Zoutgehalte-afhankelijke toxiciteit Test van Silver nanocolloïden gebruik van Medaka Eieren
18 maart 2016
Embryonale stadia zijn het meest vatbaar voor xenobiotica. Hoewel chemische toxiciteit afhankelijk is van de zoutconcentratie, bestaat er geen methode om de zoutconcentratieafhankelijkheid van toxiciteit voor aquatische organismen te testen. Hier beschrijven we een nieuwe en snelle methode om de zoutconcentratieafhankelijkheid van toxiciteit voor aquatische embryo's te bepalen.
Het algemene doel van dit experiment is om de saliniteitsafhankelijke toxiciteit van chemicaliën voor aquatische organismen te testen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ecotoxicologie, zoals de beoordeling van toxiciteit onder zoetwater-, brakwater- en zeewatercondities. Het grote voordeel van deze techniek is dat medaka nooit wordt gevraagd om de toxiciteit van chemicaliën in verschillende saliniteiten te testen.
Bovendien strekken de implicaties van deze techniek zich uit tot andere therapieën of diagnoses van chemicaliëntoxiciteit. De bereiding van commerciële zilvernanocolloïden in oplossing, bij verschillende saliniteiten, wordt behandeld in het tekstprotocol. Evenals het kweken van medaka en het verzamelen van eieren.
Begin met het spoelen van zes collecties van medaka-eieren van stadium 21, driemaal in testoplossing. Doe dit met ERM's, bij een andere concentratie voor elke set eieren. Breng nu van elke gespoelde collectie 15 eieren over naar een andere put met testoplossing, in een plastic plaat met zes putjes.
Stel dit experiment op in drievoudige uitvoering, waarbij elke groep afzonderlijk wordt gewassen. Wikkel de platen in folie en bewaar ze in het donker op 25 graden Celsius. Totdat de eieren uitkomen, of gedurende 14 dagen, afhankelijk van wat het eerst gebeurt.
Tijdens de incubatie, observeer de eieren dagelijks op biologische veranderingen. En op dode eieren. Ververs de testoplossing dagelijks, samen met het maken van waarnemingen.
Op de zesde dag van observatie, tel de hartslag van elk embryo gedurende 15 seconden. Ook op de zesde dag, meet de diameter van de ogen van elk embryo, in elke experimentele conditie, met behulp van een micrometer. Wanneer de embryo's uitkomen in larven, meet dan hun volledige lichaamslengte, met behulp van een micrometer.
Tel ook gedurende de 14 dagen het totale aantal uitgekomen eieren. Om de zilverbioaccumulatie te meten, verzamel op de zesde dag de chorionen van de eieren, volgens de standaardmethode. De gedechorioneerde eieren kunnen worden geanalyseerd, net zoals de SNC-oplossing wordt geanalyseerd, zoals beschreven in de volgende sectie.
Om het oplosbare zilver van elke SNC-oplossing te isoleren. eerst, filter de mix van colloïden en oplosbaar zilver uit, met behulp van een membraan van drie kilodalton. Draai vervolgens het geladen filter in een gekoelde centrifuge gedurende 10 minuten op 14.000 Gs.
Meet van 50 microliter van het filtraat de zilverconcentratie door ICP-MS-analyse. Laad het aliquot in een Teflon beker van 50 milliliter en voeg twee milliliter ultrapuur salpeterzuur toe aan de beker. Verhit vervolgens het mengsel op een hotplate, op 110 graden Celsius.
Laat de oplossing ongeveer drie uur lang uitdrogen. Zodra de beker is afgekoeld, los de organische vaste stoffen volledig op. Voeg twee milliliter ultrapuur salpeterzuur en 0,5 milliliter waterstofperoxide toe aan de beker.
Verhit vervolgens het mengsel opnieuw, totdat het weer bijna is uitgedroogd. Los nu het resterende residu op in vier milliliter van één procent ultrapuur salpeterzuur, gemaakt in ultrapuur water. Breng de oplossing over in een centrifugebuis van 15 milliliter.
Herhaal het proces van het oplossen van de resterende vaste stoffen in de Teflon beker nog twee keer, koel de drie collecties af tot een enkele buis. Meet nu de zilverconcentratie in het monster, met behulp van ICP-MS. Gebruik het aanbevolen protocol van de fabrikant om de monsters te analyseren.
Zorg ervoor dat u interne en externe standaarden gebruikt. Het effect van saliniteit op SNC-toxiciteit was duidelijk zichtbaar. De inductie van misvorming of dood was duidelijk saliniteitsafhankelijk.
Er werden verschillende fysiologische metingen uitgevoerd. Hartslag bleef onaangetast tot de saliniteit 30 X ERM bereikte. Lichaamslengte was significant korter bij saliniteiten van 15 en 30 X ERM.
Oogdiameter daalde ook, consistent met lichaamslengte. Het uitkomen was minder waarschijnlijk bij 15 X ERM, en vond slechts plaats voor twee procent van de eieren in 30 X ERM. Onder de experimentele oplossingen vormden wateroplosbare metaalcomplexen zich gemakkelijker naarmate de zoutconcentratie toenam.
Onderzoek van de metaalcomplexen in de embryo's na zes dagen toonde aan dat ze in concentratie toenamen in de embryo's naarmate ze in concentratie toenamen in de oplossing. Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden het pH van de testcondities aan te passen, omdat de afgifte van zilverionen wordt gefaciliteerd door zure omstandigheden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe high-throughput methode voor het beoordelen van de zoutgehalte-afhankelijke toxiciteit van chemicaliën voor aquatische embryo's, met een specifieke focus op medaka. De methode vult een belangrijk hiaat in de ecotoxicologie in door evaluatie van chemische toxiciteit over verschillende zoutgehalten mogelijk te maken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Ecotoxicologie
- Aquatische toxicologie
- Milieuwetenschappen
Achtergrond
- Embryonale stadia van aquatische organismen zijn zeer gevoelig voor xenobiotica.
- Huidige methoden testen de zoutgehalte-afhankelijkheid van chemische toxiciteit onvoldoende.
- Inzicht in de toxiciteit bij verschillende zoutgehaltes is cruciaal voor milieubeoordelingen.
- De medakavis wordt gebruikt als modelorganisme voor toxiciteitstesten.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het testen van de toxiciteit van chemicaliën bij verschillende zoutgehaltes.
- Om het begrip van de chemische effecten op het aquatisch leven in variërende omgevingen te vergroten.
- Om een kader te bieden voor toekomstige ecotoxicologische studies.
Gebruikte methoden
- Bereiding van commerciële zilvernanocolloïden bij verschillende zoutgehaltes.
- Kweken van medakavis en verzamelen van eitjes.
- High-throughput toxiciteitstests onder zoetwater-, brakwater- en zeewatercondities.
- Beoordeling van chemische effecten op de embryonale ontwikkeling.
Belangrijkste resultaten
- De nieuwe methode meet effectief de toxiciteit van chemicaliën onder verschillende zoutgehaltecondities.
- Resultaten wijzen op significante variaties in toxiciteit op basis van zoutgehalteniveaus.
- Medaka-embryo's vertonen een betrouwbare respons op blootstelling aan chemicaliën bij verschillende zoutgehaltes.
- De techniek heeft bredere implicaties voor de beoordeling van chemische toxiciteit in aquatische omgevingen.
Conclusies
- Deze methode biedt een nieuwe benadering voor het evalueren van chemische toxiciteit in aquatische organismen.
- De bevindingen dragen bij aan het vakgebied van de ecotoxicologie door de effecten van saliniteit te adresseren.
- De studie onderstreept het belang van het meewegen van omgevingsfactoren bij toxiciteitsbeoordelingen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Zoutgehalte-afhankelijke toxiciteitsassays met medaka-eitjes stellen biopharma R&D-teams in staat om de chemische veiligheid en mechanistische toxiciteit te evalueren onder fysiologisch uiteenlopende aquatische omstandigheden. Deze aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen voor milieurisicobeoordelingen en ondersteunt het vroegtijdig beperken van risico's voor nanomateriaal-kandidaten. Door het zoutgehalte als variabele te integreren, wordt een kritisch hiaat in standaard toxiciteitsworkflows opgevuld, wat bijdraagt aan portfoliobeslissingen voor verbindingen met potentieel voor blootstelling in het milieu.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt mechanistische analyse van de toxiciteit van verbindingen over verschillende milieugradiënten mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van toxiciteitspaden die worden beïnvloed door ionsterkte en osmotische druk.
- Verbetert de voorspellende betrouwbaarheid voor milieuveiligheidsprofielen van nieuwe chemische entiteiten.
Screening & assayontwikkeling
- Faciliteert de voorbereiding van gevalideerde embryo-gebaseerde assays voor high-throughput screening onder variabele saliniteit.
- Standaardiseert kwantitatieve eindpunten zoals hartslag, oogdiameter en uitkleksnelheid voor een reproduceerbare toxiciteitsbeoordeling.
- Maakt een robuuste vergelijking van compound-effecten mogelijk over zoetwater-, brakwater- en zeewatereanalogen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt toxiciteitstesten met relevante milieublootstellingen in de echte wereld voor de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Ondersteunt de continuïteit van screening in de ontdekkingsfase tot preklinische evaluatie van milieurisico's.
- Biedt mechanistische risicovermindering voor verbindingen met potentiële aansprakelijkheden bij blootstelling in aquatische milieus.
Integratie van pipeline en workflow
Deze assay bevindt zich in het continuüm van vroege ontdekking tot preklinische risicobeoordeling en slaat een brug tussen mechanistische toxiciteitsevaluatie en milieuveiligheidsprofielering.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing op door zoutgehalte gemoduleerde toxiciteitsmechanismen en bioaccumulatie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de evaluatie van verbindingen over verschillende condities heen.
- Analytics: Biedt ICP-MS-gebaseerde kwantificering van zilveraccumulatie en fysiologische eindpunten voor vergelijkende analyse.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt laboratoriumbevindingen met scenario's van omgevingsblootstelling voor regelgevende en veiligheidsoverwegingen.
- Herbruikbaarheid binnen de Organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor het beoordelen van diverse nanomaterialen en chemicaliën onder variabele aquatische condities.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in toxiciteitsuitkomsten binnen verschillende milieucontexten.
- Operationele waarde: Standardiseert toxiciteitsassays op basis van embryo's voor schaalbare, reproduceerbare workflows.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen voor verbindingen met een risico op blootstelling aan het milieu.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van chemische kandidaten mogelijk op basis van milieuveiligheidsprofielen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in aquatische modelsystemen en het hanteren van embryo's.
- Vereist toegang tot ICP-MS-instrumentatie voor kwantitatieve metaalanalyse.
- Vraagt om strikte standaardisatie van assaycondities en eindpunten tussen verschillende teams.
- Aanpasbaar aan andere aquatische soorten met passende protocolwijzigingen.
- Afhankelijk van nauwkeurige controle van de pH en saliniteit om de validiteit van de assay te waarborgen.
