Name: DNA Elektroporatie, Isolatie en beeldvorming van myofibers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Leer DNA-elektroporatie en isolatie van myofibers uit de flexor digitorum brevis van muizen voor eiwitlokalisatiestudies. Deze methode maakt onderzoek in volwassen spiervezels mogelijk zonder transgene dieren te genereren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health verleent NS047726, NS072027 en AR052646.

De methoden die in dit onderzoek werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische Northwestern University Feinberg School of Medicine Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurde richtlijnen. Alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren. 1. Experimentele Procedure voor in vivo Elektroporatie van de Flexor digitorum Brevis (FDB) Muscle Bundle in Mouse <ol><li> Ontwerp plasmiden voor in vivo expressie met behulp van een promotor waarvan bekend expressie in zoogdiercellen (bijvoorbeeld, cytomegalovirus, CMV) of spier (bijvoorbeeld spier creatine kinase, MCK) 6,7. Grotere plasmiden kan uitdrukken op lagere niveaus. De CMV promoter is uitgebreid 6,7 toegepast. </li><li> Zuiver plasmiden uit E. coli gebruiken endotoxine-vrije omstandigheden volgens de instructies van de fabrikant. Los het plasmide in steriele, endotoxine-vrij TE-buffer bij 2 - 5 ug plasmide / ul. </li><li> Verdun en aliquot het plasmide een concentration van 20 ug DNA in 10 ui steriel endotoxine vrije TE (2 ug / ul) buffer per injectie in een steriele microcentrifugebuis. Bereid één portie per injectie. </li><li> Verdun de voorraad van hyaluronidase tot 1x met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (PBS - / -) wat een eindconcentratie van 8 eenheden. Aliquot 10 pi verdund hyaluronidase per injectie in een steriele microcentrifugebuis. </li><li> Verdoven van de muis met behulp van 2,5% isofluraan totdat verdoofd en niet reageert op de staart of teen knijpen. Plaats het dier in liggende positie op een verwarmingselement of verwarmen tabel normale lichaamstemperatuur. </li><li> Reinig de voetzool van de muis met een afwisselende toepassing van een povidonjood scrub en alcohol driemaal met een prep techniek afkomstig van de naald zelf en straalt naar buiten. Deze techniek houdt de naald site in een aseptische toestand, het minimaliseren van pathogeen introductie. </li><li> Injecteer de voetzool van the muis met 10 gl van de 1 x hyaluronidase-oplossing (2 mg / ml = 8 eenheden) tussen de huid en de spier met een steriele 1 ml spuit. Hyaluronidase verteert componenten van de extracellulaire matrix efficiëntere intrede van plasmide in myovezels mogelijk. Voer bij de basis van de hiel en vooraf de naald naar de tenen. Langzaam de vloeistof los als de naald wordt teruggetrokken. De injectie onder de huid zal uitbreiden en beginnen om roze te zetten. </li><li> Herhaal de stappen 1,6 en 1,7 op de contralaterale voet. </li><li> Koppel de anesthesie en plaats de muis terug in de kooi. Laat de muis om volledig te herstellen van anesthesie. </li><li> Wacht 2 uur. </li><li> Herhaal de verlamming en de voet sterilisatie procedures, stappen 1.5 en 1.6. </li><li> Injecteer de verdunde plasmide DNA in de voetzool op dezelfde manier als de hyaluronidase. Zorg ervoor dat het maximale volume is 20 ul of minder. Voor dubbele plasmide expressie injecteer 20 pg van elk plasmide met een maximaal volume van 20 &amp;# 181; l of minder. </li><li> Herhaal het plasmide injectie in de contralaterale voetzolen of gebruik de contralaterale voet control injecties. </li><li> Op de voet de aanvankelijk geïnjecteerd, til de huid van het onderstrepen spier fijne pincet en plaats een 27 G naald door de bal van de huid bij de tenen in een positie loodrecht op het genezen teen lijn van de voet. Neem een ​​tweede steriele 27 G naald en plaats het horizontaal door de huid op de hiel. Plaats naalden evenwijdig aan elkaar ~ 1 cm. </li><li> Met behulp van alligator klemmen, klem elektroden op de parallelle naalden zorg ervoor dat de naalden niet met elkaar in contact. Het gebruik van boetseerklei kan de klemmen vast te zetten. </li><li> Sluit elektroden een elektrische stimulator. </li><li> Electroporate de spier door toepassing van 20 pulsen, 20 msec duur / elke op 1 Hz bij 100 V / cm. De tenen kan trillen met stimulatie. </li><li> Herhaal de stimulatieprocedure aan de contralaterale voet indien nodig. </li><li>Naalden te verwijderen. Veeg de voetzool met povidonjood scrub. </li><li> Schakel de anesthesie. Zet de muis om het herstel kooi en controleren activiteit. Als de procedure werd uitgevoerd zoals verwacht, dient het dier normaal ambulant weer binnen 30 min en vertonen geen verschil in ambulation of activiteitsniveau van pre-injectie gedrag. Daarom zijn geen post-procedure analgetica nodig. Na herstel, de terugkeer van de dieren aan het terrarium. Opmerking: Eiwit expressie kan worden geanalyseerd al 48 uur na elektroporatie. Echter, om meer volledig herstel na elektroporatie toestaan, geven we de voorkeur isolatie en studie van myovezels 7-14 dagen na elektroporatie 10. Expressie kan zolang 4 weken na elektroporatie worden getest. </li></ol> 2. Experimentele procedure voor isolatie van de Flexor digitorum Brevis (FDB) Vezels <ol><li> Dooi collagenase. Voor elke FDB bundel bereiden twee putten in een 12-well weefselkweek plaat. In een goed voeg 1 ml voorverwarmde Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagles Media plus runderserumalbumine (DMEM + BSA) en in de andere goed voeg 1 ml voorverwarmde Ringers oplossing. Bovendien, voeg verse 10 ml 1x Ringers oplossing om de 35 mm Sylgard schaal. </li><li> Offer het dier door middel van CO 2 of verdovend gas inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie of een andere methode om de dood te verzekeren. </li><li> Verwijder de achterste voet boven het enkelgewricht met een schone scheermesje en dompel in 1x Ringers oplossing in de 35 mm Sylgard schotel. </li><li> Pins een voet strak, tong naar boven, op de Sylgard schotel met 30 G naalden door elk van de 5 tenen tips en bij de enkel. </li><li> Te beginnen bij de enkel, knip de huid recht omhoog de zijkant van de voet langs de haarlijn in de richting van de tenen, voorzichtig niet te nick de spier onder de huid. Herhaal aan de andere kant van de voet. </li><li> Houd de huid aan de basis van de enkel met een fijne tang, snijd de huid over de hiel. </li><li> Het opheffen van de huidflap met een pincet, richt je schaar in de richting van de huid om niet nick de spier. Knip het onderliggende bindweefsel, effectief verwijderen van de huid. </li><li> Voor het verwijderen van de FDB spier bundel snijd de grote pees aan de hiel om de pees van het bot te bevrijden. Houdt de pees met een tang, ontleden de FDB bundel van de grote witte pees zorgvuldig verwijderen van bindweefsel bevestigd aan de FDB met een schaar. Indien goed uitgevoerd de bundel zal gemakkelijk tillen van de onderliggende pezen onthullen van helder wit pezen die leidt naar de individuele cijfers. Snijd de FDB aan de pezen in de buurt van de tenen te bevrijden van de bundel van de voet. </li><li> Plaats de hele spier bundel in de put met DMEM + BSA. </li><li> Herhaal dit aan de contralaterale voet. </li><li> Zodra alle FDB spieren geïsoleerd, voeg 100 ul van collagenase aan elk putje met DMEM + BSA en spieren. </li><li> Controleer het succes van elektroporatie op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop voorafgaand aan digestie. Als gedaan properly, ruim 90% transfectie efficiëntie kan worden bereikt. </li><li> Incubeer de plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator bij 10% CO2 gedurende ongeveer 1 uur. De incubatietijd kan variëren, afhankelijk van de ziekte van het model en de achtergrond en het lot van collagenase. </li><li> Na 1 uur voorzichtig de FDB bundel te dragen aan het putje met enige Ringers oplossing. </li><li> Vermaal de FDB bundel in de put met Ringers oplossing met behulp van een pipet 1 ml. Snijd het uiteinde van de pipetpunt met een schoon scheermesje zodat de bundel gemakkelijk passeren de pipetpunt. Zachtjes vermaal de spier (~ 15 maal), waardoor de bundel om te laten liggen en parallel tot de top. Intact vezels zal vallen in de Ringers Solution. Wanneer vezels niet gemakkelijk vallen de bundel, plaatst de spier terug in collagenase oplossing. </li><li> Plaat de geïsoleerde vezels op de schotel ~ 500 ul per plaat. </li><li> Laat de spier te verteren in de put gedurende 15 min. </li><li> Herhaal de stappen 2,152,17 totdat de bundel kleiner wordt en de meeste vezels gescheiden van de bundel (meestal in totaal 2-3 keer). Eenmaal los van de spieren gemakkelijk gaat door een 1 ml pipet tip. </li><li> Laat vezels hechten aan de schaal minimaal 15 min. Verse Ringers oplossing kan worden toegevoegd aan de plaat residuele collagenase verdunnen of veranderd afhankelijk tijdsdruk. Opmerking: Vezels zijn nu klaar voor beeldvorming. </li></ol> 3. Experimentele procedure voor de visualisatie van de Laser-induced Membraan Schade met confocale microscopie <ol><li> Load vezels onmiddellijk voorafgaand aan beeldvorming met 300 ul 2,5 uM FM 1-43 van FM 4-64 kleurstof in Ringers oplossing. In het algemeen, het vezels 15 min tot 2 uur na isolatie. Echter, kunnen vezels worden afgebeeld tot 24 uur na isolatie. </li><li> Plaats de glazen bodem schotel op een confocale microscoop uitgerust met een UV laser en een 60X / 63x objectief. </li><li> Zoek een vezel. Zorg ervoor dat de vezels stevig bevestigdom de schotel door de microscoop basis tikken. Uitsluiten vezels die werden beschadigd in de dissociatie proces. Beschadigde vezels kunnen membraan blebs, opname een hoog niveau van FM kleurstof, krul bevatten of buigen intens. </li><li> Om membraanschade op de vezel veroorzaken, plaatst de sarcolemma in het midden van het afbeeldingsvenster met een veld duidelijke kernen. Focus op de sarcolemma gebruik van de FM-kleurstof-kanaal, zodanig dat de sarcolemma is zeer scherp. </li><li> Plaats de ROI kruis haren op de sarcolemma gebruik van de FM-kanaal 4-64. </li><li> Bestralen een 1 pixel punt op 80% vermogen voor 3 sec (~ 350 nm x 350 nm gebied). FM kleurstof de cel binnengaan op de plaats van verwonding. Kracht en kan worden ingesteld hoger of gebied van insult verminderen. </li><li> Beelden vastleggen van de vezel voordat schade bij de schade, elke 2 seconden na beschadiging, vervolgens elke 10 sec tot 5 min. Timing kan worden aangepast afhankelijk van de behoefte. Individuele beelden kunnen worden omgezet in time-lapse filmpjes in Afbeelding J. </li><li> Herhaal stap3,3 tot 3,7 op maximaal 3 vezels per gerecht. </li></ol>

<ol><li>Blau, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+the+differentiated+state%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plasticity of the differentiated state.</a> Science. 230, 758-766 (1985).</li>
<li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li>
<li>Richler, C., Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+cultivation+and+differentiation+capacities+of+myogenic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines.</a> Dev Biol. 23, 1-22 (1970).</li>
<li>Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+differentiation+potentialities+during+prolonged+cultivation+of+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skelet muscle. 1, 34(2011).</li>
<li>DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transfection+of+mammalian+skeletal+muscles+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation.</a> J Vis Exp: JoVE. , (2009).</li>
<li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).</li>
<li>Kerr, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin+stabilizes+stress-induced+Ca2%2B+signaling+in+the+transverse+tubule+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).</li>
<li>Anderson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micropeptide+encoded+by+a+putative+long+noncoding+RNA+regulates+muscle+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance.</a> Cell. 160, 595-606 (2015).</li>
<li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca%282%2B%29-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+blebbing+as+an+assessment+of+functional+rescue+of+dysferlin-deficient+human+myotubes+via+nonsense+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+physiol%22%5BJournal%5D)">Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression.</a> J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).</li>
<li>Marg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcolemmal+repair+is+a+slow+process+and+includes+EHD2%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2.</a> Traffic. 13, 1286-1294 (2012).</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Defour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin+regulates+cell+membrane+repair+by+facilitating+injury-triggered+acid+sphingomyelinase+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion.</a> Cell Death Dis. 5, e1306(2014).</li>
</ol>

Er zijn geen belangenconflicten.

Het gebruik van elektroporatie fluorescent gemerkte eiwitten te bestuderen in vivo is bij uitstek geschikt voor de studie van spieren vanwege het ontbreken van geschikte cellijn modellen repliceren de gehele celstructuur van spieren. Dit protocol beschrijft het gebruik van elektroporatie en hoge-resolutie confocale microscopie gedetailleerde beeldvorming van eiwit lokalisatie en translocatie after laser verwonding. Deze methode kan worden aangepast aan andere cellulaire processen waaronder cytoskelet reorganisa...

Individuele myovezels zijn groot, zeer georganiseerde syncytieel cellen. Er zijn enkele celkweek modellen voor spier; echter, deze modellen hebben als belangrijkste beperking dat ze niet volledig differentiëren tot rijpe myovezels. Zo worden de C2C12 en L6 cellijnen afgeleid van respectievelijk 1-4 muizen en ratten. Onder omstandigheden van serum honger, de mononucleaire &quot;myoblast-achtige&quot; cellen ophouden proliferatie ondergaan celcyclus terugtrekking, en treedt in de myogene programma vormen meerkernige cellen met sarcomeren, aangeduid als myotubes. Bij langdurige kweekomstandigheden, kan myotubes contractiele eigenschappen vertonen en &quot;twitch&quot; in de cultuur. Humane cellijnen zijn nu ook vastgesteld 5. Naast deze geïmmortaliseerde cellijnen, mononucleaire myoblasten kan worden geïsoleerd uit spieren en onder vergelijkbare omstandigheden serumuithongering zal myotuben vormen. Deze cellijnen en primaire myoblasten culturen zeer gebruikenful omdat ze kunnen worden getransfecteerd met plasmiden of getransduceerd met virussen en gebruikt fundamentele celbiologische processen te bestuderen. Echter, deze cellen, zelfs wanneer aangezet tot myotubes vormen missen veel van de opvallende kenmerken van volwassen spieren organisatie. Specifiek myotubes veel kleiner dan individuele spiervezels volwassen en niet de normale vorm van myovezels. Kritisch, myotubes missen dwarsrichting (T) buisjes, de vliezig netwerk vereist voor efficiënte Ca2 + afgifte gehele myoplasm. Een alternatieve methode om de primaire myoblast of myogenic cellijnen met zich meebrengt met volwassen myovezels. Transgenese kunnen worden toegepast om expressie van gemerkte eiwitten vast te stellen, maar deze methode is kostbaar en tijdrovend. In vivo elektroporatie van muizenspier ontstaan ​​als voorkeursmethode voor de snelheid en betrouwbaarheid 6-10. Werkwijzen voor in vivo elektroporatie en efficiënte isolatie van myofibers have is geoptimaliseerd voor de muis flexor digitorum brevis (FDB) spier 6. De werkwijzen kunnen gemakkelijk worden voltooid en minimaal invasieve induceren in vivo expressie vanaf plasmiden. Deze aanpak wordt nu gecombineerd met beeldvormende methoden hoge resolutie inclusief beeldvorming na laser verstoring van de sarcolemma 6,7. De combinatie van fluorescente kleurstoffen en expressie van fluorescent gelabelde eiwitten kunnen worden gebruikt om celbiologische processen volwassen spiervezels volgen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td>Dissection Media Verdunning: 50 ml +100 g BSA</td></tr><tr><td>Collageenase, Type II</td><td>Life Technologies</td><td>17101-015</td><td>Vezelvertering Verdunning: 160 mg / 4 ml DMEM (voorraad 40 mg/ml aliquot)</td></tr><tr><td>Falcon 12-wells platen</td><td>Fisher Scientific</td><td>877229</td><td>Vezelvertering</td></tr><tr><td>Ringers Oplossing</td><td></td><td></td><td>Vezelvertering en Beeldvorming Verdunning: 146 mM NaCl 5 mM&nbsp;&nbsp; KCl 2 mM&nbsp;&nbsp; CaCl2 1 mM&nbsp;&nbsp; MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O</td></tr><tr><td>1 ml Pipetten</td><td>Axygen</td><td>T-1000-C-R</td><td>Vertering</td></tr><tr><td>Holbladen</td><td>Personna</td><td>94-120-71</td><td>Vertering</td></tr><tr><td>Precision Glide 30 G naald</td><td>BD Biosciences</td><td>305128</td><td>Dissectie</td></tr><tr><td>1x PBS (-/-)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>Dissectie</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-366-794</td><td>Dissectie</td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>FST by Dumont</td><td>#5/45</td><td>Dissectie</td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>Roboz</td><td>RS-4913</td><td>Dissectie</td></tr><tr><td>Schaar</td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td>Dissectie</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Dissectie media Verdunning: 100 mg/50 ml DMEM</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm platen</td><td>Fisher Scientific</td><td>08772B</td><td>Dissectie- gebruikt om sylgard vast te houden</td></tr><tr><td>Klei</td><td></td><td></td><td>Elektroporatie</td></tr><tr><td>Stimulator&nbsp;</td><td>Grass</td><td>s88x</td><td>Elektroporatie</td></tr><tr><td>Klemmen</td><td>Radio Shack</td><td>270-356</td><td>Elektroporatie</td></tr><tr><td>Triadine</td><td>Aplicare</td><td>82-220</td><td>Elektroporatie</td></tr><tr><td>Precision Glide 27 G naald</td><td>BD Biosciences</td><td>305136</td><td>Elektroporatie</td></tr><tr><td>Simulator</td><td>Grass</td><td>SIU-V</td><td>Elektroporatie</td></tr><tr><td>Gaas</td><td>Covidien</td><td>2146</td><td>Elektroporatie</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>Injectie Verdunning: Voeg 160 ul PBS (1x) toe aan 40 &micro;l 5x stock</td></tr><tr><td>1 cc U-100 Insulinespuit (28G1/2)&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>329420</td><td>Injectie</td></tr><tr><td>Eppendorfbuisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td>Injectie</td></tr><tr><td>35 mm glas bodem Microwell plaat</td><td>MaTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Life Technologies</td><td>T-13320</td><td>Microscopie Verdunning: Eind 2.5 ug/ml</td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Life Technologies</td><td>T-35356</td><td>Microscopie Verdunning: Eind 2.5 ug/ml</td></tr><tr><td>Endotoxinvrije Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Plasmid Zuivering</td></tr></tbody></table>

dna elektroporatie, isolatie en beeldvorming van myofibers

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Volwassen spier heeft een unieke structuur die zich leent voor beeldvorming van levende cellen. Hier beschrijven we het experimentele protocol voor het tot expressie brengen van fluorescerende gelabelde eiwitten in de flexor digitorum brevis (FDB) spier. De omstandigheden zijn geoptimaliseerd om een groot aantal hoogwaardige myofibers te bieden die het geëlektropeerde plasmide tot expressie brengen, terwijl schade aan de spier tot een minimum wordt beperkt. De methode gebruikt fluorescerende tags op verschillende eiwitten. Het combineren van deze expressiemethode met hoogwaardige confocale microscopie maakt beeldvorming van levende cellen mogelijk, inclusief beeldvorming na laser-geïnduceerde schade. Fluorescerende kleurstoffen gecombineerd met beeldvorming van fluorescerend gelabelde eiwitten leveren informatie over de basisstructuur van spier en de respons ervan op stimuli.

Elektroporatie is een minimaal invasieve techniek die efficiënt introduceert gezuiverd plasmide-DNA in het flexor digitorum brevis (FDB) spierbundel (Figuur 1A). Zeven dagen na transfectie fluorescent gelabeld eiwit wordt gevisualiseerd in geïsoleerde myovezels (Figuur 1B). Geïsoleerde vezels worden daarna uitgeplaat en voorbereid voor weergave op een confocale microscoop. Vezels kunnen worden blootgesteld aan laser geïnduceerde verwonding. FM kleurstof ...

Dit protocol maakt gebruik van elektroporatie om fluorescerend gelabelde eiwitten te introduceren en tot expressie te brengen in muisspiervezels. Na herstel na elektroporatie worden de vezels geïsoleerd. Individuele vezels worden vervolgens geïmaged met behulp van hoge resolutie confocale microscopie om de spierstructuur te visualiseren.

DNA Elektroporatie, Isolatie en beeldvorming van myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van myofibrillen uit de musculus flexor digitorum brevis van muizen, zodat het sarcolemma vervolgens kan worden beschadigd door middel van laserwounding. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de eiwitfunctie en lokalisatie kunnen worden bestudeerd in volwassen myofibrillen zonder dat er transgene muizen gegenereerd hoeven te worden. Deze methode kan worden aangepast om farmaceutische middelen en andere methoden van celbeschadiging te testen.Begin met het ontdooien van de collagenase-oplossing. Bereid vervolgens twee putjes van een 12-wellplaat voor. Voeg aan elk putje waarin een vezel moet worden geïsoleerd één milliliter voorverwarmde DMEM plus BSA toe en vul het andere putje met één milliliter voorverwarmde 1x Ringer-oplossing.Bereid daarnaast een cigar-schaaltje van 35 millimeter voor met 10 milliliters verse 1x Ringer-oplossing. Nadat de poten van het getransfecteerde dier zijn verwijderd, wordt één poot met de zool naar boven strak op het cigar-schaaltje gepind met 30 gauge naalden door elke van de vijf teentopjes. Bereid elke poot bij de enkel als volgt voor.Knip eerst de huid in. Begin bij de enkel en snijd l

dna-electroporation-isolation-and-imaging-of-myofibers

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven gedetailleerde procedures voor de efficiënte transfectie van plasmide DNA in de vezels van mond spieren van levende muizen met behulp van elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van eiwitexpressie met behulp van fluorescentie microscopie.

DNA Transfectie van zoogdieren skeletspieren met behulp van In Vivo Elektroporatie

This video demonstrates the isolation of single myofibres from harvested murine Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle. The isolated myofibres can be cultured to study myofiber-associated muscle stem cell activity.

Myofiber Isolation: A Technique to Obtain Single Myofibers from Harvested Mouse Extensor Digitorum Longus (EDL) Muscle

Isolatie en cultuur van myovezels is de gouden...

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

Zebravis zijn een opkomende systeem voor het modelleren van menselijke aandoeningen van de skeletspieren. We beschrijven een snelle en efficiënte methode om skeletspier myovezels isoleren van embryonale en larvale zebravis. Deze methode levert een high-density myofiber voorbereiding geschikt voor onderzoek met een enkelvoudige skeletspieren vezelmorfologie, eiwit lokalisatie, en spier-fysiologie.

Analyse van de embryonale en larvale zebravis Skeletal myovezels van Gedissocieerde Voorbereidingen

We beschrijven een nieuwe experimentele techniek die wij minimaal invasieve spier insluiten (MIME), die is gebaseerd op het bewijsmateriaal bellen dat skelet spierweefsel levensvatbare myogenic cellen, die vergemakkelijken donor-cel-gemedieerde myogenesis bevat kunnen wanneer ingeplant een host spier.

Minimaal invasieve spier insluiten (MIME) - een roman experimentele techniek ter vergemakkelijking van de Donor-cel-gemedieerde Myogenesis

Skeletspieren differentiatie is een uiterst dynamisch proces, die met name gebaseerd op nucleaire positionering is. Hier beschrijven we een methode voor het bijhouden van de bewegingen van de kernen door levende cel imaging tijdens myoblast differentiatie en myotube vorming en voor het uitvoeren van een kwantitatieve karakterisering van de dynamiek van de kernen door het extraheren van informatie van automatisch bijhouden.

Exploitatie van de levende Imaging te Track kernen tijdens Myoblast differentiatie en Fusion

Hier gepresenteerd is een protocol om de contractiele eigenschappen van gestreepte spier myofibrils met nano-Newton resolutie te beoordelen. Het protocol maakt gebruik van een setup met een interferometrie-gebaseerde, optische kracht sonde. Deze opstelling genereert gegevens met een hoge signaal-ruisverhouding en maakt de beoordeling van de contractiele kinetiek van myofibrils mogelijk.

Myofibrils isoleren van skeletspierbiopten en het bepalen van contractielfunctie met een Nano-Newton Resolution Force Transducer

Hier stellen we een methode voor om efficiënt te verkrijgen enkele spiervezels in de vroege postnatale ontwikkelingsstadia van homozygoot mutant Lamin Δ8-11 muis model, een zeer ernstig model voor Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD).

Single Myofiber isolatie en cultuur van een Murine Model van Emery-Dreifuss Spierdystrofie in de vroege post-natale ontwikkeling

In dit protocol wordt een in vitro kweek- en functionele analysemethode voor spierstamcellen beschreven, die de meeste van hun interacties met hun endogene niche behoudt.

Single Myofiber Culture Assay voor de beoordeling van volwassen spierstamcelfunctionaliteit Ex Vivo

We beschrijven een protocol om enzymatisch gedissocieerde vezels van verschillende lengtes en typen te verkrijgen uit zes spieren van volwassen muizen: drie daarvan zijn al beschreven (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) en drie van hen zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis

Dit protocol beschrijft de isolatie van intacte enkele spiervezels uit de oxidatieve soleus en het vestigen van sterk gezuiverde myoblastculturen afkomstig van deze vezels. De geoptimaliseerde procedure levert betrouwbaar ongeveer 300–500 intacte myovezels per muis op, waardoor downstream moleculaire en cellulaire analyses mogelijk zijn.

Isolatietest voor één vezel voor de beoordeling van oxidatieve myovezelgedrag

Leer DNA-elektroporatie en isolatie van myofibers uit de flexor digitorum brevis van muizen voor eiwitlokalisatiestudies. Deze methode maakt onderzoek in volwassen spiervezels mogelijk zonder transgene dieren te genereren.

DNA Elektroporatie, Isolatie en beeldvorming van myofibers

Meer video's verkennen