Name: High-Resolution Kwantitatieve immunogoud Analyse van membraanreceptoren op het netvlies Ribbon Synapses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Leer hoe je membraaneiwitten kwantitatief analyseert aan retinale ribbonsynapsen met behulp van de postembedding immunogoudmethode. Deze techniek biedt hoge resolutie voor subcellulaire lokalisatie van glutamaatreceptoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Intramurale Programma&#39;s van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (NINDS) en het National Institute on Doofheid en andere Communication Disorders (NIDCD), van de National Institutes of Health (NIH). Wij danken de NINDS EM-faciliteit en de NIDCD geavanceerde imaging kern (code # ZIC DC 000081-03) voor hulp.

Zorg en behandeling van de dieren waren in overeenstemming met de NIH Animal Care and Guidelines gebruik Comite. Postnatale dag (P) 15-21 Sprague-Dawley ratten geïnjecteerd met 1-1,2% CTB bilateraal door de superieure colliculus, werden gehandhaafd op een 12: 12-uur licht: donker cyclus. 1. netvliesweefsel Fixatie <ol><li> Monteer de volgende materialen en hulpmiddelen: een dissectie microscoop, 2 tangen met zeer fijne tips, schaar, cellulose filterpapier, kunststof pipet en een microscoopglaasje. </li><li> Verdoven van de rat in een gesloten kamer met 2,0 ml halothaan (een inhalatie verdoving). Bepaal adequate verdoving door deze methoden: het ontbreken van de terugtrekking van de achterste poot na teen knijpen, of gebrek aan knipperreflex. onthoofden vervolgens onmiddellijk met een guillotine. Verwijder de ogen met een paar irisschaar en in een glazen schaaltje met 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB) bij pH 7,4. </li><li> Met behulp van de microscoop ontleden, verwijder de maïsea door het afsnijden van de voorzijde van de oogbol. Verwijder de lens en glasvocht van het binnenste netvlies oppervlak met een pincet. </li><li> Schil de sclera met de twee tang totdat de retina is geïsoleerd van de oogschelp. </li><li> Snijd het netvlies onmiddellijk in 100-200 urn dikke stroken met een scheermes, en onder voorbehoud van de pH-shift fixatie. </li><li> Fix retina strips in 4% paraformaldehyde in 0,1 M PB bij pH 6,0 gedurende 20-30 minuten en vervolgens in 4% paraformaldehyde plus 0,01% glutaaraldehyde bij pH 10,5 gedurende 10-20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Na verscheidene wassingen in PB met 0,15 mM CaCl2 (pH 7,4 bij 4 ° C), cryoprotect de retinale stroken met glycerol (60 minuten elk in 10%, 20%, 30%, vervolgens O / N bij 30%) in 0,1 M PB voorafgaand aan vervanging bevriezen. </li></ol> 2. Freeze-substitutie LET OP: Deze vries-substitutie methode is gewijzigd ten opzichte van een eerder gepubliceerde protocol 19,20. Ook is het van cruciaal belang dat de instrumenten zijn erg koud (draag handschoenen); Otherwise, het weefsel kan gedeeltelijk ontdooien bij aanraking met de instrumenten. Al deze stappen zijn gedaan binnen het AFS kamer en de instrumenten mogen nooit boven de rand van de kamer te bewegen. Op dezelfde manier, een goede koeling van alle chemicaliën die worden gebruikt in de AFS is noodzakelijk. <ol><li> Neem een ​​duik-bevriezing van de retinale strips in vloeibaar propaan bij -184 ° C in een EM cryopreservatie instrument (CPC). Met een fijne kwast, plaatst de monsters op kleine stukjes double-plakband bevestigd aan de metalen stompjes die gaan op het einde van het dompelen staafjes (lont uit extra buffer met de borstel). </li><li> Dompelen de staven in de vloeibare propaan en blijven daar ongeveer 5 seconden, en vervolgens over naar de automatische freeze-substitutie instrument (AFS) met een kleine transportkamer die is gevuld met vloeibare stikstof (LN 2 afgekoeld cryo overdrachthouder). </li><li> Na het plaatsen van de bevroren monster en instrumenten (pincet en scalpel) in de AFS, koelen van de instrumenten in de kamer voor seVeral minuten voor het aanraken van het weefsel of koelen ze door het plaatsen van de uiteinden van de instrumenten voor een paar seconden in de kleine transport kamer (gevuld met vloeibare stikstof (LN 2 gekoeld cryo overdracht container &#39;)). </li><li> Eenmaal in de AFS, verwijder het monster en de tape van de stomp met een fijn scalpel. Houd ook het stikstofgas flow control, TF (TF wordt omschreven als een &#39;regulator control voor LN 2 verdamper&#39;) geopend tijdens deze procedures. </li><li> Voorafgaand aan het plaatsen van het bevroren weefsel in het vaste inbedding houders (dat wil zeggen, voordat de AFS), snijd een dunne cirkel van een heldere kunststof folie en plaats deze in de bodem van de houder teneinde de bodem van elk putje lijn. Dit maakt het mogelijk relatief gemakkelijker verwijdering van het gepolymeriseerde specimen blokken als u klaar bent. LET OP: Voorheen gebruikten we een alternatieve methode om de platte inbedding houders, met gebruikmaking van dubbele Reichert + gelatine capsules (zie Petralia en Wenthold, 1999) &lt;sup&gt; 20. </li><li> Gebruik de volgende automatische sequentie in de AFS (met behulp van instrument terminologie): T1 = -90 ° C gedurende 32 uur, S1 = temperatuurstijging van 4 ° C / uur (11,3 uur), T2 = -45 ° C gedurende 50 uur, S2 = temperatuurstijging van 5 ° C / uur (9 uur), T3 = 0 ° C gedurende 40 uur (totaal = 142,3 uur). 4 uur om monsters in de AFS te plaatsen (bij -90 ° C) voor het starten van de getimede volgorde - Het kan 2 duren. </li><li> Dompel de bevroren secties in 1,5% uranylacetaat in methanol bij -90 ° C gedurende&gt; 32 uur in de AFS. Plaats twee stukjes weefsel (typisch) in elk van de zeven putjes van het vaste inbedding aluminium houder (drie passen in de AFS). <ol><li> Plaats het weefsel + tape in het uranyl acetaat / methanol in de putjes en later verwijder de tape, net voor aanvang inbedmedium (zoals Lowicryl HM20) infiltratie, als het te moeilijk is om het weefsel van de band te verwijderen. </li></ol></li><li> Verhoog dan de temperatuur stapsgewijs tot -45 ° C (+ 4 ° C per uur; in de automatische volgorde). </li><li> Was de monsters drie keer in voorgekoelde methanol, met behulp van een fijne punt plastic pipet om de oude oplossing uit elke platte inbedding houder te verwijderen, en vervolgens met behulp van een andere standaard plastic pipet om de voorgekoeld verse methanol toe te voegen. </li><li> Vervolgens worden met dezelfde methode, infiltreren monsters geleidelijk met lage temperatuur inbedden harsen zoals de inbedding (HM20 / methanol 1: 1 en 2: 1, elk voor 2 uur, gevolgd door pure hars gedurende 2 uur en vervolgens de harsen en houd O / N). </li><li> Verander het hars de volgende dag, kan het niveau van de hars te bereiken alleen maar de bovenrand van de putjes. </li><li> Polymeriseren de monsters (-45 ° C tot 0 ° C in automatische volgorde, + 5 ° C per uur) met UV licht gedurende 40 uur. </li><li> Verwijder vervolgens de monsters uit de AFS. Typisch, sample blokken vertonen nog steeds een aantal pinkness in kleur. Plaats de monsters in de buurt van de tl-licht in de chemische zuurkast, bij RT O / N of langer totdat ze appoor helemaal duidelijk. </li></ol> 3. Postembedding EM immunogold Immunocytochemie OPMERKING: Postembedding immunocytochemie werd uitgevoerd zoals beschreven 23,24,25. <ol><li> Snijd 1 micrometer secties met ultramicrotoom, vlek secties met 1% toluidine-blauw, en onderzoeken ze voor sectie geaardheid; oriënteren het weefsel blok naar de optimale dwarsvlak van snijden te bereiken. </li><li> Snijd 70 nm dik ultradunne secties met ultramicrotoom en verzamel ze op Formvar-koolstof-beklede nikkel slot grids. </li><li> Wassen roosters eenmaal in gedestilleerd H2O, gevolgd door een Tris-gebufferde zoutoplossing driemaal (TBS, 0,05 M Tris buffer, 0,7% NaCl, pH 7,6) was. </li><li> Incubeer roosters in 20 ul druppels 5% BSA in TBS gedurende 30 minuten, en vervolgens in 20 ul druppels van een mengsel dat geit anti-CTB (1: 3000) en een antilichaam tegen een NMDAR subeenheid (anti-konijn GluN2A 1:50 , GluN2B 01:30), of een anti-konijn GluA2 / 3 (01:30)in TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) met 2% BSA en 0,02 M NaN3 O / N bij kamertemperatuur. </li><li> Wassen roosters drie afzonderlijke druppels (20 pl) van TBS (pH 7,6) voor 10, 10 en 20 min, gevolgd door TBS (pH 8,2) gedurende 5 min. </li><li> Incubeer roosters 2 uur op druppels (20 pl) van een mengsel dat ezel anti-konijnen IgG (01:20) gekoppeld aan 10 nm gouddeeltjes en ezel anti-geit IgG (01:20) gekoppeld aan 18 nm gouddeeltjes in TBST (pH 8,2) met 2% BSA en 0,02 M NaN3. </li><li> Wassen roosters in 20 pl druppels TBS (pH 7,6) gedurende 5, 5 en 10 minuten, daarna in ultrazuiver water en vervolgens drogen. </li><li> Tegenkleuring grids met 5% uranyl acetaat en 0,3% lood citraat in gedestilleerd H 2 O voor 8 en 5 minuten onder donkere omstandigheden, respectievelijk. </li><li> Voor triple-markeringsexperimenten Incubeer grids O / N bij kamertemperatuur met 20 pl druppels van een mengsel van anti-geit CTB (1: 3000), anti-muis PSD-95 (1: 100) en anti-konijn GluN2A (1 : 50). incubeer dan grids gedurende 2 uur op 20 ul druppels van een mengsel van IgG gekoppeld aan 18, 10 en 5 nm gouddeeltjes in TBST (pH 8,2) met 2% BSA en 0,02 M NaN3. Behoud van dezelfde procedures als dubbele labeling voor het wassen en tegenkleuring tussen antilichaam en na incubatie. </li><li> Controles werden uitgevoerd waarbij de secundaire antilichamen alleen werd toegepast. </li><li> Bekijk grids op een EM en digitaliseren beelden. Proces definitieve cijfers in Adobe Photoshop 6.0 ​​alleen voor de helderheid en het contrast als het nodig is 24. </li></ol> 4. kwantificering <ol><li> Handmatig te selecteren gebieden van de binnenste plexiforme laag (IPL) zonder gaten of scheuren in 8,000X vergroting, vervolgens willekeurig fotomontage de volledige diepte van IPL op 25,000X vergroting. </li><li> Identificeer RGC dendrieten op kegel bipolaire tweetallen wanneer ze a) bevat de retrograde getransporteerd CTB signaal (grote gouddeeltjes), b) vertonen welomschreven membranen, kloven en postsynaptische dichtheid, c) ten minste twee kleine gouden gedeelte bevattenicles binnen de PSD of meerdere kleine gouden deeltjes langs de extrasynaptic plasmamembraan. </li><li> Verzamel 45-55 RGC dendrieten, gebaseerd op de criteria voor kwantitatieve analyse. </li><li> Meet de lengte van de PSD en de extrasynaptic plasmamembraan individuele RGC dendrieten met NIH ImageJ software. Aantal gouddeeltjes binnen 10 nm van het membraan als membraan-geassocieerde, op basis van een gemiddelde dikte van 7-9 nm voor de 26 plasmamembraan. </li><li> Bereken deeltjesdichtheid het aantal gouddeeltjes per lineaire micrometer (goud / um). Meet de afstand tussen het midden van elke gouddeeltje en het midden van de PSD (voor synaptische locatie) of de rand van de PSD (voor extrasynaptic locatie). </li><li> Voer een statistische analyse door software. Gebruik tweezijdige t-toetsen om gemiddelden te vergelijken. Concluderen betekenis wanneer p &lt;0,05. Tenzij anders aangegeven, rapportwaarden als gemiddelde ± SEM 18. </li></ol>

<ol><li>Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+endogenous+excitatory+amino+acids+from+turtle+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors.</a> Nature. 341, 536-539 (1989).</li>
<li>Wässle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).</li>
<li>Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+activation+of+two+types+of+glutamate+receptor+mediates+excitation+of+salamander+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells.</a> J. Physiol. 428, 175-197 (1990).</li>
<li>Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+synaptic+transmission+in+the+inner+retina%3A+paired+recordings+of+bipolar+cells+and+neurons+of+the+ganglion+cell+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer.</a> J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).</li>
<li>Chen, S., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+NMDA+and+non-NMDA+receptors+to+the+light-evoked+input-output+characteristics+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells.</a> Neuron. 11, 725-738 (1993).</li>
<li>Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA-preferring+receptors+mediate+excitatory+synaptic+inputs+to+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells.</a> J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).</li>
<li>Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake+limits+synaptic+excitation+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells.</a> J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).</li>
<li>Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spontaneous+excitatory+synaptic+currents+in+salamander+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells.</a> J. Physiol. 486, 207-221 (1995).</li>
<li>Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+PDZ+%28DHR%2C+GLGF%29+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains.</a> Trends. Biochem. Sci. 20, 350(1995).</li>
<li>Kim, E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDZ+domain+proteins+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PDZ domain proteins of synapses.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).</li>
<li>Migaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+long-term+potentiation+and+impaired+learning+in+mice+with+mutant+postsynaptic+density-95+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein.</a> Nature. 396, 433-439 (1998).</li>
<li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+immunocytochemical+detection+of+PSD-95%2C+PSD-93%2C+SAP-102%2C+and+SAP-97+at+postsynaptic%2C+presynaptic%2C+and+nonsynaptic+sites+of+adult+and+neonatal+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex.</a> Synapse. 40, 239-257 (2001).</li>
<li>Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+members+of+the+PSD-95+family+of+MAGUK+proteins+at+the+synaptic+region+of+inner+and+outer+hair+cells+of+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea.</a> Synapse. 40, 258-268 (2001).</li>
<li>Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+developmental+expression+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR2A+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina.</a> J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).</li>
<li>Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+NMDA+receptor+subunits+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).</li>
<li>Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+subcellular+distribution+of+NMDA+receptor+subunit+NR2B+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina.</a> J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).</li>
<li>Ottersen, O. P., Landsend, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+glutamate+receptors+at+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of glutamate receptors at the synapse.</a> Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).</li>
<li>Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetralia%2C+RS+%22Receptor+Localization%3A+Laboratory+Methods+and+Procedures%22">Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures</a>. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).</li>
<li>Petralia, R. S., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry+of+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry of NMDA receptors.</a> Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).</li>
<li>Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+and+NMDA+receptors%3A+similarities+and+differences+in+their+synaptic+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).</li>
<li>Qin, P., Pourcho, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+AMPA-selective+glutamate+receptor+subunits+in+the+cat+retina%3A+a+light-+and+electron-microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study.</a> Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).</li>
<li>Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+GABAergic+amacrine+cells+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Visual.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina.</a> Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).</li>
<li>Zhang, J., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+perisynaptic+and+synaptic+localization+of+NMDA+and+AMPA+receptors+on+ganglion+cells+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).</li>
<li>Zhang, J., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-+and+Pathway-Specific+Localization+of+NMDA+Receptors+and+Scaffolding+Proteins+at+Ganglion+Cell+Synapses+in+Rat+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina.</a> J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).</li>
<li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22The+fine+structure+of+the+nervous+system%3A+neurons+and+their+supporting+cells%2C+3rd+ed%22">The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed</a>. , Oxford University Press. New York. (1991).</li>
<li>Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabotropic+glutamate+receptor+%28mGluR1%29+is+concentrated+at+perisynaptic+membrane+of+neuronal+subpopulations+as+detected+by+immunogold+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction.</a> Neuron. 11, 771-787 (1993).</li>
<li>Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-substitution+and+Lowicryl+HM20+embedding+of+fixed+rat+brain%3A+Suitability+for+immunogold+ultrastructural+localization+of+neural+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hist.+Cyt%22%5BJournal%5D)">Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens.</a> J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).</li>
<li>Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+AMPA+receptor+subunits+at+a+glutamate+synapse%3A+A+quantitative+immunogold+analysis+of+hair+cell+synapses+in+the+rat+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti.</a> J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).</li>
<li>Petralia, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+NMDA+receptors+at+extrasynaptic+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations.</a> Neuroscience. 167, 68-87 (2010).</li>
<li>Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerighi%2C+A+%22Electron+Microscopic+Immunocytochemistry%3A+Principles+and+Practice%22">Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice</a>. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).</li>
<li>Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+organization+of+a+type+of+peripheral+glutamate+synapse%3A+the+afferent+synapses+of+hair+cells+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear.</a> Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).</li>
<li>Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21, 545-559 (1998).</li>
<li>Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+expression+of+AMPA+and+NMDA+receptors+in+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses.</a> Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).</li>
<li>Grimes, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+inhibitory+microcircuitry+regulates+retinal+signaling+near+visual+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold.</a> J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).</li>
<li>Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+ionotropic+glutamate+receptors+at+dendrodendritic+synapses+in+the+rat+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.

We hebben beschreven vier technieken voor een succesvolle kwantitatieve post-inbedding immunogold EM: 1) korte en zwakke fixatie, 2) te bevriezen-substitutie, 3) post-inbedding immunogoudkleuring, en 4) kwantificering. EM immunogoud maakt de detectie van specifieke eiwitten in ultradunne weefselcoupes. Antilichamen gelabeld met gouddeeltjes kunnen direct worden gevisualiseerd middels EM. Terwijl krachtig in het opsporen van de subsynaptic lokalisatie van een membraan receptor, kan EM immunog...

Glutamaat is de belangrijkste exciterende neurotransmitter in de retina 1. Retinale ganglioncellen (RGC&#39;s), het ontvangen glutamaat synaptische input van bipolaire cellen 2, zijn de output vormen van de retina die visuele informatie naar de hersenen sturen. Fysiologische studies toonden aan dat synaptische excitatie van RGC postsynaptisch wordt gemedieerd door NMDA-receptoren (NMDARs) en AMPA receptoren (AMPARs) 3,4,5. Hoewel prikkelende postsynaptische stromingen (EPSCs) in RGC worden gemedieerd door AMPARs en NMDARs 3,5,6,7,8, spontane miniatuur EPSCs (mEPSCs) op RGC vertonen slechts een AMPARs-gemedieerde component 4,5,9. Echter, het verminderen glutamaat opname onthulde een NMDAR component spontane EPSCs 5 suggereert dat NMDARs op RGC dendrieten buitenzijde van exciterende synapsen kunnen bevinden. Membraan-geassocieerde guanylate kinases (MAGUKs), zoals PSD-95 dat cluster neurotransmitter receptoren, met inbegrip van glutamaat receptoren en ionkanaals bij synaptische plaatsen, vertonen ook duidelijke subsynaptic expressiepatronen 10,11,12,13,14. In de afgelopen decennia, confocale immunohistochemie en pre-inbedding elektronenmicroscoop (EM) immunohistochemie werden gebruikt om het membraan receptor expressie te bestuderen. Hoewel confocale immunokleuring onthult brede patronen van receptor expressie, de lagere resolutie niet mogelijk is om te onderscheiden subcellulaire locatie. Pre-inbedding EM studies in zoogdieren netvlies geven aan dat NMDAR subeenheden aanwezig in postsynaptische elementen op kegel bipolaire cel lint synapsen 15,16,17 zijn. Dit is in duidelijke tegenstelling tot fysiologische gegevens. Echter diffusie van reactieproduct een bekende artefact in de pre-inbedding immunoperoxidase methode. Daarom is deze benadering niet geven meestal statistisch betrouwbare gegevens en kunnen onderscheid tussen lokalisatie uitsluiten synaptische membraan versus extrasynaptic membraan 18,19,20,21. OpAnderzijds fysiologische en anatomische gegevens in overeenstemming met een lokalisatie van synaptische AMPARs op RGC 3,5,7,9,22. Aldus glutamaatreceptoren en MAGUKs bij retinale lint synaps gelokaliseerd niet alleen de postsynaptische maar ook de perisynaptic of extrasynaptic membraancompartimenten. Echter, een hoge-resolutie kwantitatieve analyse van deze membraaneiwitten in een retinale lint synaps nog steeds nodig. Hier hebben we een postembedding EM immunogold techniek om de subsynaptic lokalisatie van NMDAR subeenheden, Ampar subeenheden en PSD-95, gevolgd door een schatting van het aantal, de dichtheid en de veranderlijkheid van deze eiwitten bij synapsen op rat RGC onderzoeken geëtiketteerd met choleratoxine subunit B (CTB) retrograde tracing methoden.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>EMS</td><td>16019</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-8106</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-7030</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>JT Baker</td><td>V015-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Gibco BRL</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Lowicryl HM 20</td><td>Polysciences</td><td>15924-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>04997-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GluN2A</td><td>Millipore</td><td>AB1555P</td><td>Dilution 1/50</td></tr><tr><td>Anti-GluN2B</td><td>Millipore</td><td>AB1557P</td><td>Dilution 1/30</td></tr><tr><td>Anti-GluA2/3</td><td>Millipore</td><td>AB1506</td><td>Dilution 1/30</td></tr><tr><td>Anti-PSD-95</td><td>Millipore</td><td>MA1&ndash;046</td><td>Dilution 1/100</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles</td><td>EMS</td><td>25704</td><td>Dilution 1/20</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles</td><td>EMS</td><td>25814</td><td>Dilution 1/20</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles</td><td>EMS</td><td>25812</td><td>Dilution 1/20</td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-215-147</td><td>Dilution 1/20</td></tr><tr><td>Formvar-Carbon coated nickel-slot grids.</td><td>EMS</td><td>FCF2010-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetate</td><td>EMS</td><td>22400-1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>EMS</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Lead citrate</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM AFS</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM CPC</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JEOL 1200 EM</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>liquid nitrogen&nbsp;</td><td>Roberts Oxygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propane</td><td>Roberts Oxygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTB</td><td>List Biological Laboratories</td><td>104</td><td>1 - 1.2%</td></tr><tr><td>Anti-CTB</td><td>List Biological Laboratories</td><td>703</td><td>Dilution 1/4.000</td></tr></tbody></table>

high-resolution kwantitatieve immunogoud analyse van membraanreceptoren op het netvlies ribbon synapses

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinale ganglioncellen (RGC's) ontvangen excitatoire glutamaterge input van bipolaire cellen. Synaptische excitatie van RGC's wordt postsynaptisch gemedieerd door NMDA-receptoren (NMDAR's) en AMPA-receptoren (AMPAR's). Fysiologische gegevens hebben aangegeven dat glutamaatreceptoren bij RGC's niet alleen in postsynaptische maar ook in perisynapticale of extrasynaptische membraancompartimenten worden uitgedrukt. Desondanks zijn de precieze anatomische locaties voor glutamaatreceptoren bij RGC-synapsen niet bepaald. Hoewel een hoogwaardige kwantificeerbare analyse van glutamaatreceptoren bij centrale synapsen wijdverspreid wordt toegepast, heeft deze aanpak slechts beperkt succes gehad in het netvlies. We ontwikkelden een post-embedding immunogold-methode voor analyse van membraanreceptoren, waardoor het mogelijk werd om het aantal, de dichtheid en de variabiliteit van deze receptoren bij retinale lintsynapsen te schatten. Hier beschrijven we de hulpmiddelen, reagentia en de praktische stappen die nodig zijn voor: 1) succesvolle bereiding van retinale fixatie, 2) freeze-substitutie, 3) post-embedding immunogold elektronenmicroscoop (EM) immunocytochemie en, 4) kwantitatieve visualisatie van glutamaatreceptoren bij lintsynapsen.

De hier gepresenteerde resultaten tonen opvallend anders subsynaptic lokalisatie patronen van gluA 2/3 en NMDARs op RGC dendrieten in rat retina, zoals eerder beschreven 24,25. 77% van gluA 2/3 immunogold deeltjes RGC dendritische profielen bevinden zich binnen de PSD (figuur 1A), vergelijkbaar met de meeste centrale synapsen. Werden echter NMDARs ofwel synaptisch of extrasynaptically gelegen. 83% van GluN2A immunogold deeltjes werden gelokaliseerd in de PSD <...

De postembedding immunogold-methode is een van de meest effectieve manieren om hoogwaardige analyses van de subcellulaire lokalisatie van specifieke moleculen te leveren. Hier beschrijven we een protocol om glutamaatreceptoren bij retinale lintsynapsen kwantitatief te analyseren.

High-Resolution Kwantitatieve immunogoud Analyse van membraanreceptoren op het netvlies Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Het algemene doel van dit experiment is het ontwikkelen van een nieuwe benadering om membraaneiwitten bij retinale ribbon-synapsen kwantitatief te analyseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen binnen het veld van de retinale neurobiologie, zoals de precieze locatie van eiwitten bij synapsen binnen het circuit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het aantal, de dichtheid en de snelheid van meerdere eiwitten bij retinale ribbon-synapsen kan worden geschat.Om de procedure van vries-substitutie en ultradunne doorsneden te demonstreren, hebben we dr. Ron Petralia en Ya-Xian Wang van de NIDCD Advanced Imaging Core. Begin deze procedure door een oogbol onder de microscoop te dissekeren. Verwijder hiervoor eerst het hoornvlies.Verwijder vervolgens de lens en het glasachtig lichaam van het inter-retinale oppervlak met een pincet. Pel daarna de sclera af totdat het netvlies is geïsoleerd van de oogkom. Snijd het netvlies onmiddellijk met een scheermes in stroken van 100 200 micrometer dik.Meng vervolgens de retinastrips in 4%paraformaldehyde in 0,1 molair PB. Daarna in 4%paraformaldehyde plus 0,01%glutaraldehyde bij kamertemperatuur. Na verschillende wasbeurten in PB met 0,15 millimolair calciumchloride worden de retinastrips cryoprotectie gegeven met glycerol in 0,1 molair PB, voorafgaand aan de vries-substitutie. Voordat het bevroren weefsel in de platte inbeddingshouders wordt geplaatst, snijdt u een dunne cirkel uit een transparante plastic plaat en plaatst u deze op de bodem van elke houder om de verwijdering van de gepolymeriseerde monsterdoos na afloop te vergemakkelijken.Stel nu de automatische sequentie in de AFS in. Vul de AFS met vloeibare stikstof en plaats de platte inbedhouders in de AFS. Vul deze met 1,5% uranylacetaat in methanol en koel ze voor.Om de retina-strips in vloeibaar propaan bij 184 °C snel te bevriezen, gebruikt u een fijn penseel om de monsters op kleine stukjes dubbelzijdige plakband te plaatsen, die zijn bevestigd aan de metalen stubs aan het uiteinde van de dompelstaven. Verwijder daarna het overtollige buffer met het penseel. Dompel de staven gedurende ongeveer vijf seconden in het vloeibare propaan.Breng ze vervolgens over naar de AFS met behulp van een kleine transportkamer die is gevuld met vloeibare stikstof. Nadat het bevroren monster en de instrumenten, pincet en scalpel, in de AFS zijn geplaatst, moeten de instrumenten enkele minuten in de kamer worden afgekoeld voordat het weefsel wordt aangeraakt. Alternatief kunnen ze worden afgekoeld door de punten van de instrumenten enkele seconden in de kleine transportkamer met vloeibare stikstof te plaatsen.Verwijder daarna het monster en de tape van de stub met een fijn scalpel. Plaats vervolgens in elk van de zeven putjes van de platte aluminium inbeddingshouder twee stukjes bevroren coupes in 1,5% uranylacetaat in methanol. Bewaar deze gedurende ten minste 32 uur bij 90 graden Celsius in de AFS.Verhoog vervolgens de temperatuur stapsgewijs naar 45 °C in de automatische sequence. Was daarna de monsters drie keer in voorkoelde methanol. Infiltreer de monsters vervolgens progressief met laagtemperatuur-inbedharsen als inbedmedium.Vervang de volgende dag de hars opnieuw en pas het harsniveau aan zodat de bovenrand van de wells wordt bereikt. Stel het UV-licht op de AFS in en polymeriseer de monsters met UV-licht in de AFS tot het einde van de automatische sequentie. Verwijder vervolgens de monsters uit de AFS.Meestal vertonen de monsterblokjes nog enige roze verkleuring. Plaats de monsters gedurende de nacht bij het fluorescerende licht in de chemische zuurkast bij kamertemperatuur, of totdat ze volledig helder lijken. Snijd in deze stap ultradunne secties van 70 nonometer dik met een ultramicrotoom en verzamel deze op nikkelgrids gecoat met formvar-koolstof.Was de grids één keer met gedestilleerd water, gevolgd door drie wasbeurten met TBS. Incubeer de grids vervolgens gedurende 30 minuten in 20 µL 5% BSA in TBS, en daarna een nacht bij kamertemperatuur in 20 µL van een mengsel bestaande uit geiten-anti-CTB en een antilichaam tegen één NMDAR-subtype. Was de grids daarna drie keer met telkens 20 µL TBS bij pH 7,6.Was de roosters vervolgens eenmaal met TBS bij pH 8.2 gedurende vijf minuten. Incubeer de roosters gedurende twee uur met 20 µL van een mengsel bestaande uit donkey anti-rabbit IgG gekoppeld aan 10 nm gouddeeltjes en donkey anti-goat IgG gekoppeld aan 18 nm gouddeeltjes. Was de roosters na twee uur drie keer in 20 µL TBS bij pH 7.6, gevolgd door een wasbeurt in ultrapuur water, en laat de roosters vervolgens aan de lucht drogen.Kleuren de roosters vervolgens tegen met 5% uranylacetaat in gedestilleerd water gedurende acht minuten, gevolgd door 0,3% loodcitraat in gedestilleerd water gedurende vijf minuten in het donker. Voor experimenten met drievoudige markering worden de roosters overnacht bij kamertemperatuur geïncubeerd met 20 µL van een mengsel van anti-geit CTB, anti-muis PSD-95 en anti-konijn UN2A. Incubeer de roosters vervolgens gedurende twee uur met 20 µL van een mengsel van IgG's gekoppeld aan goudpartikels van 18, 10 en vijf nm.Stel in dit gedeelte eerst de schaalbalk in. Meet vervolgens de lengte van de PSD van individuele RGC-dendrieten met de ImageJ-software. Tel daarna de goudpartikels binnen 10 nanometers van het membraan, uitgaande van een gemiddelde dikte van zeven tot negen nanometers voor het plasmamembraan.Bereken de partikeldichtheid als het aantal goudpartikels per lineaire micrometer. Meet vervolgens de afstand tussen het centrum van elk goudpartikel en het midden van de PSD voor synaptische lokalisatie, of de rand van de PSD voor extrasynaptische lokalisatie. Deze afbeelding toont de dubbele immunogoudlabeling van GluA2/3 en CTB.Dit is het presynaptische ribbon en de kleine goudpartikels zijn geclusterd in de PSD van de RGC-uitlopers. Deze afbeelding toont de dubbele immunogoudlabeling van GluN2B en CTB. De kleine goudpartikels bevinden zich op het extrasynaptische plasmamembraan.En deze afbeelding toont de dubbele immunogoudlabeling van GluN2A en CTB. Vergelijkbaar met GluA2/3 zijn kleine partikels geclusterd binnen de PSD. De drievoudige immunogoudlabeling van GluN2A, PSD-95 en CTB wordt hier getoond.GluN2A-gouddeeltjes en PSD-95-gouddeeltjes zijn gecolocaliseerd binnen de PSD op individuele CTB-positieve RGC-dendrieten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het weefsel zeer voorzichtig te fixeren, omdat de antigeniciteit van sommige eiwitten, zoals die van NMDA-receptoren, aanzienlijk afneemt bij sterke, langdurige fixatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe membraaneiwitten met grote precisie kunnen worden gedetecteerd en geanalyseerd bij retinaal lintsynapsen.

high-resolution-quantitative-immunogold-analysis-membrane-receptors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video laten we zien hoe te labelen en te visualiseren enkele synaptische blaasjes exocytose en handel in goudvissen het netvlies bipolaire cellen met behulp van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie.

Imaging exocytose in het netvlies bipolaire cellen met TIRF Microscopie

Dit protocol beschrijft hoe u synaps nummer zowel in gedissocieerde neuronale cultuur en in de hersenen secties met behulp van immunocytochemie kwantificeren. Met behulp van vak-specifieke antilichamen, we label presynaptische terminals alsmede ten aanzien sites van postsynaptische specialisatie. We definiëren synapsen als punten van colocalization tussen de signalen die door deze markers.

Het kwantificeren van Synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te Synapse Number Kwantificeer

Source: Schönherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

Source: Zhang, J., et al. High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates an electron microscopy technique for visualizing neurotransmitter receptor localization in retinal synapses. The retinal sections contain retinal ganglion cells that exhibit membrane-bound neurotransmitter receptors and are labeled with cholera toxin subunit B (CTB). Upon labeling the markers with gold nanoparticle-conjugated...

High-Resolution Imaging of Neurotransmitter Receptors at Retinal Synapses

Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

Immunohistochemie protocollen worden gebruikt voor de lokalisatie van een specifiek eiwit in het netvlies te bestuderen. Calcium beeldvormende technieken worden gebruikt om calcium dynamiek in retinale ganglioncellen en hun axonen te bestuderen.

Immunohistochemische en Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Dit artikel illustreert hoe de expressie van neurotransmitterreceptoren kan worden gekwantificeerd en het patroon geanalyseerd op synapsen met geïdentificeerde pre- en postsynaptische elementen door een combinatie van virale transductie van optogenetische hulpmiddelen en de freeze-fracture replica immunolabeling techniek.

Gecombineerde optogenetische en Freeze-fractuur Replica immunokleuring Input-specifieke Regeling van glutamaatreceptoren in de Mouse amygdala Onderzoek

Hier presenteren we een protocol om de CLARITY-methode van de hersenweefsels aan te passen voor volledig gemonteerde retinas om de kwaliteit van standaard immunohistochemische kleuring en hoge resolutie beeldvorming van retinale neuronen en hun subcellulaire structuren te verbeteren.

Immunostaining van Whole-Mount Retinas met de CLARITY Tissue Clearing Method

Dit protocol schetst de gedetailleerde stappen van het pre-embedden van immuno-elektronenmicroscopie, met een focus op het verkennen van synaptische circuits en eiwitlokalisatie in het netvlies.

Onderzoek naar retinale circuits en moleculaire lokalisatie door pre-embedding immuno-elektronenmicroscopie

Dit protocol biedt een geoptimaliseerde en uitgebreide voorbereidingsprocedure voor retinale organoïdemonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie. Het is geschikt voor toepassingen waarbij synapsen in volwassen retinale organoïden worden geanalyseerd.

Voorbereiding van retinale organoïdemonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie

Het netvlies vertoont een complexe ruimtelijke organisatie over zijn laminaire structuur. Moderne ruimtelijke transcriptomics en sequencingtechnieken vereisen weefselcoupes &lt; 20 μm dik, waardoor hun toepasbaarheid voor retinaal onderzoek wordt beperkt. Deze vers ingevroren cryosectiemethode produceert dunne delen van het netvlies van de muis met behoud van vlakke ruimtelijke relaties, waardoor uitgebreide moleculaire kartering over laminae mogelijk is.

En gezicht Cryosectie van het netvlies van de muis voor hoogdimensionale ruimtelijke moleculaire analyse

Leer hoe je membraaneiwitten kwantitatief analyseert aan retinale ribbonsynapsen met behulp van de postembedding immunogoudmethode. Deze techniek biedt hoge resolutie voor subcellulaire lokalisatie van glutamaatreceptoren.

High-Resolution Kwantitatieve immunogoud Analyse van membraanreceptoren op het netvlies Ribbon Synapses

Meer video's verkennen