Een studie van de Complexatie van Mercury (II) met Dicysteinyl tetrapeptiden door electrospray ionisatie massaspectrometrie
8 januari 2016
De karakterisering van complexen die in verschillende relatieve verhoudingen van kwik(II) tot dicisteïnyl-tetrapeptiden worden gevormd, wordt gepresenteerd door middel van elektronenspray-ionisatie orbitrap massaspectrometrie.
Het algemene doel van deze procedure is om complexen van kwik en dicyneine-peptiden te bereiden onder verschillende reactiestoichiometrieën en om de verschillende complexen die worden gevormd te karakteriseren door middel van elektrospray-ionisatie en oribitrap-massaspectrometrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de complexvormingstendens van kwik en thiolverbindingen, wat de rationele ontwerp van chelatiemiddelen voor het binden van kwikionen zal verbeteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de analyse van metaalionencomplexen met verwaarloosbare fragmentatie mogelijk maakt.
Andere omvatten een duidelijk patroon van isotopenverdeling van kwik. Gemakkelijk in het toekennen van de lading en het analyseren van overlappende pieken door tandem massaspectrometrie. Hoewel deze methode inzicht geeft in kwik-peptidecomplexen, kan het ook worden toegepast met andere complexen, vooral met metaalionen die in verschillende isotopenvormen bestaan.
Degasseer een buffer van vijf millimolar ammoniumformiaat onder een vacuümsysteem gedurende 10 minuten en purge met argon. Herhaal dit twee keer en bewaar de oplossing onder argon. Op de dag van gebruik, filter de bufferoplossing door een 0,2 micron filter voor gebruik.
Om kwikchloride-oplossingen te bereiden, weeg 0,2375 gram kwikchloride af. Los op in 25 milliliter vijf millimolar ammoniumformiaatbuffer om een oplossing van 0,035 molair kwikchloride te produceren. Voeg 0,214 milliliter van de kwikchloride-oplossing toe aan 9,785 milliliter vijf millimolar ammoniumformiaatbuffer om een oplossing van 0,75 millimolar te maken.
Bedek de resulterende oplossing met argongas. Voeg vervolgens 225 microliter van een vijf millimolar CGGC-stockoplossing toe aan 1,275 milliliter vijf millimolar ammoniumformiaatbuffer met een pH van 7,5 om een oplossing van 0,75 millimolar CGGC te geven. Bereid vervolgens een verhouding van één tot 0,5 van kwik tot CGGC-oplossing door 255 microliter van vijf millimolar ammoniumformiaatbuffer met een pH van 7,5 in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter te plaatsen.
Voeg vervolgens 30 microliter van 0,75 millimolar kwikchloride-oplossing toe aan de buis. Vortex de oplossing gedurende 10 seconden. Voeg vervolgens 15 microliter van 0,75 millimolar CGGC-oplossing toe aan de buis.
Vortex de oplossing nog eens 10 seconden en laat de oplossing vervolgens 10 minuten staan voordat deze in de massaspectrometer wordt geïnjecteerd. Om de ESI-massaspectrometer of MS te bereiden, trek 100 microliter kalibratiestandaarden op in een glasinjectiespuit van 500 microliter. Plaats de spuit in de spuithouder van de MS-pomp.
Bevestig de slang en injecteer in de massaspectrometer. Stel de bestandsnaam in voor de run door het bestandpictogram te selecteren en de bestandsnaam in te typen. Selecteer de knop gegevens verzamelen in de module voor gegevensverzameling en verzamel 150 scans.
Analyseer het chromatogram om de kalibratiestandaarden te verifiëren door het gegevensverwerkingsmodule van de software te openen. Ga vervolgens naar het bestandsmenu en selecteer open, gevolgd door het bestand in het dialoogvenster. Controleer of de pieken in het chromatogram overeenkomen met de massa-tot-ladingverhoudingen van de standaarden.
Reinig de glasinjectiespuit van 500 microliter door 500 microliter HPLC-kwaliteit methanol op te trekken en vervolgens uit te spoelen in een beker. Trek 500 microliter HPLC-kwaliteit methanol op in de glasinjectiespuit en spoel het systeem door. Selecteer de module methode-instelling van de software om de parameters in te stellen.
Kies het scanmodusmenu en identificeer de analysers FTMS, klik vervolgens op oké. Klik vervolgens door de verschillende pictogrammen op de real-time weergavespectrumpagina om de parameters in te stellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de buffer te laten lopen, plaats 500 microliter vijf millimolar ammoniumformiaatbuffer in de glasinjectiespuit van 500 microliter.
Plaats deze in de spuithouder van de MS-pomp en koppel de slang. Laat de buffer één tot twee minuten door de slang lopen. Stel de bestandsnaam in voor de run door het bestandpictogram te selecteren en de bestandsnaam in te typen.
Selecteer de knop gegevens verzamelen in de module en verzamel 150 scans. Klik op de knop run stoppen om te stoppen met verzamelen nadat 150 scans zijn verzameld. Open vervolgens de module gegevensbrowser, ga naar het bestandsmenu en selecteer open, gevolgd door het bestand in het dialoogvenster.
Controleer of er geen pieken aanwezig zijn op 483, 683, 1163 en 1363 massa-overlading die lijken op de peptide- of kwikionpeptidecomplexen. Laat de oplossing met een verhouding van één tot 0,5 kwik tot CGGC lopen door 250 microliter van het monster in de spuit te plaatsen. Plaats de spuit in de spuithouder van de MS-pomp.
Bevestig de slang en primeer de inrichting. Verzamel 150 gegevensscans, open de browsermodule, ga naar het bestandsmenu en selecteer open. Selecteer vervolgens het bestand in het dialoogvenster.
Controleer of het chromatogram pieken bevat, inclusief die voor het CGGC-peptide alleen. Een kritisch aspect van deze procedure is om ervoor te zorgen dat analyten van de vorige run volledig zijn verwijderd voordat elke reactiemengselanalyse wordt uitgevoerd. Minimalisatie van bemonsteringscontaminatie door carry-over-analyten wordt gewaarborgd door de injectielijn grondig te reinigen.
Was de spuit door te aspireren met 500 microliter ammoniumformiaatbuffer en vervolgens de buffer in een beker te gieten. Selecteer vervolgens de afvalknop op de MS en spoel de slang drie keer door met 500 microliter ammoniumformiaatbuffer. Was de spuit verder door 500 microliter methanol aan te zuigen en in een beker te gieten.
Spuil de slang één keer door met 500 microliter methanol. Selecteer vervolgens de knop detector laden op de MS.Na het toevoegen van 500 microliter ammoniumformiaatbuffer aan de spuit, plaats de spuit in de spuithouder van de MS-pomp. Bevestig de slang en primeer de inrichting.
Selecteer een bestandsnaam voor de bufferrun zoals eerder en verzamel 150 scans voordat u op de knop
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert de karakterisering van complexen gevormd tussen kwik(II) en dicysteïnyl-tetrapeptiden met behulp van electrosprayionisatie-orbitrap-massaspectrometrie. De methode maakt de analyse van metaalioncomplexen met minimale fragmentatie mogelijk, wat inzicht geeft in de complexatieneigenschappen van kwik.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Biochemie
- Analytische chemie
- Milieuwetenschappen
Achtergrond
- Kwik is een toxisch metaal dat complexen kan vormen met thiolverbindingen.
- Het begrijpen van deze complexen is essentieel voor de ontwikkeling van chelerende middelen.
- Electrospray-ionisatiemassaspectrometrie is een krachtig instrument voor het analyseren van metaalcomplexen.
- Deze techniek kan ook worden toegepast op andere metaalionen met verschillende isotopische vormen.
Doel van de studie
- Om kwik-dicysteïnylpeptidecomplexen te prepareren en te karakteriseren.
- Om de effecten van verschillende stoichiometrieën op de complexvorming te onderzoeken.
- Om het ontwerp van reagentia voor het sequestreren van kwikionen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van complexen onder variërende stoichiometrieën.
- Electrospray-ionisatie voor massaspectrometrische analyse.
- Orbitrap-massaspectrometrie voor gedetailleerde karakterisering.
- Tandem-massaspectrometrie voor het analyseren van overlappende pieken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle karakterisering van kwik-dicysteïnylpeptidecomplexen.
- Duidelijke isotopische distributiepatronen waargenomen voor kwik.
- Minimale fragmentatie tijdens de analyse, wat leidde tot heldere resultaten.
- Methode is toepasbaar op andere metaalioncomplexen.
Conclusies
- De studie biedt waardevolle inzichten in de complexvorming van kwik.
- Electrospray-ionisatie orbitrap massaspectrometrie is effectief voor deze analyse.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van chelatiemiddelen voor kwik.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Deze methode maakt een nauwkeurige karakterisering van metaal-peptidecomplexen mogelijk met behulp van hoge-resolutie ESI-MS, wat bijdraagt aan doelvalidatie bij het ontwerp van chelators voor de sequestratie van toxische metalen. Door het onderscheiden van specifieke isotopische patronen biedt het mechanische risicoreductie voor therapeutische kandidaten in een vroeg stadium die gericht zijn op kwikdetoxificatiepaden. De aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen door kwantitatieve stoichiometriegegevens te leveren onder gecontroleerde omstandigheden.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidering
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de stoichiometrie van kwik-thiol-binding mogelijk om hypothesen over chelaatvormende middelen te valideren.
- Operationele waarde: Gebruikt minimale samplehoeveelheden en voorkomt fragmentatie, waardoor de integriteit van complexen behouden blijft voor een nauwkeurige analyse.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert reproduceerbare isotopische signaturen voor kwikcomplexen, waardoor standaardisatie van assays over verschillende stoichiometrische verhoudingen mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Faciliteert de detectie van overlappende pieken via tandem-MS, wat de specificiteit bij het screenen van complexe mengsels verbetert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekte-relevante systeemmodellering door de binding van Hg(II) aan cysteïnerijke peptiden die relevant zijn voor de functie van metalloproteïnen te karakteriseren.
- Operationele waarde: Biedt continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door middel van overdraagbare MS-gebaseerde complexatieprofilering.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen workflows voor vroege ontdekking en ondersteunt de identificatie van lead-verbindingen door kwantitatieve bindingsgegevens te leveren die go/no-go-beslissingen bij de optimalisatie van chelators onderbouwen.
- Discovery Biology: Ondersteunt het toetsen van hypothesen over metaal-peptide-interacties door directe observatie van complexvorming.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door kwantificeerbare, isotopisch opgeloste pieken te produceren voor kwik-thiol-adducten.
- Analytica: Levert massametingen met een hoge resolutie en isotopische patronen die een nauwkeurige stoichiometrische toewijzing mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinisch werk door metaalsequestratie in biologische thiol-omgevingen te modelleren.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Vormt een herbruikbaar platform voor het screenen van metaal-chelator-interacties in meerdere toxische metaalsystemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van doelen door ambiguïteit in metaal-ligand-bindingsverhoudingen te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde bufferbereiding en grondige reiniging van het systeem om contaminatie te voorkomen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroegtijdige risicoreductie van chelator-kandidaten mogelijk te maken vóór uitgebreide synthese.
- Impact op portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering van sequestratiemiddelen op basis van gedefinieerde complexatieprofielen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de bediening van massaspectrometrie en protocollen voor de veilige omgang met kwik.
- Afhankelijk van ESI-MS-systemen met orbitrap-capaciteit voor isotopische resolutie.
- Vereist standaardisatie van monstervoorbereiding en injectiehygiëne tussen verschillende teams.
- Aanpassing aan andere metaalionen is mogelijk wanneer er onderscheidende isotopische patronen aanwezig zijn.
- Praktische beperking: De analysetijd neemt toe bij een hogere complexiteit van het monster vanwege de vereiste reinigingsstappen tussen de runs.
