Name: Opstellen en testen van impedantie-gebaseerde Fluidic biochips met RTgill-W1 Cellen voor snelle evaluatie van Drinkwater Monsters voor de toxiciteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Leer de voorbereiding van impedantie-gebaseerde fluidic biochips met regenboogforel kieuweefselcellen voor snelle toxiciteitstests van drinkwater. Deze methode maakt veldtesten mogelijk en verbetert waterkwaliteitsmonitoring.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het US Army Medical Research and Materiel Command en door het Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer-programma; Contractnr. W81XWH-13-C-0093. We willen Dr. Lucy Lee aan de University of Fraser bedanken voor het zijn van onze RTgill-W1 celkweekmentor, en Dr. Niels Bols van de University of Waterloo erkennen voor de ontwikkeling van de RTgill-W1cellijn.

1. Bereiding van testmaterialen Opmerking: Om de biochips bereiden voor het testen, verscheidene confluente flessen van RTgill-W1 cellen moeten klaar staan. Een goede schatting van het aantal flessen nodig is een samenvloeiing T175 kolf gedurende 16 biochips worden gezaaid. <ol><li> Voer de volgende stappen in een klasse II bioveiligheidskast (biohood) met behulp van aseptische techniek. Gebruik 70% ethanol voor het ontsmetten van de biohood en materialen geplaatst in de kap. <ol><li> Bereid fibronectine substraat voor de vloeibare biochips door ontdooien een 1 mg flesje van fibronectine en verdunnen in 100 ml steriel L-15 medium voor een concentratie van 10 ug / ml. Bevriezen in 40 ml aliquots in steriele 50 ml conische polypropyleen buizen bij -20 ° C. Ontdooien bij kamertemperatuur enkele uren vóór het zaaien biochips. Eenmaal ontdooid, niet opnieuw invriezen. </li><li> Bereid celkweekmedia door toevoeging van 50 ml foetaal runderserum, 5 ml 200 mM L-alanyl-L-glutamine supcomplement en 5 ml penicilline / streptomycine-oplossing (10.000 eenheden penicilline / ml en 10.000 pg streptomycine / ml) bouillon aan 500 ml L-15 media. Dit wordt 560 ml celkweekmedium bevattende 9% serum werd verkregen. Koel. Opmerking: Dit zal de volledige celkweek media gebruikt voor de cultuur kolven en biochips zijn. </li></ol></li><li> Gepoederde Media Flesjes <ol><li> Bereid van tevoren 0,1 dram snap-cap flacons met 60 mg ± 0,5% van de L-15ex poeder met behulp van een geautomatiseerde poeder dispenser. Label de flesjes met de datum van de poeder werd afgegeven en in de koelkast flesjes (in hoeveelheden van 50) in hersluitbare gemetalliseerde plastic zakken; elk drie 1 g silicagel uitdroging packs. Opmerking: L-15ex poedervormige media flacons kunnen worden gemaakt en bewaard tot 9 maanden voorafgaand aan het testen. </li></ol></li><li> Voeg een oplossing van 100 ml 20% bleekmiddel door verdunning bleekmiddel met gedeïoniseerd (DI) water. Schatten dat 5 ml bleekwater oplossing nodig zullen zijn voor elk biochip. </li><li> Voeg biochip buis samenstellen door snijden 27 mm gedeelten van autoclaveerbare biocompatibele buis (2 delen per biochip wordt gezaaid) en breng de uiteinden van de buis met polycarbonaat slip luer fittings. Plaats tubing samenstellingen in een autoclaveerbare zak en autoclaaf gedurende 8 minuten bij 134 ° C. Ook autoclaaf biochip pluggen (2 per biochip) in een aparte zak bij dezelfde instellingen. </li><li> Autoclaaf DI water gedurende 30 min at121 ° C. Opmerking: Dit water wordt gebruikt voor het spoelen biochips na zaaien. Schatten dat 10 ml nodig zullen zijn voor elke biochip. Opmerking: Het werkelijke volume van elk biochip kanaal 2 ml, maar 5 ml steriel water wordt gespoeld door middel van elk kanaal na verwijdering van bleekwater-oplossing. </li><li> Voeg spuitinjectie buis samenstellen door snijden 27 mm gedeelten biocompatibele buizen en bevestigen mannelijke luer slip installatiemateriaal aan beide uiteinden van de buis. Plaats de slang assemblages in een papieren warmte-seal sterilisatie zakje en autoclaaf gedurende 8 minuten bij 134 &amp;# 176; C. </li></ol> 2. Fluidic Biochip Seeding Procedure Opmerking: Voer alle procedures waarin de biochips of de media wordt behandeld in een klasse II bioveiligheidskast met behulp van aseptische techniek. <ol><li> Vierentwintig uur voor de geplande zaaien, verwijder de biochips van de fabrikant verpakking in de biohood en plaats in gesteriliseerde plastic instrument gevallen. </li><li> Steriliseer het biochips met een 20% bleekmiddeloplossing als volgt Opmerking: Historisch gezien heeft deze procedure bleken schimmelgroei in de biochips voorkomen tijdens langdurige opslag in het geval dat het plasma sterilisatie van de biochips gedaan door de fabrikant was niet effectief. <ol><li> Met behulp van een steriele 20 ml spuit met een injectiespuit injectie buis constructie bevestigd en werken in de biohood injecteren 2 ml van de 20% bleekwater oplossing in elk kanaal van de biochip. Laat de biochips te zitten gedurende 1 uur met de bleekwater oplossing. </li><li> Na één uur vacuüm aspRazend het bleekmiddel oplossing van beide kanalen met een steriele mannelijke slip luer montage aan de afzuiging slang. Gebruik een van de biochip slang assemblages als een drain bij het spoelen van de biochips. </li><li> Met behulp van een steriele 20 ml spuit bevestigd aan een steriele injectiespuit inspuitsamenstel Spoel elk kanaal van de chip met 5 ml steriel water, zodat het overtollige water afvoer in een container in de biohood. Dan vacuüm aspireren uit het water als zojuist beschreven voor het bleekmiddel en plaats de biochips terug in de plastic instrument gevallen en laat in de biohood tot ingezaaid met cellen van de volgende dag. </li></ol></li><li> Zestig min vóór het zaaien biochips Injecteer 2 ml van 10 ug / ml fibronectine oplossing in elk kanaal van de biochip. Laat de biochips in de biohood gedurende 60 min, en vervolgens vacuüm aspireren van de fibronectine (zoals beschreven in stap 2.2.3) voor het zaaien de biochip met cellen. Plaats twee gedeelten van de biochip steriele buis samenstellen (zieparagraaf 1.4) op de havens van de biochips. </li><li> Trypsinize een confluente RTgill-W1 T175 kolf voor elke 16 biochips middels procedures in de American Type Culture Collection (ATCC) productbeschrijving plaat 16. <ol><li> Aspireren van de media uit de samenvloeiing fles (s) van de cellen. </li><li> Spoel de cel laag met 15 ml PBS en vervolgens te zuigen uit. </li><li> Voeg 6 ml trypsine / EDTA de cellaag in elke T175 kolf en laat cellen trypsinize gedurende ~ 5 min. </li><li> Voeg 15 ml volledige L-15 media voor celkweek aan elke kolf trypsine te stoppen. </li><li> Combineer de celsuspensies in een steriele houder. Noot: Tankgrootte varieert 150-500 ml, afhankelijk van het aantal biochips worden gezaaid. Schatten dat 5 ml celsuspensie nodig zal zijn per biochip. </li></ol></li><li> Verwijderen ~ 1 ml van de celsuspensie en plaats in een microcentrifugebuis voor het tellen. Met een helderveld microscoop met 10x DOELSTEve en een hemocytometer, behoren een 10 pl aliquot van de cellen en bereken het volume van volledige L-15 celkweekmedium nodig om een celsuspensie van 2,5 x 10 5 cellen / ml bereiken. Opmerking: Bij gebruik van de celsuspensie aan kolven zaad aan de kweek voortgezet, zou dit het punt dat te doen. Pas de celsuspensie concentratie met behulp van volledige L-15 celkweek media. </li><li> Met behulp van een steriele 20 ml syringeattached een steriele injectiespuit injectie buis constructie (zie paragraaf 1.6), injecteer 2,5 ml van de celsuspensie in de buitenste poort van elk kanaal van de biochip (dwz de poorten die de slang bevestigd hebben), waardoor een deel van de extra celsuspensie uit de buis te stromen in een afvalcontainer in de biohood. Opmerking: Dit zal ervoor zorgen dat het hele kanaal en de bijgevoegde slang vol van de celsuspensie zal zijn. <ol><li> Maak een gesloten lus voor elk biochip kanaal door het invoegen van het vrije uiteinde van de slang met de Luer fitting in de buitenste poorten voor elk kanaal. </li><li> Veeg overtollig papier uit de gesloten lussen met een papieren doek bevochtigd met 70% ethanol en zet de biochips terug in de plastic box aan een 20 ° C incubator. Geef elke biochip een uniek identificatienummer. </li></ol></li><li> Op dag 4 en 7, verwijder de biochips uit de 20 ° C incubator vervult de media in alle biochips met temperatuur geëquilibreerd volledige L-15 celkweekmedium. Volg dezelfde procedure als in stap 2.6 met uitzondering van het gebruik slechts L-15 celkweek media in plaats (geen celsuspensie). Plaats de biochips terug in de 20 ° C incubator na 4 dagen voeden. <ol><li> Na de dag 7 voeden, te verwijderen en gooi de slangen van de chips en steek de geautoclaveerd aftappluggen in de biochips. </li><li> Plaats de biochips in een doos in een 6 ° C incubator tot gebruik voor het testen. Opmerking: De chips kunnen worden bewaard bij koeltemperaturen tot 9 maanden en nog steeds levensvatbaar voor het testen in de ECIS lezers. </li></ol></li></ol> 3. ECIS Testen met biochips <ol><li> Bereid analyse chemicaliën als het gebruiken. (Zie Brennan, et al., 2012 7 voor de bereiding van de test chemische stoffen). </li><li> Verwijder ECIS reader en test leveringen uit de draagtas. Verwijderen van een biochip bereid uit de 6 ° C incubator. Plaats de biochip op een papieren handdoek. Schakel de ECIS lezer. </li><li> Met behulp van 10 ml spuiten, afzien van 10 ml van de controle water in een gemerkte 0,5 ounce doorzichtige plastic controle pot en 10 ml van het monster in een gemerkte 0,5 ounce doorzichtige plastic-test pot. Opmerking: 1) Zorg ervoor dat u bellen te verwijderen voor een nauwkeurige meting. 2) De spuiten en potten hebben een kleurcode; blauw voor de controle en rood voor de test. </li><li> Verwijder de twee gepoederde media flacons uit de folie zakken. Open een van de gepoederde media flacons (gebruik multifunctionele tool indien nodig) en giet gehele inhoud van een flesje in de pot met controle water, laten vallen van de gehele flacon inoplossing ook. Herhaal deze procedure met de test pot. Dop en schud de potten zodat het poeder wordt opgelost. </li><li> Vul elk van de gekleurde 10 ml spuiten met 9 ml van ofwel controle (blauw spuit) of toets (rode spuit) oplossingen van respectievelijke flesjes. Verwijder luchtbellen uit spuiten. </li><li> Haal de stekkers uit de biochip havens en bevestig de afvoer. </li><li> Plaats de biochip in de verwijderbare plastic bak in de ECIS lezer en sluit het deksel. </li><li> Hechten injectiespuiten aan de buitenste biochip havens en bevestig de zuiger. </li><li> Vanuit het hoofdscherm, selecteer &quot;NEXT&quot; om pre-test te starten. Opmerking: Reader software impedanties controleren. Als impedanties zich binnen het bereik van de gebruiker (meestal tussen 1000 en 3000 ohm) het scherm registreert ingesteld &quot;Cartridge Geslaagd&quot;, zoals aangegeven in figuur 3, en instrueer de gebruiker in staat om &quot;Next&quot; te selecteren en de software zal overgaan tot stap 3.10). Als de impedantie niet binnenhet ingestelde bereik als gevolg van een defecte biochip of gebrekkige aansluiting van de biochip om de lezer (meestal te wijten aan een foutieve uitlijning van de elektroden), dan zal het scherm registreren &quot;Cartridge mislukt &#39;en zal de gebruiker de optie om ofwel&quot; Afbreken &quot;of &quot;Controleer&quot; de test. <ol><li> Selecteer &quot;Afbreken&quot; om terug te gaan naar stap 3.9). Selecteer &quot;Controleer&quot; om door te gaan naar stap 3.10) na ontvangst van een &quot;Cartridge Passed &#39;boodschap en het selecteren van&quot; Next &quot;. Opmerking: Het beste is om de biochip nemen en visueel inspecteren op gebreken of lekt als een &quot;Cartridge Failed&quot; bericht wordt ontvangen alvorens met een nieuwe biochip. </li></ol></li></ol><img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig3.jpg" /> Figuur 3:. ECIS Reader Screenshot van een Biochip met Acceptabel impedantie Readings Het screenshot toont eerste impedantie metingen in ohm van elk van de 4 control elektroden (CE) en 4 proefmonster elektroden (SE) binnen de vloeibare biochip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="10"><li> Wanneer u wordt gevraagd door de lezer, voer monster informatie met behulp van een zachte toetsenbord en selecteer vervolgens &quot;Accepteren&quot; als u klaar bent. Let op: De ECIS reader software zal automatisch elke dataset met de datum, tijd en andere informatie door de gebruiker ingevoerde stempel; zoals de biochip nummer en het soort chemisch en concentratie. Twee min van impedantie gegevens worden verzameld uit de ingevoegde biochip en een timer op het scherm zal count-down tijd. </li><li> Na twee min als daarom wordt gevraagd door de instructies op het scherm die knipperen binnen een rode doos, klik op &quot;NEXT&quot;. Wanneer u wordt gevraagd door een knipperende groene vak &#39;injecteren samples nu &quot;, injecteer de controle en test media uit de bijgevoegde spuiten gelijktijdig in de biochip channels. Laat de spuiten op zijn plaats op de biochips als u klaar bent. Opmerking: impedantie waarden zullen eenmaal per minuut worden verzameld voor 60 min. Als de ECIS lezer software bepaalt dat de behandeling kanaal is statistisch significant verschillend van de controle-kanaal op elk punt tussen de 10 en 60 minuten na de start van de test, dan is de weergave op het scherm geeft aan dat het monster &quot;Verontreinigde&quot;. Als de behandeling is niet anders dan de controle-kanaal, dan is het scherm toont &quot;No Contamination gedetecteerd&quot; aan het einde van de test run. </li><li> Record testresultaten besmet of niet verontreinigd voor elk monster. </li><li> Aan het einde van de test uit te voeren, te verwijderen en gooi de biochip. Spoel en air-droog de spuiten, testen flesjes en verwijderbaar plastic bakje waarin de biochip tijdens de tests gehuisvest. Opmerking: De ECIS lezer heeft 4 GB aan opslag aan boord van de operationele software, controle modellen en de testbestanden gegenereerd op basis van een test. Hierdoor kunnen meerdere Thousand testbestanden worden opgeslagen op de lezer. Bestanden kunnen worden opgehaald met een USB sprongaandrijving en overgebracht naar een computer voor verdere analyse voor onderzoeksdoeleinden indien gewenst. </li></ol>

<ol><li>Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, A., Stenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Development and application of cell-based biosensors.</a> Ann. Biomed. Eng. 27, 697-711 (1999).</li>
<li>States, S., Scheuring, M., Kuchta, J., Newberry, J., Casson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility-based+analytical+methods+to+ensure+public+water+supply+security%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Water+Works+Assoc%22%5BJournal%5D)">Utility-based analytical methods to ensure public water supply security.</a> J. Am. Water Works Assoc. 95, 103-115 (2003).</li>
<li>Kelly, T., Baxter, W., McCauley, M., Koglin, E. Testing of Screening Technologies for Detection of Toxic Industrial Chemicals in All Hazards Receipt Facilities. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKelly%2C+T+%22EPA%2F600%2FR-08%2F034%22">EPA/600/R-08/034</a>. , Washington, DC. 1-25 (2008).</li>
<li>van der Schalie, W. H., James, R. R., Gargan, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+battery+of+rapid+toxicity+sensors+for+drinking+water+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Selection of a battery of rapid toxicity sensors for drinking water evaluation.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 18-27 (2006).</li>
<li>Iuga, A., Lerner, E., Shedd, T. R., van der Schalie, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+responses+of+a+melanophore+cell+line+to+chemical+contaminants+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Rapid responses of a melanophore cell line to chemical contaminants in water.</a> J. Appl. Toxicol. 29, 346-349 (2009).</li>
<li>Curtis, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitability+of+invertebrate+and+vertebrate+cells+in+a+portable+impedance-based+toxicity+sensor%3A+temperature+mediated+impacts+on+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Suitability of invertebrate and vertebrate cells in a portable impedance-based toxicity sensor: temperature mediated impacts on long-term survival.</a> Toxicol In Vitro. 27, 2016-2066 (2013).</li>
<li>Brennan, L. M., Widder, M. W., Lee, L. E. J., van der Schalie, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storage+and+impedence-based+water+toxicity+testing+capabilities+of+fluidic+biochips+seeded+with+RTgill-W1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Long-term storage and impedence-based water toxicity testing capabilities of fluidic biochips seeded with RTgill-W1 cells.</a> Toxicol In Vitro. 26, 736-745 (2012).</li>
<li>Widder, M. W., Brennan, L. M., Hanft, E. A., Schrock, M. E., James, R. R., van der Schalie, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+refinement+of+a+field-portable+drinking+water+toxicity+sensor+and+a+fluidic+biochip%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation and refinement of a field-portable drinking water toxicity sensor and a fluidic biochip.</a> J. Appl. Toxicol. , (2014).</li>
<li>O'Shaughnessy, T. J., Gray, S. A., Pancrazio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+neuronal+networks+as+environmental+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.Toxicol%22%5BJournal%5D)">Cultured neuronal networks as environmental biosensors.</a> J. Appl.Toxicol. 24, 379-385 (2004).</li>
<li>Eltzov, E., Marks, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+aquatic+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Whole-cell aquatic biosensors.</a> Anal. Bioanal. Chem. 400, 895-913 (2011).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li>
<li>Curtis, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portable+cell-based+impedance+sensor+for+toxicity+testing+of+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A portable cell-based impedance sensor for toxicity testing of drinking water.</a> Lab on a Chip. 9, 2176-2183 (2009).</li>
<li>Xiao, C., Luong, J. H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cytotoxicity+by+emerging+impedance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+.Appl.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cytotoxicity by emerging impedance spectroscopy.</a> Toxicol. .Appl. Pharmacol. 206 (2), 102-112 (2005).</li>
<li>Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectronic+cell+sensor+assay+for+detection+of+cytotoxicity+and+prediction+of+acute+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity.</a> Toxicol. In Vitro. 20, 995-1004 (2006).</li>
<li>Lee, L. E. J., Dayeh, V. R., Schirmer, K., Bols, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+potential+uses+of+fish+gill+cell+lines%3A+examples+with+RTgill-W1%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Develop.+Biol.-+Animal%22%5BJournal%5D)">Applications and potential uses of fish gill cell lines: examples with RTgill-W1.</a> In Vitro Cell. Develop. Biol.- Animal. 45, 127-134 (2009).</li>
<li>RT-gill-W1 (ATCC CRL-2523) Culture Method. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22American+Type+Culture+Collection+%28ATCC%29%22">American Type Culture Collection (ATCC)</a>. , Manassas, VA. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx? ATCCNum=CRL-2523&Template=cellBiology#aPropba73c">https://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx? ATCCNum=CRL-2523&Template=cellBiology#aPropba73c</a> (2015).</li>
</ol>

Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteurs en worden niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het Amerikaanse leger. Verwijzingen naar commerciële organisaties of handelsnamen in dit rapport vormen geen officiële goedkeuring of goedkeuring door het Department of the Army van de producten of diensten van deze organisaties. Auteurs Linda M. Brennan en Mark W. Widder, beiden van het US Army Center for Environmental Health Research, verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben. Michael Mayo, Michael McAleer en Alex Greis zijn werknemers van Nanohmics die de wegwerpbare biochips en instrumenten produceren die in dit Artikel worden gebruikt.10251980

De ECIS technologie goed gepresteerd in een laboratorium setting en was in staat om potentiële water verontreinigingen detecteren bij concentraties die voor de menselijke gezondheid van belang zijn. De draagbaarheid en de verpakking van de technologie maakt het bevorderlijk is voor gebruik in het veld. Kritische stappen in het protocol voor het succes van de technologie zijn als volgt: 1) Handhaaf aseptische omstandigheden tijdens de cultuur, het zaaien, en het voeden van de biochips, 2) Houd de gezaaide biochips in gekoelde omstandigheden tot klaar om te testen, omdat de RTgill-W1 cellen zal niet lang als ze worden blootgesteld aan temperaturen boven 25 ° C te overleven, 3) weeg nauwkeurig de L-15ex in het poedervormige media flesjes en nauwkeurig de watermonsters te voorkomen die valse positieven, die kunnen worden veroorzaakt door een verschuiving in de osmolaliteit van media in plaats van monster toxiciteit, 4) Volg gebruiker aanwijzingen op het scherm ECIS voor het uitvoeren van de tests. De software in de lezer de gebruiker als een bi waarschuwenochip onaanvaardbaar te testen (op basis van initiële impedantie metingen) wanneer de biochip eerst in de lezer is geplaatst. Als de impedantie niveaus onaanvaardbaar testen, zal de software niet kan de gebruiker doorgaan met testen totdat een nieuwe biochip wordt gebruikt. Redenen voor onaanvaardbare impedantie metingen worden meestal veroorzaakt door een kleine speling van de biochip elektroden met ECIS lezer pennen of vloeistoflekkage langs een van de randen lijmen van de biochip. Er zijn een aantal beperkingen aan deze technologie omdat de ECIS sensor is alleen getest met het drinken van water en niet met oppervlaktewater. De RTgill-W1 cellen die op de biochip kan niet tolereren bevriezing of temperaturen ver boven 25 ° C gedurende langere tijd (tijdsbestek kan variëren van uren tot dagen, afhankelijk van de temperatuur. De biochips functioneren het beste in een temperatuurbereik van de koelkast naar kamertemperatuur 7. Ze zijn direct klaar voor gebruik, maar direct na het zijn removed van koude opslag. Draagbare koude opslag containers worden momenteel gebruikt door personeel van het Leger in het veld voor temperatuurgevoelige benodigdheden. Dezelfde containers kunnen worden gebruikt voor geënte biochip transport. Een andere beperking van deze technologie is dat, hoewel het een breedbandig toxiciteit sensor, het niet goed reageren of helemaal naar cholinesterase remmende verbindingen, zoals sommige pesticiden. Deze mogelijkheid leemte wordt het ECIS sensor ontworpen voor gebruik in combinatie met een commercieel beschikbare snelle pesticide testbepaling bij het testen van watermonsters om de gebruiker een breder toxiciteit verschaffen. De kit is een snelle enzymatische test ontworpen om organofosfaat en carbamaat pesticiden binnen 30 min detecteren. De ECIS sensor vormt een aanvulling op het keek uit-PM (Water Quality Analysis System - Preventieve Geneeskunde) veld water testsysteem, momenteel gebruikt door militairen preventieve geneeskunde personeel op te sporen, Arsenic, lood, of cyanide in drinkwater monster. Hoewel het ECIS sensor identificeert wat de verontreiniging is, zal aangeven of bepaalde metalen of organische verbindingen aanwezig zijn, wat aangeeft dat het water niet geschikt voor menselijke consumptie zijn. De ECIS testresultaten beschikbaar zijn binnen een uur. De monsters water kan vervolgens worden verstuurd voor verdere analyse voor de identificatie van de verontreiniging als er een positief testresultaat. Zoals hierboven beschreven, wordt de lezer ECIS ontworpen als onderdeel van een systeem dat een aparte enzymatische ACE kit bevat om een ​​breed spectrum van verontreinigingsdetectie dekken. Beide lezers worden verpakt in een stevige koffer voor veld vervoer voor gebruik in het veld door soldaten.

Het algemene doel is een werkwijze voor het zaaien van cellen, opslag en het testen van vloeibare biochips in het ECIS biosensor ontwikkelen. Het doel voor de ontwikkeling van deze biosensor was even US Army specificaties voor een veld draagbaar apparaat dat mogelijke besmetting van het drinkwater voorziening kan detecteren gebruikt door soldaten. De eisen voor de toxiciteit sensor waren dat het een breed spectrum van toxische industriële verbindingen snel kunnen detecteren (binnen een uur) bij concentraties gezondheid van de mens, dat de inrichting veld draagbaar, en de biologische componenten zou een houdbaarheid hebben van ten minste negen maanden. Koeling, maar niet bevriezen, van bederfelijke componenten aanvaardbaar was. Historisch gezien gebied draagbare water testtechnologieën met een biologische component daarvan (bijvoorbeeld antilichamen, enzymen of nucleïnezuren) analyt-specifieke 1-3 geweest. Het nadeel van dit soort biosensoren is dat ze ONLy detecteren een soort chemisch tegelijk. Meerdere sensoren nodig als het vermoeden bestaat dat er meer dan één chemische stof aanwezig is. Als een bepaalde sensor niet in de test repertoire, kan chemische verontreinigingen in het water gemakkelijk onopgemerkt. Brede toxiciteit sensoren, daarentegen, hebben het potentieel om deze technologie leemte. Deze hebben gewoonlijk een cellulaire component te 4-8. De voordelen van brede toxiciteit biosensoren zijn dat zij de aanwezigheid van een breed scala aan chemische verontreinigingen, met inbegrip van mengsels en onbekenden, in een relatief korte tijd 5,9,10 kan detecteren. Het concept van het meten van de elektrische impedantie van celmonolagen als mogelijke toxiciteit sensor, die ook bekend staat als elektrische cel-substraat impedantiedetectie (ECIS), werd eerst beschreven door Giaever en Keese 11. In de afgelopen twee decennia is gebleken een gevoelige indicator van de cel zijn Viabiliteit en cytotoxiciteit. In principe is de cel monolaag die is gehecht aan de elektroden op de biochips blootgesteld aan hoge frequentie en lage spanning en stroomsterkte wisselstroomsignaal. De confluente monolaag van cellen belemmert de elektronenstroom. Wanneer de integriteit van de cel monolaag wordt aangetast (zoals wanneer een toxische chemische stof wordt geïntroduceerd), de ECIS sensor registreert een verandering in de elektrische impedantie 11-14. Figuur 1 illustreert het principe van ECIS ten opzichte van de cel monolagen worden biochip . <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig1.jpg" /> Figuur 1:.. Principe van ECIS Illustratie van een cel monolaag op een biochip met vereenvoudigde ECIS lezer elektrische schema <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 12 beschreven. Deze cellen waren niet praktisch voor gebruik in het veld, echter, omdat ze verplicht frequent media veranderingen, had een beperkte houdbaarheid, en vereist een kunstmatige CO 2-omgeving en een 37 ° C incubatietemperatuur. Er werd ontdekt dat een commercieel verkrijgbare cellijn afgeleid van regenboogforel gill epitheelcellen (RTgill W-1 cellen) kunnen worden getest bij kamertemperatuur bij omgevingstemperatuur CO 2, vormden een confluente monolaag in de biochips, kan worden bewaard bij koeltemperaturen, en had een snelle reactie (1 uur of minder) met een breed spectrum van chemische stoffen bij concentraties voor de volksgezondheid 12 relevant. Toepassingen van RTgill-W1 cellen in toxicologie en in fundamenteel onderzoek, worden beoordeeld door Lee et al. 15 Werkwijzen voor het zaaien, opslag en het testen van vloeibare biochips diemonolagen van RTgill-W1 cellen op vloeibare biochips per ECIS biosensor worden beschreven. De vloeibare biochips kan worden opgeslagen voor maximaal 9 maanden in een gekoelde staat en kan worden geleverd in een koude opslag container, voor het testen van het drinkwater supplies.The begeleidende ECIS lezers, of testunits, worden apart verzonden. De biochips hebben twee componenten om hen; een bovenste laag van polycarbonaat met twee aparte vloeistof kanalen, en een lagere elektronische laag die vier elektroden per kanaal voor impedantie sensing bevat. Er zijn 10 werkende elektroden per pad; elke elektrode 250 urn in diameter. De geassembleerde biochips hebben goud elektrode aansluitingen voor het verwerven van impedantie metingen wanneer ingebracht in de ECIS testeenheid. Beide ingesloten vloeibare U-vormige kanalen 2 ml van de RTgill-W1 celsuspensie bevatten. Figuur 2 toont een vloeibare biochip in het ECIS lezer met een vergroting van een confluente cellen op een meetelektrode. Figuur 2:.. Fluidic Biochip in ECIS Reader vergrote gebied toont een confluente monolaag van RTgill-W1 cellen op een enkele detectie-elektrode <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com</td><td>16000-085</td><td>Opslaan bij -20 °C. Ontdooi bij kamertemperatuur voor gebruik. Ingrediënt voor compleet L-15 celkweekmedium (10%).</td></tr><tr><td>Fibronectine, bovijn plasma</td><td>EMD Millipore Corp.   www.emdmillipore.com          </td><td>341631-1 mg</td><td>Opslaan bij -20 °C. Ontdooi bij kamertemperatuur voor gebruik. Meng met L-15 medium voor een concentratie van 10 μg/ml en bevries bij -20 °C in aliquots. Gebruik als substraat voor biochips.</td></tr><tr><td>L-15 medium zonder L-glutamine</td><td>Lonza  www.lonzabioscience.com</td><td>12-700F</td><td>Basaal medium voor celkweek en het voeden van biochips. Bewaren bij 6 °C.</td></tr><tr><td>L-15ex poeder medium met fenolrood</td><td>US Biological           www.usbio.net</td><td>L1501</td><td>Medium wordt afgewogen in 60 mg aliquots in 0,1 dram flacons en bewaard bij 6 °C in foliezakken met drogpotten. Negen maanden houdbaarheid. Gemengd met 10 ml watermonster voor testen in biochips.</td></tr><tr><td>PBS, zonder Ca2+ of Mg2+</td><td>Lonza  www.lonzabioscience.com</td><td>17-516F</td><td>Bewaren bij kamertemperatuur. Gebruikt voor het spoelen van medium bij het trypsiniseren van celkweekkolven.  </td></tr><tr><td>Trypsine, EDTA</td><td>Lonza  www.lonzabioscience.com</td><td>CC-5012</td><td>Opslaan bij -20 °C. Ontdooi bij kamertemperatuur en gebruik voor het trypsiniseren van celkweekkolven. </td></tr><tr><td>T175 kweekkolven</td><td>Fisher Scientific www.fishersci.com</td><td>12-565-30</td><td>Gebruikt voor het kweken van RTgill-W1 cellen.</td></tr><tr><td>Bleekwater</td><td>Chlorox                                                www.chlorox.com</td><td></td><td>Verdund tot 20% met millique of gedistilleerd water voor het schoonmaken van ECIS chips. Elke huishoudelijke bleekvloeistof is acceptabel.</td></tr><tr><td>70% ethyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Voor het desinfecteren van biohood oppervlakken en alle materialen die in de biohood worden geplaatst.</td></tr><tr><td>Forelkieuwcellen (RTgill-W1) </td><td>American Type Tissue Culture Collection                www.atcc.org</td><td>CRL-2523</td><td>Cellen gekweekt en gebruikt voor biosensor (het zaaien van biochips).</td></tr><tr><td>GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM</td><td>Lonza  www.lonzabioscience.com</td><td>35050-061</td><td>Opslaan bij kamertemperatuur.  Ingrediënt voor compleet L-15 celkweekmedium (1%).</td></tr><tr><td>Penn/Strep Stock 10K/10K</td><td>Lonza  www.lonzabioscience.com</td><td>17-602E</td><td>Opslaan bij -20 °C. Ontdooi bij kamertemperatuur voor gebruik. Ingrediënt voor compleet L-15 celkweekmedium (1%).</td></tr><tr><td>Pharmed BPT slangen</td><td>U.S. Plastic Corp.         www.usplastic.com</td><td>57317</td><td>In 27 mm secties gesneden en geautoclaveerd. Gebruikt voor het zaaien van biochips met cellen en als een gesloten lus tussen mediaverversingen.</td></tr><tr><td>Polycarbonaat luer fittingen voor Pharmed slangenassemblages</td><td>Value Plastics           </td><td>MTLS210-9</td><td>Bevestigd aan elk uiteinde van de gesneden Pharmed slang voor inbrenging in bichips.</td></tr><tr><td>20 ml spuiten, met slip-tip</td><td>VWR Scientific       us.vwr.com</td><td>BD302831</td><td>Gebruikt voor het injecteren van celsuspensie voor het zaaien van ECIS chips, evenals voor het voeden van chips.</td></tr><tr><td>0,1 dram snap-cap polypropyleen microvialen</td><td>Bottles Jars and Tubes, Inc.   www.bottlesjarsandtubes.com</td><td>30600</td><td>Gebruikt om 60 mg aliquots van L-15ex poeder medium op te slaan.</td></tr><tr><td>60 mil Lexan vloeibare ECIS biochips</td><td>Nanohmics, Inc.     www.nanohmics.com</td><td></td><td>Op maat gemaakt door Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cellen worden in de biochips geïnjecteerd en gezaaide chips worden in de ECIS-lezer geplaatst voor testen.</td></tr><tr><td>Autoclaveerbare kunststof instrumentenbox 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8"</td><td>Medi-Dose EPS     medidose.com</td><td>IB701</td><td>Gebruikt voor het opslaan van het volgende; geautoclaveerde pluggen, gereinigde biochips, gezaaide biochips. </td></tr><tr><td>Papieren hitte-seal sterilisatiezakjes, 7 &frac12;&rdquo; x 13&rdquo;</td><td>CardinalHealth          www.cardinalhealth.com</td><td>90713</td><td>Gebruikt voor het autoclaveren van slangen en fittingen en pluggen.</td></tr><tr><td>Quantos geautomatiseerde poederdispenser</td><td>Mettler Toledo       www.mt.com</td><td>QB5</td><td>Automatische distributie van 60 mg aliquots van poedervormig L-15ex in 0,1 dram vials.</td></tr><tr><td>ECIS lezer</td><td>Nanohmics, Inc.     www.nanohmics.com</td><td></td><td>Op maat gemaakt door Nanohmics, Inc. De gezaaide biochip wordt in de lezer geplaatst voor het uitvoeren van watertoxiciteitstesten.</td></tr><tr><td>3 x 5 gemetalliseerde 2,5 mil polypropyleen hersluitbare zakjes</td><td>Uline                       www.uline.com</td><td>S-16893</td><td>Verpakking

opstellen en testen van impedantie-gebaseerde fluidic biochips met rtgill-w1 cellen voor snelle evaluatie van drinkwater monsters voor de toxiciteit

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Dit manuscript beschrijft hoe men vloeibare biochips met epitheelcellen van de kieuwen van regenboogforel (RTgill-W1) kan bereiden voor gebruik in een draagbaar watertoxiciteitssensor in het veld. Een monolaag van RTgill-W1 cellen vormt zich op de sensorelektroden die in de biochips zijn ingesloten. De biochips worden vervolgens gebruikt voor testen in een draagbaar elektrisch apparaat voor cel-substraat impedantiemetingen (ECIS) dat is ontworpen voor snelle toxiciteitstesten van drinkwater. Het manuscript beschrijft verder hoe een toxiciteitstest kan worden uitgevoerd met behulp van de bereide biochips. Een controlewatermonster en het te testen watermonster worden gemengd met vooraf gemeten poedermedia en in aparte kanalen van de biochip geïnjecteerd. De impedantiemetingen van de sensorelektroden in elk van de biochipkanalen worden gemeten en vergeleken door een geautomatiseerd statistisch softwareprogramma. Het scherm op het ECIS-instrument geeft binnen een uur na het injecteren van de monsters aan of "Besmetting gedetecteerd" of "Geen besmetting gedetecteerd". Voordelen zijn de gebruiksgemak en de snelle reactie op een breed spectrum van anorganische en organische chemicaliën bij concentraties die relevant zijn voor gezondheidsproblemen bij mensen, evenals de langetermijnstabiliteit van opgeslagen biochips in een klaar te testen staat. Beperkingen zijn de vereiste voor koude opslag van de biochips en de beperkte gevoeligheid voor cholinesteraseremmers als pesticiden. Toepassingen voor deze toxiciteitsdetector zijn voor snel velddraagbaar testen van drinkwatervoorraden door personeel van het Leger voor Preventieve Geneeskunde of voor gebruik in gemeentelijke waterzuiveringsinstallaties.

De ECIS technologie beschreven in dit document onderging testen op de US Environmental Protection Agency (USEPA) gesponsorde Technology Testing and Evaluation Program (TTEP). Dertien chemicaliën werden geselecteerd voor het testen als vertegenwoordigers van een breed spectrum van industriële toxische verbindingen die kunnen worden genomen verontreinigingen van drinkwater. Tijdens het testen, 9 van de 13 werden gedetecteerd door ECIS binnen een uur bij concentraties die voor de gezondheid relevant zijn 8. Tabel 1 toont de resultaten van deze verontreiniging testen. Figuur 4 representeert wat een &quot;Verontreinigde&quot; resultaat zou zien op de lezer scherm ECIS. Voor het grootste deel, cellulaire impedanties afgenomen voor verontreinigde monsters in vergelijking met controles. Soms kunnen bepaalde verbindingen een verhoging van de impedantie veroorzaken. Ook samengevat in Tabel 1 </sTrong&gt; is het schone water testen. Veertig schoon watermonsters werden uitgevoerd en er geen besmetting werd ontdekt in een van de monsters (zie figuur 5) voor een representatief screenshot van &quot;No Contamination gedetecteerd&quot;. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig4.jpg" /> Figuur 4: ECIS Reader Screenshot van een &#39;Besmette&#39; Water Sample Een voorbeeld van een genormaliseerde impedantie graphics en resultaten van een watermonster die besmet was.. Blauwe lijnen geven genormaliseerde impedantie van elk van de stuurelektrodes; rode lijnen geven de genormaliseerde impedantie van elk van de test sample elektroden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig5.jpg" /> Figuur 5: ECIS Reader Screenshot van een &quot;No Contamination gedetecteerd&quot; Water Sample Een voorbeeld van een genormaliseerde impedantie graphics en resultaten van een watermonster die niet besmet was.. Blauwe lijnen geven genormaliseerde impedantie van elk van de stuurelektrodes; rode lijnen geven de genormaliseerde impedantie van elk van de test sample elektroden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Categorie </td><td> verontreinigende </td><td colspan="3"> Geteste concentratie (mg / l) 1 </td><td colspan="2"> Gedetecteerd ≤1 uur n = 4/4 chips </td></tr><tr><td rowspan="8"> bestrijdingsmiddelen </td><td> aldicarb </td><td colspan="3"> 0.17 </td><td colspan="2"> Nee </td></tr><tr><td> Arsen<html> ic (natrium arseniet) </td><td colspan="3"> 4.5 </td><td colspan="2"> Ja </td></tr><tr><td> Azide (natriumazide) </td><td colspan="3"> 46.7 </td><td colspan="2"> Ja </td></tr><tr><td> fenamifos </td><td colspan="3"> 0.56 </td><td colspan="2"> Nee </td></tr><tr><td> methamidofos </td><td colspan="3"> 1.4 </td><td colspan="2"> Nee </td></tr><tr><td> methyl parathion </td><td colspan="3"> 33.6 </td><td colspan="2"> Ja </td></tr><tr><td> Paraquat (dichloride) </td><td colspan="3"> 4.6 </td><td colspan="2"> Nee </td></tr><tr><td> Pentachlorophenate (natrium) </td><td colspan="3"> 71.9 </td><td colspan="2"> Ja </td></tr><tr><td rowspan="5"> Industrial Chemicals </td><td> ammonia </td><td colspan="3"> 924 </td><td colspan="2"> Ja </td></tr><tr><td> Koper (koper II sulfaat) </td><td colspan="3"> 103 </td><td colspan="2"> Ja </td></tr><tr><td> Cyanide (natrium) </td>3 &quot;&gt; 14 </td><td colspan="2"> Ja </td></tr><tr><td> Kwik (chloride) </td><td colspan="3"> 24.7 </td><td colspan="2"> Ja </td></tr><tr><td> Tolueen </td><td colspan="3"> 444 </td><td colspan="2"> Ja </td></tr><tr><td> Schoon Water 2 </td><td> geen </td><td colspan="3"> NA </td><td colspan="2"> Nee </td></tr><tr><td colspan="7"> 1 geteste concentraties zijn dezelfde als in het manuscript van Widder, et al. (2014). </td></tr><tr><td colspan="7"> 2 40 schoon water monsters werden uitgevoerd met geen verontreiniging. </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Verontreinigingen in watermonsters gedetecteerd door ECIS.

Dit manuscript beschrijft hoe je vloeistofbionchips bereidt met epitheelcellen van de kieuwen van regenbooforen voor gebruik in een draagbare elektrische cel-substraat impedantiesensor in het veld. Het protocol voor het uitvoeren van een snelle drinkwatertoxiciteitstest met de sensor wordt ook beschreven.

Opstellen en testen van impedantie-gebaseerde Fluidic biochips met RTgill-W1 Cellen voor snelle evaluatie van Drinkwater Monsters voor de toxiciteit

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe een biosensor kan worden gebruikt om de toxiciteit van drinkwatermonsters te evalueren. Dit wordt bereikt door biochips te maken die een monolaag van kieuwcellen van de regenboogforel bevatten, om deze vervolgens te gebruiken als onderdeel van een impedantie-gebaseerde biosensor. Deze procedure biedt een methode om snel chemische toxiciteit in drinkwatervoorraden te detecteren op niveaus die relevant zijn voor de menselijke gezondheid.De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de biochips onder veldomstandigheden kunnen worden gebruikt, dat ze tot negen maanden koud kunnen worden bewaard zonder dat er zorg of onderhoud van de cellen nodig is, en dat ze in een staat van paraatheid voor testen verkeren en op elk moment na verwijdering uit de koeling kunnen worden gebruikt. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Jordan McNairn, een bachelorstudent uit ons laboratorium. Verwijder de dag vóór het zaaien van de cellen de biochips uit hun verpakking en plaats ze in gesteriliseerde plastic instrumentenkoffers.Bevestig een van de slangassemblages aan de spuit en trek een 20% bleekoplossing op in een spuit van 20 milliliter. Injecteer twee milliliters van de oplossing in elk kanaal van de biochip. Laat de biochips na afloop een uur weken in de bleekoplossing.Gebruik na één uur een steriele spuit van één milliliter, uitgerust met een male slip luer-koppeling en verbonden met een vacuümlijn, om de bleekoplossing uit beide kanalen te aspireren. Nadat de bleek uit de biochip is geaspireerd, wordt een steriele slangenset met male slip luers aan beide uiteinden op de biochip bevestigd om als afvoer te dienen tijdens het spoelen van de biochips. Trek vervolgens steriel water op in een spuit van 20 milliliter en spoel elk kanaal van de chip met vijf milliliter water.Zuig het water zoals voorheen af met een vacuümpomp. Plaats de biochips vervolgens terug in de plastic instrumentenkistjes. Laat de biochips tot de volgende dag in de biologische veiligheidskast staan.Inject een uur vóór het zaaien van de biochips twee milliliter van een fibronectine-oplossing van 10 micrograms per milliliter in elk kanaal van de biochip. Incubeer de biochips gedurende 60 minuten in de biologische veiligheidskast en aspireer vervolgens de fibronectine-oplossing met een vacuümpomp. Plaats tot slot twee steriele biochip-slangenassemblages op de poorten van de biochips en zet de biochips opzij totdat de cellen klaar zijn om gezaaid te worden.Haal één confluente T-175-fles met kieuweg epitheelcellen van de regenboogforel uit de incubator en plaats deze in de biologische veiligheidskast. Eén confluente T-175-fles is voldoende om ongeveer 16 biochips te zaaien. Aspireer het medium van de cellen af.Spoel ze af met PBS en aspireer het PBS weg. Voeg vervolgens zes milliliter Trypsin-EDTA-oplossing toe aan de cellaag. Incubeer de kolf gedurende ongeveer vijf minuten bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 15 milliliter compleet L-15 celkweekmedium toe aan elke kolf om de trypsine te deactiveren. Neem een klein aliquot van de celsuspensie en gebruik een hemocytometer om de concentratie van de cellen te meten. Bekijk de cellen met een lichtveldmicroscoop uitgerust met een 10x objectief.Bereken vervolgens de huidige celconcentratie en pas de celsuspensie aan tot een concentratie van een kwart miljoen cellen per milliliter. Gebruik daarna een steriele spuit van 20 milliliter om 2,5 milliliter van de celsuspensie in de buitenpoort van elk kanaal van de biochip te injecteren. Laat de overtollige celsuspensie via de slang in een afvalbak lopen.Maak vervolgens voor elk biochipkanaal een gesloten lus door het vrije uiteinde van de slang met de luer-koppeling in de buitenpoort van elk kanaal te steken. Maak daarna een papieren handdoek vochtig met 70% ethanol en veeg hiermee alle overtollige media van de gesloten lussen af. Plaats de biochips vervolgens terug in een plastic doos.Verwijder op dag vier en zeven de biochips uit de incubator. Vervang het medium in de biochips door op temperatuur gebalanceerd compleet L-15 celkweekmedium. Verwijder na het voeden op dag zeven de slangen uit de chips en gooi deze weg, en breng de autoclaaf-afvoerpluggen aan in de biochips.Plaats de biochips in een doos in een incubator van 6 °C totdat ze worden gebruikt voor het testen. Haal de ECIS-testlezer en de benodigdheden uit de transportkoffer en zet vervolgens de lezer aan. Haal daarna een van de voorbereide biochips uit de incubator van 6 °C en plaats deze op een papieren handdoek.Gebruik een spuit van 10 milliliter om 10 milliliter controlewater over te brengen in een gelabelde doorzichtige plastic controlepot van 0,5 ounce. Zorg ervoor dat luchtbellen worden verwijderd voor een nauwkeurige meting. Gebruik vervolgens een aparte spuit om 10 milliliter van het testmonster over te brengen in een doorzichtige plastic testpot van 0,5 ounce.Verwijder vervolgens twee vials met poedermedium. Open een van de vials met poedermedium en giet de volledige inhoud van één vial in de pot met het controlewater, waarbij u ook de volledige vial in de oplossing laat vallen. Herhaal deze procedure met de testpot.Sluit daarna de potten af en schud deze om ervoor te zorgen dat het poeder volledig is opgelost. Vul de blauwe spuit van 10 milliliter met negen milliliter van de controle-oplossing en de rode spuit van 10 milliliter met negen milliliter van de test-oplossing uit hun respectievelijke vials.Verwijder eventuele aanwezige luchtbellen uit de spuiten. Verwijder vervolgens de dopjes van de poorten van de biochip en bevestig de afvoer. Plaats de biochip in de uitneembare plastic houder van de ECIS-reader, sluit het deksel en bevestig daarna de gevulde spuiten aan de buitenste poorten van de biochip.Bevestig tot slot de spuitzuigers. Selecteer op het hoofdscherm van de reader Volgende om de pre-test te starten. De software controleert vervolgens de initiële impedanties.Als de impedanties binnen het bereik liggen, geeft het scherm "Cartridge passed" aan en wordt de gebruiker geïnstrueerd om op Volgende te selecteren. Voer vervolgens de monsterinformatie in met behulp van een virtueel toetsenbord en selecteer Accept wanneer u klaar bent. Op dit punt worden twee minuten aan impedantiedata verzameld van de ingevoegde biochip, waarbij een timer op het scherm de resterende tijd aftelt.Klik na twee minuten op Volgende. Wanneer u door een knipperend groen kader wordt gevraagd om "Inject samples now", injecteert u de controle- en testmedia uit de aangebrachte spuiten gelijktijdig in de kanalen van de biochip. Laat de spuiten na voltooiing op de biochips geplaatst.Indien de ECIS-lezerssoftware vaststelt dat het behandelingskanaal op enig moment tijdens de test statistisch verschilt van het controlekanaal, geeft het scherm aan dat het monster gecontamineerd is. Anders wordt aan het einde van de monitoringsperiode aangegeven dat er geen contaminatie is gedetecteerd. Noteer de testresultaten als "Gecontamineerd" of "Niet gecontamineerd" voor elk monster.Verwijder en gooi de biochip aan het einde van de testrun weg. Spoel de spuiten, de testbuisjes en de removable plastic tray waarin de biochip tijdens de tests was geplaatst, af en laat deze aan de lucht drogen. De hier getoonde 13 chemicaliën werden geselecteerd voor testen als vertegenwoordigers van een breed spectrum aan toxische industriële verbindingen die mogelijke verontreinigingen van drinkwater kunnen zijn.Tijdens de tests werden negen van de 13 binnen een uur gedetecteerd door middel van electric cell substrate impedance sensing, bij concentraties die relevant zijn voor de menselijke gezondheid. Typische resultaten die zichtbaar zouden zijn na een electric cell substrate impedance sensing-test worden hier getoond. Gecontamineerde monsters vertonen aanzienlijk lagere impedantieniveaus in vergelijking met de controlemonsters van schoon water.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een biochip met een monolaag van kieuweg epitheelcellen van de regenboogforel bereidt en hoe u die biochip vervolgens gebruikt in een impedantiegebaseerde toxiciteitstest voor de evaluatie van de toxiciteit van drinkwater. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken aseptisch te werken bij het bereiden van de biochips, en om de biochips gekoeld te bewaren tot ze worden gebruikt. Elke biochip kan slechts één keer worden gebruikt en moet daarna worden weggegooid.Zodra de methode onder de knie is, kan de voorbereiding van de biochip in ongeveer 10 minuten worden voltooid. Dit is een schatting, aangezien chips in batches worden voorbereid. Impedantietesten van monsters, inclusief de monsterbereiding, duurt ongeveer één uur en 10 minuten mits dit correct wordt uitgevoerd.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals analytische chemie, worden uitgevoerd op een monster dat een besmet resultaat gaf, om de vermoedelijke chemische stof of stoffen te identificeren. De ontwikkeling van deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het detecteren van watertoxiciteit om technologie te gebruiken die gebruikmaakt van kieuwegapitheelcellen van de regenboogforel en impedantiedetectie. We hopen dat u de technieken nuttig vindt en kijken uit naar toekomstige innovaties die door deze nieuwe mogelijkheden gefaciliteerd kunnen worden.Bedankt en een fijne dag gewenst.

preparation-testing-impedance-based-fluidic-biochips-with-rtgill-w1

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

In this video, we demonstrate the process of real-time monitoring of cellular events, including the proliferation of adherent cells, via a cellular impedance assay. Here, the adherent cells act as insulators, restricting the current flow between the electrodes and increasing the impedance.

Cellular Impedance-Based Analysis for Monitoring of Cellular Processes in Real-Time

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Een protocol om te screenen op endocriene activiteit in organische extracten van watermonsters, inclusief behandelde afvalwaterafvoer en oppervlakte (ontvangende) water, werd aangepast met behulp van commercieel verkrijgbare divisie-geremde ("freeze and thaw") in vitro transactivatie bioassays.

Screening op hormonale activiteit in water met behulp van de handel verkrijgbare<em&gt; In Vitro</em&gt; Transactivering Bioassays

Een microfluidic biosensor platform is ontworpen en vervaardigd met behulp van goedkope droge film fotoresist technologie voor snelle en gevoelige kwantificering van verschillende analyten. Deze eenmalig gebruik-systeem zorgt voor de elektrochemische uitlezing van enzyme-linked tests aan-chip-geïmmobiliseerd door middel van de techniek van de stop-flow.

Droge Film elektrochemische Microfluidic Biosensor fotoresist gebaseerde Platform: Apparaat Fabrication, On-chip Assay voorbereiding en werking van het systeem

Dit protocol beschrijft een algemene strategie om te regenereren commerciële gekleed gouden microelectrodes uitgerust voor een label-vrije cel analyzer besparing op de hoge lopende kosten ofmicrochip gebaseerde tests gericht. Het regeneratieproces omvat de spijsvertering van de trypsine, spoelen met ethanol en water, en een stap van spinnen, waardoor herhaalde gebruik van microchips.

Regeneratie van gekleed gouden Microelectrodes uitgerust voor een Real-Time cel Analyzer

Deze publicatie beschrijft de fabricage van een apparaat van de orgel-on-chip met geïntegreerde elektroden voor directe kwantificering van signaalcomplexen elektrische weerstand (TEER). Voor een validatie, de bloed - hersen barrière werd geïmiteerd binnen dit microfluidic apparaat en zijn functie als barrière werd gecontroleerd. De gepresenteerde methoden voor de integratie van de elektrode en directe kwantificering van de TEER zijn algemeen toepasbaar.

Fabricage en validatie van een orgel-on-chip systeem met geïntegreerde elektroden te kwantificeren direct signaalcomplexen elektrische weerstand

Elektrowetting-gebaseerde digitale microfluidic is een techniek die gebruik maakt van een spanning-gedreven verandering in de schijnbare contacthoek van een microliter-volume druppel om de manipulatie te vergemakkelijken. Door dit te combineren met gefunctionaliseerde magnetische kralen, kunnen meerdere laboratoriumeenheden worden ingebracht voor monstervoorbereiding en identificatie van ziekteverwekkers met behulp van immunosorbent Assay (ELISA) met enzymgebonden immunosorbent assay.

Elektrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

We presenteren een microfluïdisch systeem voor studies met hoge doorvoer op complexe levensmachines, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. De microfluïdische chip maakt de analyse van de zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk.

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

We beschrijven een aanpak om invasieve celsubpopulaties in realtime te detecteren en vast te leggen. Het experimentele ontwerp maakt gebruik van Real-Time Cellular Analysis door veranderingen in de elektrische impedantie van cellen te monitoren. Invasieve kanker, immuun-, endotheel- of stromale cellen in complexe weefsels kunnen worden vastgelegd en de impact van coculturen kan worden beoordeeld.

Real-time detectie en vastlegging van invasieve celsubpopulaties uit coculturen

De volgende studie evalueert het toxicologische profiel van een geselecteerd metaal-organisch raamwerk met behulp van elektrische celsubstraatimpedantiedetectie (ECIS), een real-time, high-throughput screeningstechniek.

Elektrische cel-substraatdetectie voor real-time evaluatie van toxicologische profielen van metaal-organische kaders

Ons gedetailleerde protocol schetst de creatie en het gebruik van het geavanceerde darm-op-chip-model, dat menselijk darmslijmvlies simuleert met 3D-structuren en verschillende celtypen, waardoor een diepgaande analyse van immuunresponsen en cellulaire functies als reactie op microbiële kolonisatie mogelijk is.

Immunocompetent darm-op-chip-model voor het analyseren van immuunresponsen van het darmslijmvlies

Leer de voorbereiding van impedantie-gebaseerde fluidic biochips met regenboogforel kieuweefselcellen voor snelle toxiciteitstests van drinkwater. Deze methode maakt veldtesten mogelijk en verbetert waterkwaliteitsmonitoring.

Opstellen en testen van impedantie-gebaseerde Fluidic biochips met RTgill-W1 Cellen voor snelle evaluatie van Drinkwater Monsters voor de toxiciteit (Video) | JoVE Journal

Opstellen en testen van impedantie-gebaseerde Fluidic biochips met RTgill-W1 Cellen voor snelle evaluatie van Drinkwater Monsters voor de toxiciteit

Meer video's verkennen