Evaluatie van Planar-Cell-Polariteit Phenotypes in ciliopathie Mouse Mutant Cochlea

Het algemene doel van dit protocol is om de cochlea van ciliaire mutante muizen te onderzoeken op fenotipen van planaire celpolariteit. Deze technieken maken een uitgebreide beschrijving van het cochleaire fenotype mogelijk, wat zal leiden tot een beter begrip van de betrokkenheid van cilia bij het tot stand brengen van PCP-signalering bij gewervelde dieren. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat, eenmaal beheerst, het gedissekteerde cochleaire epitheel kan worden gebruikt voor verschillende soorten fenotypische analyse.

Na het voorbereiden van reagentia en weefsel van experimentele dieren, in ontwikkelingsstadium E16.5 tot p3, gebruik een scalpelmes of een klein stel schaar om het hoofd langs de sagittale middenlijn te dissecteren, beginnend bij de neus en zich uitstrekkend tot de cotyle. Verwijder de hersenen uit elk helft van de schedel met een pincet. Identificeer vervolgens de temporale botten die de zich ontwikkelende beenachtige labyrint van het binnenoor bevatten.

Tijdens het werken met het monster onder een dissectiemicroscoop, gebruik een pincet om de beenachtige labyrinten van de schedel te scheiden door de pincetjes voorzichtig onder de beenachtige labyrinten te laten lopen. Na de dissectie, gebruik de punt van de dissectiefijgen om de ovale en ronde vensters vrij te maken en maak een klein gaatje in de top van de cochleaire spiraal. Bevestig vervolgens de beenachtige labyrinten gedurende vijf minuten op ijs in 1,5 milliliter 4% paraformaldehyde om een eenvoudige verwijdering van het tectoriale membraan mogelijk te maken.

Plaats nu de beenachtige labyrinten in een zwart met siliconenelastomeer gecoat dissectiebakje met PBS om de dissectie te vergemakkelijken. Gebruik nummer vijf pincet om het buitenste kraakbeen te verwijderen, waardoor het cochleaire kanaal zichtbaar wordt. Begin bij het ovale venster, steek de onderkant van het pincet in het ovale venster en prik het kraakbeen voorzichtig open, waarbij je langzaam naar boven beweegt richting de top.

Gebruik vervolgens een fijn pincet om de Reissner's membraan aan de basis van het cochleaire kanaal te knijpen en trek het omhoog. Visualiseer de dorsale kant van het cochleaire kanaal, inclusief het sensorische epitheel. Gebruik vervolgens nummer 55 pincet om het tectoriale membraan aan de basis van de cochlea te knijpen en trek het omhoog richting de top.

De volledige verwijdering van het tectoriale membraan is vereist om de beste beelden te verkrijgen met immunohistochemie, en is essentieel voor rasterelektronenmicroscopie. Na het blootleggen van het orgaan van Corti, fixeer het weefsel verder en voer immunohistochemie uit, of bereid voor op rasterelektronenmicroscopie, zoals beschreven in het geschreven deel van het protocol. Nadat het weefsel is gekleurd, plaats het monster in een zwarte siliconenelastomeerbak, bevattend PBS.

Verwijder met fijn pincet de vestibulaire regio van de cochleaire spiraal. Verwijder vervolgens zeer voorzichtig het onderliggende kraakbeen en mesenchym van de cochleaire spiraal. De resterende cochleaire spiraal bevat de binnenste sulcus, het orgaan van Corti en de buitenste sulcus.

Breng de cochleaire spiraal over in een druppel PBS geplaatst op een microscoopglaasje. Wikkel de PBS weg met een absorberend papier of stuk filterpapier en plaats de cochleaire spiraal voorzichtig opnieuw als de epitheel is verschoven en overlapt zichzelf. Voeg een druppel montagemiddel rechtstreeks toe op het cochleaire monster en plaats voorzichtig een dekglas rechtstreeks op het monster, zorgvuldig om luchtbellen te vermijden.

Gebruik een epifluorescente of laser-scanning confocale microscoop uitgerust met hoge vergroting en objectieven met hoge numerieke apertuur, om beelden van het apicale oppervlak van de cochleaire haarcellen vast te leggen. Gebruik lagere objectieven om overlappende beelden van de cochleaire spiraal te nemen om de lengte van het cochleaire kanaal te kwantificeren. De volgende afbeeldingen tonen immunofluorescente kleuring van de basale bocht, post-natale dag één type cochlea.

Phalloïdine labelt filamenteus actine in stereocilia en corticale actine aan de celrand. Myosine VIIA is een marker voor binnenste en buitenste haarcellen. ZO_1 labelt de strakke verbindingen tussen cellen, waardoor het een geweldige marker is om celgrenzen te onderscheiden.

Acetyleerd alfa-tubuline wordt gebruikt als marker voor het kinocillium op de top van het bundeltje, zoals aangegeven door de witte pijl. Interne microtubuli worden ook gelabeld door acetyleerd alfa-tubuline, die bijzonder overvloedig zijn in pilaarcompleksen, zoals aangegeven door de witte asterisken. Deze afbeelding van gedissekteerde cochleaire kanalen op E18.5, gekleurd met geacetyleerd tubuline, toont een opmerkelijke verkorting van IFT20 voorwaardelijk knockout cochleaire kanalen vergeleken met controle.

De volgende afbeelding is een whole-mount-voorbereiding van basale cochleaire bocht, bij een BBS8 knockout muis, op post natale dag nul. Stereociliaire bundeltjes in BBS8 knockout cochlea zijn variabel geroteerd, zoals aangegeven door de rechter pijl, of afgeplat en verkeerd gelokaliseerd, zoals aangegeven door de middelste pijl. De kinocilia zijn verkeerd gelokaliseerd of axonemen ontbreken, zoals aangegeven door de linker pijl.

Bij het voorbereiden van cochleair fenotype voor analyse, is het belangrijk om te onthouden dat verschillen in genetische achtergrond het cochleair fenotype kunnen wijzigen. Daarom is het belangrijk om nestgenoot controles te gebruiken voor analyse. Verdere analyses omvatten audiometrische testen en het kweken van cochleaire explantaten, wat behandeling met verschillende signaalactiveerders of remmers mogelijk maakt, en zodoende bijdraagt aan mechanistisch begrip van ontwikkelingsprocessen die betrokken zijn.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe cochleair weefsel te bereiden voor het analyseren van de rol van ciliaire componenten en hun specifieke effecten op PCP-signalering.