Opstellen en testen van impedantie-gebaseerde Fluidic biochips met RTgill-W1 Cellen voor snelle evaluatie van Drinkwater Monsters voor de toxiciteit
7 maart 2016
Dit manuscript beschrijft hoe je vloeistofbionchips bereidt met epitheelcellen van de kieuwen van regenbooforen voor gebruik in een draagbare elektrische cel-substraat impedantiesensor in het veld. Het protocol voor het uitvoeren van een snelle drinkwatertoxiciteitstest met de sensor wordt ook beschreven.
Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe een biosensor kan worden gebruikt om de toxiciteit van drinkwatermonsters te evalueren. Dit wordt bereikt door biochips te maken die een monolaag van regenboogforellenkieuwcellen bevatten en deze vervolgens te gebruiken als onderdeel van een op impedantie gebaseerde biosensor. Deze procedure biedt een manier om chemische toxiciteit in drinkwatervoorraden snel te detecteren op niveaus die relevant zijn voor de menselijke gezondheid.
De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de biochips onder veldcondities kunnen worden gebruikt, ze kunnen worden bewaard in de kou gedurende maximaal negen maanden zonder enige zorg of onderhoud van de cellen, en dat ze in gereedheid zijn voor testen en op elk moment kunnen worden gebruikt na verwijdering uit de koelkast. Jordan McNairn, een bachelorstudent uit ons laboratorium, zal deze procedure demonstreren. De dag voor het zaaien van cellen, verwijder de biochips uit hun verpakking en plaats ze in gesteriliseerde plastic instrumentenkoffers.
Bevestig een van de slangassemblages aan de spuit en trek een 20%bleach-oplossing op in een 20 milliliter spuit. Injecteer twee milliliter van de oplossing in elk kanaal van de biochip. Laat de biochips na voltooiing een uur staan met de bleekvloeistofoplossing.
Gebruik na een uur een steriele 1 milliliter spuit voorzien van een mannelijke slip luer-assemblage die is bevestigd aan een vacuümlijn om de bleekvloeistofoplossing uit beide kanalen te aspireren. Nadat de bleekvloeistof uit de biochip is geaspireerd, bevestigt u een steriele slangassemblage met mannelijke slip luers aan beide uiteinden aan de biochip om deze te gebruiken als afvoer tijdens het spoelen van de biochips. Trek vervolgens steriele water op in een 20 milliliter spuit en spoel elk kanaal van de chip met vijf milliliter water.
Aspireer het water zoals hiervoor. Plaats de biochips terug in de plastic instrumentenkoffers. Laat de biochips in de bioveiligheidskap tot de volgende dag staan.
Een uur voor het zaaien van de biochips, injecteer twee milliliter van een 10 microgram per milliliter fibronectine-oplossing in elk kanaal van de biochip. Incubeer de biochips in de bioveiligheidskap gedurende 60 minuten en aspireer vervolgens de fibronectine-oplossing. Plaats ten slotte twee steriele biochip-slangassemblages op de poorten van de biochips en zet de biochips opzij totdat de cellen klaar zijn voor zaaien.
Verwijder één confluente T-175 fles met regenboogforellenkieuw epitheelcellen uit de incubator en plaats deze in de bioveiligheidskap. Eén confluente T-175 fles kan ongeveer 16 biochips zaaien. Aas de media van de cellen af.
Spoel ze met PBS en aspireer PBS af. Voeg vervolgens zes milliliter Trypsin-EDTA-oplossing toe aan de cellayaer. Incubeer de fles op kamertemperatuur gedurende ongeveer vijf minuten.
Voeg vervolgens 15 milliliter compleet L-15 celkweekmedium toe aan elke fles om de trypsine te deactiveren. Neem een kleine aliquot van de celsuspensie en gebruik een hemocytometer om de concentratie van de cellen te meten. Bekijk de cellen met behulp van een lichtveldmicroscoop uitgerust met een 10x objectief.
Bereken vervolgens de huidige celconcentratie en pas de celsuspensie aan tot een concentratie van een kwart miljoen cellen per milliliter. Gebruik vervolgens een steriele 20 milliliter spuit om 2,5 milliliter van de celsuspensie in de buitenste poort van elk kanaal van de biochip te injecteren. Laat de extra celsuspensie uit de slang in een afvalinische stromen.
Maak vervolgens een gesloten lus voor elk kanaal van de biochip door het vrije uiteinde van de slang met een luer-fitting in de buitenste poort van elk kanaal te steken. Bevochtig vervolgens een papieren handdoek met 70%ethanol en gebruik deze om eventuele overtollige media van de gesloten lussen te vegen. Plaats vervolgens de biochips terug in een plastic doos.
Verwijder op dag vier en zeven de biochips uit de incubator. En verander de media in de biochips met temperatuuraangepaste compleet L-15 celkweekmedium. Verwijder na de voeding op dag zeven en gooi de slangen van de chips en steek de autoclaafafvoerpluggen in de biochips.
Plaats de biochips in een doos in een incubator van zes graden Celsius totdat ze worden gebruikt voor testen. Verwijder de ECIS-testlezer en benodigdheden uit de draagtas en zet vervolgens de lezer aan. Neem ook een van de voorbereide biochips uit de incubator van zes graden Celsius en plaats deze op een papieren handdoek.
Gebruik een 10 milliliter spuit om 10 milliliter controlewater te doseren in een gelabelde 0,5-ounce heldere plastic controlepot. Zorg ervoor dat u luchtbellen verwijdert voor een nauwkeurige meting. Gebruik vervolgens een afzonderlijke spuit en doseer 10 milliliter van het testmonster in een 0,5 ounce heldere plastic testpot.
Verwijder vervolgens twee poedermedia flacons. Open een van de poedermedia flacons en giet de hele inhoud van één flacon in de pot met het controlewater, waarbij u de volledige flacon in oplossing laat vallen. Herhaal deze procedure met de testpot.
Dek vervolgens af en schud de potten om ervoor te zorgen dat het poeder volledig is opgelost. Vul de blauwe 10 milliliter spuit met negen milliliter van de controleoplossing. En de rode 10 milliliter spuit met negen milliliter van de testoplossing uit hun respectievelijke flacons.
Verwijder eventuele bestaande luchtbellen uit de spuiten. Verwijder vervolgens de pluggen uit de biochip-poorten en bevestig de afvoer. Plaats de biochip in de verwijderbare plastic lade in de ECIS-lezer, sluit het deksel en bevestig vervolgens de gevulde spuiten aan de buitenste biochip-poorten.
Bevestig tenslotte de zuigers van de spuiten. Selecteer vanaf het hoofdscherm van de lezer Volgende om de voortest te starten. De software zal vervolgens de initiële impedanties controleren.
Als de impedanties binnen het bereik liggen, registreert het scherm "Cartridge is geslaagd" en geeft het de gebruiker opdracht om Volgende te selecteren. Voer vervolgens monsterinformatie in met behul
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een methode voor het bereiden van fluïdische biochips met behulp van kieuwithelcellen van de regenboogforel, welke worden gebruikt in een draagbare elektrische cel-substraat-impedantiesensor voor snelle toxiciteitstesten van drinkwater.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Milieutoxicologie
- Celbiologie
- Bio-engineering
Achtergrond
- De toxiciteit van drinkwater is een kritisch aandachtspunt voor de menselijke gezondheid.
- Biosensoren kunnen snelle beoordelingen van de waterkwaliteit bieden.
- Kieuwcellen van de regenboogforel dienen als biologische indicator voor toxiciteit.
- Velddraagbare sensoren verbeteren de toegankelijkheid van toxiciteitstests.
Doel van de studie
- Om de bereiding van biochips voor toxiciteitstesten te demonstreren.
- Om de effectiviteit van de biosensor bij het detecteren van chemische toxiciteit te evalueren.
- Om een protocol te bieden voor snelle testen onder veldomstandigheden.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van biochips met kieuwpitheelcellen van de regenboogforel.
- Gebruik van een impedantie-gebaseerde biosensor voor toxiciteitsevaluatie.
- Bewaring van biochips onder koude omstandigheden voor langere perioden.
- Stap-voor-stap protocol voor het zaaien van cellen en het testen ervan.
Belangrijkste resultaten
- De biosensor kan chemische toxiciteit detecteren die relevant is voor de menselijke gezondheid.
- Biochips blijven levensvatbaar voor testen na koude bewaring.
- Snelle testen kunnen worden uitgevoerd onder veldomstandigheden.
- Impedantiemetingen leveren betrouwbare gegevens voor toxiciteitsbeoordeling.
Conclusies
- De ontwikkelde biosensor is effectief voor snelle toxiciteitstests.
- Veldportabele biochips kunnen de monitoring van de waterkwaliteit aanzienlijk verbeteren.
- Deze methode biedt een praktische oplossing voor milieugezondheidsbeoordelingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Deze op impedantie gebaseerde biosensor maakt snelle, in het veld inzetbare toxiciteitscreening van drinkwater mogelijk met behulp van een biologisch relevant celmodel, wat vroege identificatie van gevaren in programma's voor milieumonitoring ondersteunt. Door kwantitatieve impedantiewaarden binnen één uur te leveren, faciliteert het tijdige go/no-go beslissingen voor beoordelingen van de waterveiligheid, waardoor de afhankelijkheid van tragere laboratoriumgebaseerde methoden wordt verminderd. De compatibiliteit van het systeem met gekoelde, gebruiksklare biochips vergroot de operationele flexibiliteit voor gedecentraliseerde testlocaties, waaronder militaire en gemeentelijke watersurveillance.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele beoordeling van cellulaire reacties op toxicanten mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie van verbindingen met potentiële off-target effecten.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare, kwantitatieve meting van veranderingen in de adhesie tussen cel en substraat, waardoor een objectieve vergelijking tussen test- en controlecondities mogelijk is.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert labelvrije real-time impedantiemetingen die cytotoxische effecten weerspiegelen over een breed spectrum van anorganische en organische chemicaliën.
- Operationele waarde: Ondersteunt assay-standaardisatie via geautomatiseerde statistische vergelijking van controle- en testkanalen, waardoor gebruikersafhankelijke variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van een goed gekarakteriseerde epitheliale cellijn (RTgill-W1) om de barrièrefunctie te modelleren, wat relevant is voor het voorspellen van door verbindingen geïnduceerde weefselschade.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Slaat een brug tussen in vitro-bevindingen en toepassingen voor de milieugezondheid door toxiciteit te detecteren bij concentraties die relevant zijn voor menselijke blootstelling.
- Operationele waarde: Maakt een snelle triage van monsters mogelijk, waardoor vervolganalytische chemie alleen wordt uitgevoerd bij vermoedelijke positieven, wat de efficiëntie van de workflow verbetert.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij hazardscreening door impedantiewijzigingen te correleren met bekende blootstelling aan toxicanten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen vroege discovery-workflows als een functionele screeningstool voor cytotoxiciteit, gepositioneerd na de synthese van verbindingen en vóór gedetailleerde mechanistische profilering, om verbindingen te prioriteren op basis van biologische activiteit.
- Ontdekkingsbiologie: Meet impedantie als functionele uitlezing van de cellulaire integriteit, wat hypothesetests ondersteunt met betrekking tot door verbindingen geïnduceerde verstoring van het membraan of de adhesie.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor medium-throughput screening van chemische bibliotheken of milieu monsters.
- Analytica: Genereert impedantie-tijdreeksgegevens die door geautomatiseerde software worden geanalyseerd om statistisch significante afwijkingen van de controle te detecteren, waardoor objectieve contaminatiebeoordelingen mogelijk zijn.
- Translationeel onderzoek: Verbindt cellulaire responsen met milieurisicobeoordeling, wat de continuïteit ondersteunt van laboratoriumscreening naar monitoring in het veld.
- Bedrijfbrede hergebruik: Biochips kunnen in batches worden geproduceerd, langdurig worden opgeslagen en on-demand worden ingezet, wat het gebruik van een herbruikbaar platform over meerdere testcampagnes ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanistisch inzicht in door verbindingen geïnduceerde cellulaire dysfunctie via real-time impedantie-tracking, waardoor ambiguïteit bij vroege toxiciteitsprofielering wordt verminderd.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde fluïdische toediening, geautomatiseerde analyse en minimale handmatige tijd tijdens het testen.
- Strategische waarde: Versnelt de tijdlijnen voor het detecteren van gevaren, waardoor snellere interventie mogelijk is en potentiële blootstellingsrisico's in waterveiligheidsprogramma's worden verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering door monsters die nader onderzoek vereisen snel te identificeren, wat de toewijzing van middelen bij milieumonitoring optimaliseert.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in celkweek voor het onderhouden en uitzaaien van RTgill-W1-monolagen om een consistente barrièrefunctie te garanderen.
- Afhankelijk van ECIS-compatibele instrumentatie en vloeistofbehandelingssystemen voor nauwkeurige monstertoevoer en impedantiemeting.
- Vereist gestandaardiseerde training voor aseptische biochipvoorbereiding en monsterinjectie om de integriteit van de assay tussen gebruikers te waarborgen.
- Houd rekening met de noodzaak van koudeketenopslag (6°C) om de levensvatbaarheid van de biochip te behouden, wat de inzet in omgevingen zonder koeling beperkt.
- De beperkte gevoeligheid voor cholinesteraseremmende pesticiden kan orthogonale methoden vereisen voor een uitgebreide pesticidenscreening, zoals vermeld in de bron.
