en selecteer het bestand in het dialoogvenster. Controleer of het chromatogram is leegte van pieken van de vorige Hg: CGGC run. </li></ol></li><li> Start het 1: 1 kwik (II): CGGC verhouding oplossing. <ol><li> Plaats 250 pl van 1: 1 kwik (II): CGGC verhouding monster in de spuit. </li><li> Herhaal op dezelfde wijze als beschreven voor stap 7.2.2.2 tot 7.2.2.15. </li></ol></li><li> Start het 1: 2 kwik (II): CGGC verhouding oplossing <ol><li> Plaats 250 pl van 1: 2 kwik (II): CGGC concentratie monster in de spuit. </li><li> Herhaal op dezelfde wijze als beschreven voor stap 7.2.2.2 tot 7.2.2.15. </li></ol></li></ol></li></ol> 8. Het analyseren van de reactiemengsels van Mercurius en LMOE Monsters door Orbitrap ESI massaspectrometrie <ol><li> Running LMOE samples op ESI massaspectrometer <ol><li> Herhaal analyseprocedure (Stappen 7,1-7,2) gebruikmakend LMOE monsters en reactiemengsels kwik (II) en LMOE in verschillende stoichiometrische verhoudingen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Clifton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mercury+exposure+and+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Clin.+N.+Am%22%5BJournal%5D)">Mercury exposure and public health.</a> Pediatr. Clin. N. Am. 54, 237-269 (2007).</li>
<li>Andersen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+Recent+Developments+in+Chelation+Treatment+of+Metal+Intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Principles and Recent Developments in Chelation Treatment of Metal Intoxication.</a> Chem. Rev. 99, 2683-2710 (1999).</li>
<li>Aposhian, H. V., Maiorino, R. M., Gonzalez-Ramirez, D., Zuniga-Charles, M., Xu, Z., Hurlbut, J. M., Junco-Munoz, P., Dart, R. C., Aposhian, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+heavy+metals+by+newer%2C+therapeutically+useful+chelating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mobilization of heavy metals by newer, therapeutically useful chelating agents.</a> Toxicology. 97, 23-38 (1995).</li>
<li>Flora, S. J. S., Pachauri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelation+in+Metal+Intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Environ.+Res.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Chelation in Metal Intoxication.</a> Int. J. Environ. Res. Public Health. 7, 2745-2788 (2010).</li>
<li>Campbell, J. R., Clarkson, T. W., Omar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+use+of+2%2C3-dimercaptopropane-1-sulfonate+in+two+cases+of+inorganic+mercury+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The therapeutic use of 2,3-dimercaptopropane-1-sulfonate in two cases of inorganic mercury poisoning.</a> JAMA. 256, 3127-3130 (1986).</li>
<li>Rooney, J. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+thiols%2C+dithiols%2C+nutritional+factors+and+interacting+ligands+in+the+toxicology+of+mercury%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">The role of thiols, dithiols, nutritional factors and interacting ligands in the toxicology of mercury.</a> Toxicology. 234, 145-156 (2007).</li>
<li>Lin, X., Brooks, J., Bronson, M., Ngu-Schwemlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evalution+of+the+association+of+mercury+%28II%29+with+some+dicysteinyl+tripeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evalution of the association of mercury (II) with some dicysteinyl tripeptides.</a> Bioorg. Chem. 44, 8-18 (2012).</li>
<li>Ngu-Schwemlein, M., Lin, X., Rudd, B., Bronson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+ESI+mass+spectrometric+analysis+of+the+association+of+mercury%28II%29+with+multi-cysteinyl+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and ESI mass spectrometric analysis of the association of mercury(II) with multi-cysteinyl peptides.</a> J. Inorg. Biochem. 133, 8-23 (2014).</li>
<li>Winther, J. R., Thorpe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+thiols+and+disulfides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et.+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Quantification of thiols and disulfides.</a> Biochimica et. Biophysica Acta. 1840, 838-846 (2014).</li>
<li>D'Agstino, A., Colton, R., Traeger, J. C., Cantry, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrospray+Mass+Spectrometric+Study+of+Organomercury+%28II%29+and+Mercuric+Interactions+with+Peptides+Involving+Cysteinyl+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">An Electrospray Mass Spectrometric Study of Organomercury (II) and Mercuric Interactions with Peptides Involving Cysteinyl Ligands.</a> Eur. Mass Spectrom. , 273-285 (1990).</li>
<li>Hofstadler, S. A., Sannes-Lowery, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+ESI-MS+in+drug+discovery%3A+interrogation+of+noncovalent+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Applications of ESI-MS in drug discovery: interrogation of noncovalent complexes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5, 585-595 (2006).</li>
<li>Rubino, F. M., Verduci, C., Giampiccolo, R., Pulvirenti, S., Brambilla, G., Columbi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Characterization+of+Homo-+and+Heterodimeric+Mercury+%28II%29-bis-thiolates+of+Some+Biologically+Relevant+Thiols+by+Electrospray+Ionization+and+Triple+Quadruple+Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Molecular Characterization of Homo- and Heterodimeric Mercury (II)-bis-thiolates of Some Biologically Relevant Thiols by Electrospray Ionization and Triple Quadruple Tandem Mass Spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 288-300 (2003).</li>
<li>Krupp, E. M., Milne, B. F., Mestrot, A., Meharg, A. A., Feldmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+into+mercury+bound+to+biothiols%3A+structural+identification+using+ESI-ion-trap+MS+and+introduction+of+a+method+for+their+HPLC+separation+with+simultaneous+detection+by+ICP-MS+and+and+ESI-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigation into mercury bound to biothiols: structural identification using ESI-ion-trap MS and introduction of a method for their HPLC separation with simultaneous detection by ICP-MS and and ESI-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390, 1753-1764 (2008).</li>
<li>Schaumlöffel, D., Tholey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+directions+of+electrospray+mass+spectrometry+for+elemental+speciation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent directions of electrospray mass spectrometry for elemental speciation analysis.</a> Anal. Bioanal. Chem. 400, 1645-1652 (2011).</li>
<li>Patiny, L., Borel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChemCalc%3A+a+building+block+for+tomorrow%27s+chemical+infrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Inf.+Model%22%5BJournal%5D)">ChemCalc: a building block for tomorrow's chemical infrastructure.</a> J. Chem. Inf. Model. 53, 1223-1228 (2013).</li>
<li>Thermo Scientific. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Xcaibur+Versions+2.1.0-2.3.0+Data+Acquisition+and+Processing+User+Guide.+Revision+E.+United+States%22">Xcaibur Versions 2.1.0-2.3.0 Data Acquisition and Processing User Guide. Revision E. United States</a>. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2012).</li>
<li>Falcone, G., Foti, C., Gianguzza, A., Giuffrè, O., Napoli, A., Pettignano, A., Piazzese, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestering+ability+of+some+chelating+agents+towards+methylmercury%28II%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sequestering ability of some chelating agents towards methylmercury(II).</a> Anal. Bioanal. Chem. 405 (2), 881-893 (2013).</li>
<li>Mah, V., Jalilehvand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+Complex+Formation+with+Mercury%28II%29+in+Aqueous+Solution+at+Physiological+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Glutathione Complex Formation with Mercury(II) in Aqueous Solution at Physiological pH.</a> Chem. Res. Toxicol. 23, 1815-1823 (2010).</li>
</ol>

Er is geen openbaarmaking voor het gerapporteerde werk.

De hydrofobe dicysteinyl tetrapeptide CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2, MW = 338) (figuur 1) vormt complexen met kwik (II) zoals in figuur 2 en tabel 1 Daarnaast vormt het peptide dimeren en trimeren. stapsgewijs de hoeveelheid peptide toename in het reactiemengsel. Zoals blijkt uit de m / z-waarden van de bijbehorende dimeren [(2M + H) + = 677] en trimeren [(3M + H) + = 1015], de t...

Huidige klinische geneesmiddelen voorgeschreven voor chelatietherapie van kwikvergiftiging1 bevatten thiolgroep(en), die verantwoordelijk zijn voor het binden en afscheiden van kwikionen2,3. Echter, studies hebben aangetoond dat deze kleine thiolverbindingen [dimerkaptozijnzuur (DMSA) en dimerkaproonzuur-sulfonzuur (DMPS)] niet optimaal zijn voor kwikchelatietherapie4-6. Daarom is er behoefte aan begrip van de associatie en complexvormingsneigingen van kwik met thiolen om het rationele ontwerp van thiolverbindingen voor kwikchelatie te verbeteren. Onlangs hebben we gerapporteerd dat n-alkyl en aryl dicysteinyl tripeptiden met dithiolgroepen kunnen dienen als effectieve "dubbele ankers" om de coördinatieplaatsen van kwik(II) te accommoderen om 1:1 kwik(II):peptide en 1:2 kwik(II):(peptide)2 complexen te vormen7. Bovendien hebben we het effect van toenemende cysteïneresiduen op complextypeformaties bestudeerd8. In deze studie onderzoeken we de associatie van kwik(II) met twee dicysteinyl tetrapeptiden, waarbij de cysteïneresiduen gescheiden zijn door twee aminozuurresiduen. Om het effect van auxiliaire bindingsgroepen voor kwik te evalueren, zijn de tussenliggende aminozuren ofwel twee glycine (ongesubstitueerd) residuen of twee glutaminezuur (gamma-gecarboxyleerd) residuen. 
De reactie van cysteïnepeptide met kwik(II) vereist omstandigheden die de oxidatie van de cysteïne thiolgroepen tot het vormen van disulfidebindingen voorkomen9. Bovendien is de associatie van kwik(II) met cysteïnepeptiden om verschillende typen kwik-peptide complexen te vormen afhankelijk van de initiële verhouding van kwik(II): peptide in de reactiemix7,8. De typen kwik-peptide complexen die in deze reactiemixturen worden gevormd, kunnen worden geanalyseerd door soft-ionisatie massaspectrometrie, een gevoelig analytisch hulpmiddel voor het bepalen van soortinteracties tussen metaalionen en peptiden10-14. Dienovereenkomstig zal het een profiel geven van de verschillende typen gemerkuurde peptide adducten die worden gevormd onder een gespecificeerde elektrospray ionisatieconditie. Hier zullen we laten zien hoe cysteïnepeptiden en kwik(II) chloride oplossingen kunnen worden bereid in ontgaste ammoniumformaatbufferoplossing, bedekt met argon om oxidatie te minimaliseren. Door variërende molequivalenten van kwik(II) te reageren met dicysteinyl tetrapeptiden, zullen we laten zien hoe de initiële verhouding van kwik(II):peptide een effect heeft op de typen gevormde complexen. We zullen ook laten zien hoe elektrospray ionisatie (ESI) massaspectrometrie kan worden gebruikt als karakteriseringstool om een nauwkeurige stoichiometrie van kwik naar peptide in de gevormde complexen te geven. Het bijbehorende videoprotocol zal de experimentele omstandigheden voor het bereiden van de kwikcomplexen, de procedure voor het analyseren van de reactiemixturen onder gespecificeerde elektrospray ionisatiecondities, en de karakterisering van de stoichiometrieën van kwik(II)-dicysteinyl tetrapeptide complexen demonstreren, gebaseerd op de verschillende kwikisotoopverdelingspatronen, door gebruik van het ChemCal programma15. Het is bedoeld om diegenen te helpen die geïnteresseerd zijn in het gebruik van ESI orbitrap massaspectrometrie om verschillende complexen te analyseren die worden gevormd door metaalionen die in verschillende isotopenvormen bestaan.

<table><tbody><tr><td>Kwik(II)chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>429724</td><td>Zeer giftig</td></tr><tr><td>Ammoniumformiaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516961</td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniak</td><td>Fisher</td><td>A512-P500</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-water</td><td>Fisher</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC acetonitril</td><td>Fisher</td><td>BP2405-1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC methanol</td><td>Fisher</td><td>A452-4</td><td></td></tr></tbody></table>

een studie van de complexatie van mercury (ii) met dicysteinyl tetrapeptiden door electrospray ionisatie massaspectrometrie

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

In deze studie hebben we een methode geëvalueerd voor de karakterisering van complexen, gevormd in verschillende relatieve verhoudingen van kwik(II) tot dicisteïnyl-tetrapeptide, door middel van elektrospray-ionisatie orbitrap massaspectrometrie. Deze strategie is gebaseerd op eerdere succesvolle karakterisering van kwik-dicisteïnyl-complexen betrokken bij tripeptiden door gebruik te maken van massaspectrometrie onder andere technieken. Kwik(II)chloride en een dicisteïnyl-tetrapeptide werden geïncubeerd in een ontgast gebufferd medium bij verschillende stoichiometrische verhoudingen. De gevormde complexen werden vervolgens geanalyseerd op een elektrospray-massaspectrometer bestaande uit een hybride lineaire ion- en orbi-trap massa-analyzer. De elektrospray-ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS) spectra werden verkregen in de positieve modus en de waargenomen pieken werden vervolgens geanalyseerd op distincte kwik-isotopenverdelingspatronen en geassocieerde mono-isotopische piek. Dit werk toont aan dat een nauwkeurige stoichiometrie van kwik en peptide in de complexen die gevormd worden onder specifieke elektrospray-ionisatieomstandigheden, kan worden bepaald door gebruik te maken van hoge resolutie ESI MS op basis van distincte kwik-isotopenverdelingspatronen.

<html> Een onderzoek werd uitgevoerd om de mogelijke kwik-peptidecomplex karakteriseren preparaat twee tetrapeptiden, CGGC en LMOE (figuur 1) van ESI massaspectrometrie. Complexen kwik (II) met CGGC of LMOE werden onderzocht door het laten reageren van het mengsel van kwik (II) en peptideoplossingen drie verschillende molaire verhoudingen: 1: 0,5, 1: 1 en 1: 2 (kwik (II): peptide) . De concentratie van kwik (II) was 7,5 x 10 -6 M en peptideconcentratie dienover...

De karakterisering van complexen die in verschillende relatieve verhoudingen van kwik(II) tot dicisteïnyl-tetrapeptiden worden gevormd, wordt gepresenteerd door middel van elektronenspray-ionisatie orbitrap massaspectrometrie.

Een studie van de Complexatie van Mercury (II) met Dicysteinyl tetrapeptiden door electrospray ionisatie massaspectrometrie

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van complexen van kwik en dicysteïnylpeptiden onder verschillende reactiestoichiometrieën, en het karakteriseren van de gevormde complexen middels electrospray-ionisatie en orbitrap-massaspectrometrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de complexatie-neigingen van kwik en thiolverbindingen, wat het rationele ontwerp van cheleerstoffen voor het sequesteren van kwikionen zal verbeteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de analyse van metaalioncomplexen met verwaarloosbare fragmentatie faciliteert.Andere voordelen omvatten het kenmerkende isotopische distributiepatroon van kwik. Het is eenvoudig om de lading toe te wijzen en overlappende pieken te analyseren via tandem-massaspectrometrie. Hoewel deze methode inzicht biedt in kwik-peptidecomplexen, kan deze ook worden toegepast op andere complexen, in het bijzonder bij metaalionen die in verschillende isotopische vormen voorkomen.Ontgas een vijf millimolaire ammoniumformiaatbuffer in een vacuümsysteem gedurende 10 minuten en spoel door met argon. Herhaal dit twee keer en bewaar de oplossing onder argon. Filter de buffersolution

a-study-complexation-mercury-ii-with-dicysteinyl-tetrapeptides

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Massaspectrometrie heeft bewezen een waardevol instrument voor het analyseren van grote eiwitcomplexen worden. Deze methode maakt het mogelijk inzicht in de samenstelling, de stoichiometrie en de algemene structuur van multi-subunit assemblages. We beschrijven hier, stap-voor-stap hoe u een structurele massaspectrometrie analyse uit te voeren, en karakteriseren macromoleculaire structuren.

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

We beschrijven de bereiding van colloïdale quantum dots met minimale hydrodynamische grootte voor single-molecule fluorescentie beeldvorming. Vergeleken met conventionele quantum dots, deze nanodeeltjes zijn vergelijkbaar in grootte met globulaire eiwitten en zijn geoptimaliseerd voor single-molecule helderheid, stabiliteit tegen afbraak en resistentie tegen specifieke binding aan eiwitten en cellen.

Compact Quantum Dots voor Single-molecule Imaging

De bepaling van de gasfase zuursterkte van cysteine-bevattende oligopeptiden beschreven. De experimenten zijn uitgevoerd met een drievoudige quadrupool massaspectrometer. De relatieve zuurgraden van de peptiden worden gemeten met behulp van botsingsgeïnduceerde dissociatie experimenten, en de kwantitatieve zuurgraden worden bepaald met behulp van de uitgebreide Koks kinetische methode.

Bepaling van de gas-fase zuurgraden van oligopeptiden

Biofysische en biochemische studies van interacties tussen membraan-ingebed eiwitdomeinen geconfronteerd met vele technische uitdagingen, waarvan de eerste is het verkrijgen van passende studiemateriaal. Dit artikel beschrijft een protocol voor het produceren en zuiveren van disulfide-gestabiliseerde transmembraan peptide complexen die geschikt zijn voor structurele analyse door oplossing kernspinresonantie (NMR) en andere analytische toepassingen.

Productie van Disulfide gestabiliseerde Transmembrane peptidecomplexen voor structurele studies

Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor solid-state amide waterstof/deuterium uitwisseling massaspectrometrie (ssHDX-MS) en solid-state fotolytische labelen massaspectrometrie (ssPL-MS) voor eiwitten in vaste poeders. De methoden leveren hoge resolutie informatie over eiwitconformatie en interacties in de amorfe vaste toestand, wat nuttig kan zijn in formuleringsontwerp.

Massaspectrometrische benaderingen tot Protein Structure en interacties te bestuderen in gevriesdroogde Poeders

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Ion Mobility-massaspectrometrie en moleculaire modelleringstechnieken kunnen de selectieve metaal chelerende werking van ontworpen metaal bindende peptiden en de koper bindende peptide methanobactin karakteriseren. Ontwikkeling van nieuwe klassen van metaal chelerende peptiden zal helpen leiden tot therapieën voor ziekten in verband met metaalionen misbalans.

Ion Mobility-massaspectrometrie technieken voor het bepalen van de structuur en de mechanismen van metaalionen herkenning en redox activiteit van metaal bindende Oligopeptides

Neutraal SO2 clusters van lage kinetische energie (&lt; 0,8 eV/bestanddeel) worden gebruikt om complexe oppervlaktemoleculen zoals peptiden of lipiden te desorberen voor verdere analyse door middel van massaspectrometrie met behulp van een ionenvalmassaspectrometer. Er is geen speciale monstervoorbereiding vereist en real-time observatie van reacties is mogelijk.

Analyse van complexe moleculen en hun reacties op oppervlakken door middel van cluster-geïnduceerde desorptie /Ionisatie massaspectrometrie

Lanthipeptide synthetases katalyseren multistep reacties tijdens de biosynthese van peptide natuurlijke producten. Hier beschrijven we een continue, bottom-up, waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) workflow die kan worden gebruikt om de conformationele dynamiek van lanthipeptide synthetases te bestuderen, evenals andere vergelijkbare enzymen die betrokken zijn bij peptide natuurlijke productbiosynthese.

Een Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform voor het onderzoeken van Peptide Biosynthetische Enzymen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof / deuteriumuitwisseling (HDX) -benadering in combinatie met top-down massaspectrometrie. Deze benadering karakteriseert het verschil in hogere-orde structuren tussen verschillende eiwitsoorten, inclusief eiwitten in verschillende toestanden en verschillende proteoformen, door gelijktijdige differentiële HDX en elektroforetische scheiding uit te voeren.

Op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof/deuteriumuitwisseling voor conformatiekarakterisering van eiwitten met top-down massaspectrometrie

Dit artikel beschrijft een experimenteel protocol met behulp van elektrospray-ion mobiliteit-massaspectrometrie, semi-empirische kwantumberekeningen en energie-opgeloste drempelbotsing-geïnduceerde dissociatie om de relatieve thermochemie van de dissociatie van gerelateerde ternaire metaalcomplexen te meten.

Thermochemische studies van Ni (II) en Zn (II) Ternaire complexen met behulp van ionenmobiliteit-massaspectrometrie

Leer de karakterisatie van kwik(II)-dicysteïnyl tetrapeptide-complexen met behulp van elektrospray-ionisatie-orbitrap-massaspectrometrie. Deze methode maakt analyse van metaalcomplexen mogelijk met minimale fragmentatie.

Een studie van de Complexatie van Mercury (II) met Dicysteinyl tetrapeptiden door electrospray ionisatie massaspectrometrie

Meer video's verkennen