High-Resolution Kwantitatieve immunogoud Analyse van membraanreceptoren op het netvlies Ribbon Synapses

Het algemene doel van dit experiment is om een nieuwe aanpak te ontwikkelen om membraaneiwitten bij retinale lintsynapsen kwantitatief te analyseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de retinale neurobiologie, zoals de precieze locatie van eiwitten op synapsen binnen het circuit. Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat het het aantal, de dichtheid en de snelheid van meerdere eiwitten bij retinale lintsynapsen kan schatten.

Het demonstreren van de procedure van freeze-substitutie en het ultradunne sectiesnijden hebben we docs Ron Petralia en Ya-Xian Wang van de NIDCD Advanced Imaging Core. Om deze procedure te beginnen, dissecteer een oogbal onder de microscoop. Om dit te doen, verwijdert u eerst de hoornvlies.

Verwijder vervolgens de lens en het glasvocht van het inter-retinale oppervlak met een pincet. Daarna, pel de sclera tot de retina is geïsoleerd van de oogbol. Snijd de retina onmiddellijk in 100 200 micrometer dikke stroken met een scheermes.

Vervolgens, meng de retinastroken in 4% paraformaldehyde in 0,1 molair PB. Vervolgens, in 4% paraformaldehyde plus 0,01% glutaaraldehyde bij kamertemperatuur. Na verschillende wasbeurten in PB, met 0,15 millimolair calciumchloride, cryoprotect de retinale stroken met glycerol in 0,1 molair PB, voorafgaand aan freeze-substitutie. Voordat u het bevroren weefsel in de platte inbeddingshouders plaatst, snijdt u een dunne cirkel uit een doorzichtige plastic plaat en plaatst u deze op de bodem van elke houder om het gemakkelijker te maken om de gepolymeriseerde monsterdoos te verwijderen wanneer u klaar bent.

Stel nu de automatische sequentie in de AFS in. Vul de AFS met vloeibare stikstof en plaats de platte inbeddingshouders in de AFS. Vul ze met 1,5% uraalacetaat in methanol en koel ze vooraf. Om de retinale stroken in vloeibaar propaan bij 184 graden Celsius te dompelvriezen, gebruikt u een fijne borstel om de monsters op kleine stukjes dubbelzijdig plakband te plaatsen die aan de metalen stokjes aan het uiteinde van de dompelstokken zijn bevestigd. Wikkel daarna extra buffer af met de borstel. Dompel de staven ongeveer vijf seconden in het vloeibare propaan.

Breng ze vervolgens over naar de AFS met behulp van een kleine transportkamer die is gevuld met vloeibare stikstof. Nadat u het bevroren monster en instrumenten, pincet en scalpel, in de AFS hebt geplaatst, koelt u de instrumenten in de kamer enkele minuten voordat u het weefsel aanraakt. Of, koel ze door de uiteinden van de instrumenten enkele seconden in de kleine transportkamer gevuld met vloeibare stikstof te plaatsen.

Verwijder daarna het monster en het plakband van de stok met een fijne scalpel. Plaats vervolgens twee stukken bevroren secties in elk van de zeven putjes in de platte aluminium inbeddingshouders met 1,5% uraalacetaat in methanol. Houd ze minimaal 32 uur op 90 graden Celsius in de AFS.

Verhoog vervolgens de temperatuur stapsgewijs tot 45 graden Celsius in de automatische sequentie. Was daarna de monsters drie keer in voorgekoeld methanol. Infiltreer vervolgens de monsters progressief met behulp van inbeddingsharsen met lage temperatuur als inbeddingsmedium.

De volgende dag, verander de hars opnieuw en pas het niveau van de hars aan om de bovenrand van de putjes te bereiken. Zet het UV-licht op de AFS en polymeriseer de monsters met UV-licht in de AFS tot het einde van de automatische sequentie. Verwijder vervolgens de monsters uit de AFS.

Meestal laten monsterblokken nog enige roze kleur zien. Plaats de monsters in de chemische afzuigkap bij kamertemperatuur overnacht of tot ze er volledig helder uitzien. Snijd in deze stap 70 nanometer dikke ultradunne secties met een ultramicrotoom, en verzamel ze op de met formvar en koolstof gecoate nikkelroosters.

Was de roosters eenmaal in gedistilleerd water, gevolgd door drie wasbeurten in TBS. Bewaar vervolgens de roosters in 20 microliter 5% BSA in TBS gedurende 30 minuten en vervolgens in 20 microliter van een mengsel met geit anti-CTB en een antilichaam tegen een NMDAR sub-eenheid gedurende een nacht bij kamertemperatuur. Was daarna de roosters drie keer met 20 microliter TBS bij elke tijd ph 7,6.

Was vervolgens de roosters eenmaal met TBS bij ph 8,2 gedurende vijf minuten. Bewaar de roosters twee uur in 20 microliter van een mengsel met donkey anti-rabbit IGG gekoppeld aan 10 nanometer gouddeeltjes, en donkey anti-geit IGG gekoppeld aan 18 nanometer gouddeeltjes. Na twee uur, was de roosters in 20 microliter TBS bij ph 7,6 drie keer, gevolgd door een wasbeurt in de ultra-pure water en droog vervolgens de roosters aan de lucht.

Vervolgens, tegenkleuren de roosters met 5% uraalacetaat in gedistilleerd water gedurende acht minuten, gevolgd door 0,3% loodcitrat in gedistilleerd water gedurende vijf minuten in het donker. Voor triple-labeling experimenten, bewaar de roosters een nacht bij kamertemperatuur met 20 microliter van een mengsel van anti-geit CTB, anti-muis PSD-95, en anti-konijn UN2A. Bewaar vervolgens de roosters twee uur in 20 microliter van een mengsel van IGGs gekoppeld aan 18, 10, en vijf nanometer gouddeeltjes.

Stel in dit gedeelte eerst de schaalbalk in. Meet vervolgens de lengte van de PSD van individuele RGC-dendriet met ImageJ-software. Tel vervolgens de gouddeeltjes binnen 10 nanometer van de membraan op basis van een gemiddelde dikte van zeven tot negen nanometer voor het plasmamembraan.

Bereken de deeltjesdichtheid als het aantal gouddeeltjes per lineaire micrometer. Meet vervolgens de afstand tussen het centrum van elk gouddeeltje en het midden van de PSD voor synaptische locatie, of de rand van de PSD, voor extra-synaptische locatie. Deze afbeelding toont de dubbele immunogoudlabeling van GluA2/3 en CTB.

Dit is de presynaptische lint en de kleine gouddeeltjes zijn geclusterd in de PSD van de RGC-processen. Deze afbeelding toont de dubbele immunogoudlabeling