Name: Evaluatie van Planar-Cell-Polariteit Phenotypes in ciliopathie Mouse Mutant Cochlea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Leer hoe je planar-cell-polariteit fenotypen analyseert in ciliopathie muizen met immunohistochemie en scanning elektronenmicroscopie. Deze methode versterkt inzicht in ciliaire functies bij cochleaire ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteur wil graag bedanken Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer en Zoe Mann en hun kritische evaluatie van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door de Sofja Kovalevskaya Award (Humbodlt Foundation) en de Johannes-Gutenberg Universiteit, Mainz, Duitsland.

<ol><li>Waters, A. M., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliopathies%3A+an+expanding+disease+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Ciliopathies: an expanding disease spectrum.</a> Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).</li>
<li>May-Simera, H. L., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia%2C+Wnt+signaling%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton.</a> Cilia. 1, 7(2012).</li>
<li>Ross, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+ciliary+proteins+perturbs+planar+cell+polarity+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates.</a> Nat Genet. 37, 1135-1140 (2005).</li>
<li>Ezan, J., Montcouquiol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+planar+cell+polarity+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting planar cell polarity in the inner ear.</a> Seminars in cell & developmental biology. 24, 499-506 (2013).</li>
<li>Semenov, M. V., Habas, R., Macdonald, B. T., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Noncanonical+Wnt+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Noncanonical Wnt Signaling Pathways.</a> Cell. 131, 1378(2007).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+polarized+extension+and+planar+cell+polarity+in+the+cochlea+by+the+vertebrate+PCP+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway.</a> Nat Genet. 37, 980-985 (2005).</li>
<li>Montcouquiol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Vangl2+and+Scrb1+as+planar+polarity+genes+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals.</a> Nature. 423, 173-177 (2003).</li>
<li>May-Simera, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+proteins+Bbs8+and+Ift20+promote+planar+cell+polarity+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ciliary proteins Bbs8 and Ift20 promote planar cell polarity in the cochlea.</a> Development. 142, 555-566 (2015).</li>
<li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+proteins+link+basal+body+polarization+to+planar+cell+polarity+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation.</a> Nat Genet. 40, 69-77 (2008).</li>
<li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+of+the+organ+of+Corti%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hearing research. 22, 117-146 (1986).</li>
<li>Nayak, G. D., Ratnayaka, H. S., Goodyear, R. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+hair+bundle+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Development of the hair bundle and mechanotransduction.</a> The International journal of developmental biology. 51, 597-608 (2007).</li>
<li>Denman-Johnson, K., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+hair+bundle+polarity+and+orientation+in+the+deveoping+vestibular+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Establishment of hair bundle polarity and orientation in the deveoping vestibular system of the mouse.</a> J. Neurocytol. , 821-835 (1999).</li>
<li>Sobkowicz, H. M., Slapnick, S. M., August, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinocilium+of+auditory+hair+cells+and+evidence+for+its+morphogenetic+role+during+the+regeneration+of+stereocilia+and+cuticular+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">The kinocilium of auditory hair cells and evidence for its morphogenetic role during the regeneration of stereocilia and cuticular plates.</a> Journal of neurocytology. 24, 633-653 (1995).</li>
<li>Denman-Johnson, K., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+hair+bundle+polarity+and+orientation+in+the+developing+vestibular+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">Establishment of hair bundle polarity and orientation in the developing vestibular system of the mouse.</a> Journal of neurocytology. 28, 821-835 (1999).</li>
<li>van Dam, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SYSCILIA+gold+standard+%28SCGSv1%29+of+known+ciliary+components+and+its+applications+within+a+systems+biology+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">The SYSCILIA gold standard (SCGSv1) of known ciliary components and its applications within a systems biology consortium.</a> Cilia. 2, 7(2013).</li>
<li>Blacque, O. E., Sanders, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+within+a+compartment%3A+what+C.+elegans+can+tell+us+about+ciliary+subdomain+composition%2C+biogenesis%2C+function%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Compartments within a compartment: what C. elegans can tell us about ciliary subdomain composition, biogenesis, function, and disease.</a> Organogenesis. 10, 126-137 (2014).</li>
<li>Wallingford, J. B., Mitchell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strange+as+it+may+seem%3A+the+many+links+between+Wnt+signaling%2C+planar+cell+polarity%2C+and+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Strange as it may seem: the many links between Wnt signaling, planar cell polarity, and cilia.</a> Genes & development. 25, 201-213 (2011).</li>
<li>Borovina, A., Ciruna, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFT88+plays+a+cilia-+and+PCP-independent+role+in+controlling+oriented+cell+divisions+during+vertebrate+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">IFT88 plays a cilia- and PCP-independent role in controlling oriented cell divisions during vertebrate embryonic development.</a> Cell reports. 5, 37-43 (2013).</li>
<li>Huang, P., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dampened+Hedgehog+signaling+but+normal+Wnt+signaling+in+zebrafish+without+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dampened Hedgehog signaling but normal Wnt signaling in zebrafish without cilia.</a> Development. 136, 3089-3098 (2009).</li>
<li>Ocbina, P. J., Tuson, M., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+not+required+for+normal+canonical+Wnt+signaling+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are not required for normal canonical Wnt signaling in the mouse embryo.</a> PloS one. 4, e6839(2009).</li>
<li>Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy%3A+preparation+and+imaging+for+SEM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy: preparation and imaging for SEM.</a> Methods Mol Biol. 915, 1-20 (2012).</li>
<li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Celsr1+disrupts+planar+polarity+of+inner+ear+hair+cells+and+causes+severe+neural+tube+defects+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse.</a> Current biology : CB. 13, 1129-1133 (2003).</li>
<li>Wang, Y., Guo, N., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Frizzled3+and+Frizzled6+in+neural+tube+closure+and+in+the+planar+polarity+of+inner-ear+sensory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 2147-2156 (2006).</li>
<li>Montcouquiol, M., Jones, J. M., Sans, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+planar+polarity+proteins+in+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of planar polarity proteins in mammalian cochlea.</a> Methods Mol Biol. 468, 207-219 (2008).</li>
<li>May-Simera, H., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+planar+cell+polarity+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Examining planar cell polarity in the mammalian cochlea.</a> Methods Mol Biol. 839, 157-171 (2012).</li>
<li>Yin, H., Copley, C. O., Goodrich, L. V., Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+phenotypes+between+different+vangl2+mutants+demonstrates+dominant+effects+of+the+Looptail+mutation+during+hair+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparison of phenotypes between different vangl2 mutants demonstrates dominant effects of the Looptail mutation during hair cell development.</a> PloS one. 7, e31988(2012).</li>
<li>Rachel, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Cep290+and+Mkks+ciliopathy+alleles+in+mice+rescues+sensory+defects+and+restores+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Combining Cep290 and Mkks ciliopathy alleles in mice rescues sensory defects and restores ciliogenesis.</a> J Clin Invest. 122, 1233-1245 (2012).</li>
<li>Jagger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alstrom+Syndrome+protein+ALMS1+localizes+to+basal+bodies+of+cochlear+hair+cells+and+regulates+cilium-dependent+planar+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Alstrom Syndrome protein ALMS1 localizes to basal bodies of cochlear hair cells and regulates cilium-dependent planar cell polarity.</a> Human molecular genetics. 20, 466-481 (2011).</li>
<li>Collin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Alstrom+Syndrome+Protein%2C+ALMS1%2C+Interacts+with+alpha-Actinin+and+Components+of+the+Endosome+Recycling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The Alstrom Syndrome Protein, ALMS1, Interacts with alpha-Actinin and Components of the Endosome Recycling Pathway.</a> PloS one. 7, e37925(2012).</li>
<li>Copley, C. O., Duncan, J. S., Liu, C., Cheng, H., Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+refinement+of+auditory+hair+cell+planar+polarity+deficits+occurs+in+the+absence+of+Vangl2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postnatal refinement of auditory hair cell planar polarity deficits occurs in the absence of Vangl2.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 14001-14016 (2013).</li>
<li>Sorusch, N., Wunderlich, K., Bauss, K., Nagel-Wolfrum, K., Wolfrum, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usher+syndrome+protein+network+functions+in+the+retina+and+their+relation+to+other+retinal+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Usher syndrome protein network functions in the retina and their relation to other retinal ciliopathies.</a> Advances in experimental medicine and biology. 801, 527-533 (2014).</li>
<li>Hebert, J. M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+cre+to+the+Foxg1+%28BF-1%29+locus+mediates+loxP+recombination+in+the+telencephalon+and+other+developing+head+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting of cre to the Foxg1 (BF-1) locus mediates loxP recombination in the telencephalon and other developing head structures.</a> Dev Biol. 222, 296-306 (2000).</li>
<li>Willott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8%2C+Measurement+of+the+auditory+brainstem+response+%28ABR%29+to+study+auditory+sensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chapter 8, Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice.</a> Current protocols in neuroscience. , Unit8 21B(2006).</li>
<li>Martin, G. K., Stagner, B. B., Lonsbury-Martin, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8%2C+Assessment+of+cochlear+function+in+mice%3A+distortion-product+otoacoustic+emissions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chapter 8, Assessment of cochlear function in mice: distortion-product otoacoustic emissions.</a> Current protocols in neuroscience. , Unit8 21C(2006).</li>
<li>Finetti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+is+required+for+polarized+recycling+of+the+TCR%2FCD3+complex+to+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse.</a> Nature cell biology. 11, 1332-1339 (2009).</li>
<li>Sedmak, T., Wolfrum, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+molecules+in+ciliary+and+nonciliary+cells+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport molecules in ciliary and nonciliary cells of the retina.</a> J Cell Biol. 189, 171-186 (2010).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+horizons%3A+ciliary+proteins+reach+beyond+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+genetics%22%5BJournal%5D)">Expanding horizons: ciliary proteins reach beyond cilia.</a> Annual review of genetics. 47, 353-376 (2013).</li>
<li>Tarchini, B., Jolicoeur, C., Cayouette, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+blueprint+at+the+apical+surface+establishes+planar+asymmetry+in+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">A molecular blueprint at the apical surface establishes planar asymmetry in cochlear hair cells.</a> Developmental cell. 27, 88-102 (2013).</li>
<li>Ezan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilium+migration+depends+on+G-protein+signalling+control+of+subapical+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Primary cilium migration depends on G-protein signalling control of subapical cytoskeleton.</a> Nature cell biology. 15, 1107-1115 (2013).</li>
</ol>

De auteur verklaart geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Bij de voorbereiding van cochleaire weefsel voor analyse, er zijn een paar belangrijke punten in gedachten te houden. Ten eerste, de verschillen in genetische achtergrond kan het cochleair fenotype aan te passen, waardoor het noodzakelijk is om te analyseren en te vergelijken alleen nestgenoot controles. Ten tweede is volledige verwijdering van de tectoriaal membraan vereist om de beste beelden met immunohistochemie verkrijgen en is essentieel voor SEM. Het tectoriaal membraan een ondoorzichtige structuur en kunnen de c...

Primaire cilia lange microtubule-gebaseerde aanhangsels die zich uitstrekken vanaf het oppervlak van de meeste zoogdierlijke cellen. Primaire cilia worden vaak verward met beweeglijke cilia, waarvan er altijd meerdere per cel, en waarvan het doel is om de vloeistof over membraanoppervlakken bewegen. Primaire cilia daarentegen vast sensorische rollen en derhalve ook wel sensorische cilia. Eenmaal lang vergeten, dit organel is onlangs herontdekt als gevolg van de associatie met een veelheid van menselijke genetische ziekten 1. Idealiter gepositioneerd als een signalerende organel, heeft de primaire cilium aangetoond talrijke signaalwegen, waarvan vele niet alleen belangrijk in weefsel homeostase en ziekte, maar ook tijdens de ontwikkeling 2 reguleren. Een van de eerste signaalwegen aangetoond geassocieerd te zijn met cilia disfunctie de Wnt signaling pathway, ook bekend als het vlakke celpolariteit (PCP) pathway <sup<html> &gt; 3. Dit signaalcascade aanvankelijk geïdentificeerd in Drosophila, is van cruciaal belang voor embryogenese; met name convergentie en extensie processen en de juiste oriëntatie van cellen in het vlak van epitheel 4. De sequentiële signalering van een kern set van regulerende eiwitten vertaalt directionele signalen die uiteindelijk leiden tot het cytoskelet herschikkingen en resulteren in de gecoördineerde polarisatie van epitheelcellen in een vlak 5. Het proces van convergentie en uitbreiding is absoluut noodzakelijk voor het cochleair kanaal te verlengen en voor de juiste cellulaire patroonvorming 6. Aangezien dit gereguleerd via activatie van de PCP route, een van de meest opvallende fenotypen van mutanten cochlea PCP is een verkorte cochleair kanaal met ongeorganiseerd sensorische epithelia 7. Evenzo muismutanten die cilia missen, vertonen ook zo&#39;n convergentie en extensie fenotype 8,9, maar precies hoe dit gereguleerd moet nog worden opgehelderd. ve_content &quot;&gt; Omdat convergentie en extensie processen zijn van cruciaal belang voor de uitgroei van het cochleair kanaal, en cellulaire patroonvorming van de sensorische epitheel binnen het cochleair kanaal, de ontwikkelingslanden cochlea is een ideaal orgaan waarin PCP signalering te onderzoeken tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren. Het orgel van corti, de term voor de gespecialiseerde sensorische epitheel dat lijnen de cochleaire kanaal, bestaat uit niet-sensorische steuncellen en mechanosensorische haarcellen die uniform moeten worden georiënteerd om de cochlea functioneren 10. de mechanosensorische haarcellen worden zo genoemd omdat de stereociliary bundels die zich uitstrekken van de cuticulaire plaat (apicale oppervlak) van elk zintuighaarcellen cel 11. Deze fungeren als primaire omzetters van mechanosensation en ondanks hun nomenclatuur stereocilia, zijn eigenlijk samengesteld uit gemodificeerde actine-filament op basis van microvilli. Binnen elke chevron-vormige hair bundel, drie rijen stereocilia georganiseerd in een sterk geordende en regelmatige pattern in een trap-achtige manier. Real-microtubule gebaseerde trilharen, kinocilia genoemd, zijn vereist voor de ontwikkeling en oriëntatie van de stereociliary bundels 12. Bij elke haar cel, wordt één kinocilium fysiek verbonden aan de stereocilia bundel, centraal gelegen naast de langste rij stereocilia. De precieze functie van de kinocilium is onduidelijk, en een hypothese is dat de kinocilium &#39;trekt&#39; de stereocilia in vorm als ze volwassen worden van microvilli 12. In vertebraten, kinocilia in de cochlea alleen aanwezig tijdelijk en intrekken van de haarcellen in muizen voorafgaand aan het begin van het gehoor 11,13,14. Volledig verlies van trilharen in de ontwikkeling van cochlea resulteert in sterk verkorte cochleaire kanalen, verkeerd gevormde of scheef georiënteerde stereociliary bundels, evenals verkeerd gepositioneerd basaalkorrels 8,9. Een functioneel cilium is niet alleen bestaat uit het ciliaire axoneme. Veel eiwitten geassocieerd met ciliafunctie komen in complexen gelokaliseerd op cilia-gerelateerde subdomeinen, zoals de basale lichaam, overgangszone, of ciliaire axoneme 15. De basale instantie, gebaseerd op de moeder centriole van het centrosoom, is een microtubulus organiserende centrum voor microtubules weg van de cilium uitstrekt in het cellichaam en kan intracellulair transport en ciliaire handel reguleren. De ciliaire overgangszone is een ander gebied waar de ciliaire functie is geregeld op het gebied van het organiseren van import en export van trilharen verbindingen 16. Meerdere studies hebben een verband tussen cilia en niet-canonieke Wnt (PCP signalering) geïdentificeerd, hoewel het precieze mechanisme is onduidelijk 17. Redundantie van ciliaire en PCP genen en de gevoeligheid van de cel polariteit van algemene cellulaire abnormaliteiten, maken het moeilijk om direct een mutatie koppelen aan PCP-specifieke tekorten. Een van de uitlezingen van PCP signalering is de positionering van de basale lichaamstemperatuur en primary cilium, dus scheiden de primaire uit de secundaire gebreken is uitdagend. Sommige studies in zebravis en muis mutanten hebben geen verband tussen de trilharen en Wnt signalering 18-20 voorgesteld. Discrepanties in de gegevens kunnen species, weefsel of tijdelijke-afhankelijke verschillen in ciliaire bijdragen aan Wnt-signalering weerspiegelen. Bovendien zou normaal Wnt reactievermogen blijven, indien basale lichamen blijven functioneren. Een beter inzicht in de rol van ciliaire eiwitten in cellulaire signaalroutes en andere biologische verschijnselen is cruciaal voor ons begrip van cellulaire en ontwikkelingsbiologie en voor de ontwikkeling van gerichte behandelingsstrategieën.

<table><tbody><tr><td>Tools/Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicone elastomere - Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761028-5EA</td><td>Zie opmerking 2</td></tr><tr><td>Micro dissecting scissors-straight blade</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope.</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uncoated glass microscope slides</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover slips (22 mm &times; 40 mm &times; 0.15 mm)</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minutien pins</td><td>&nbsp;Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>SEM sample holder</td><td>tousimis</td><td>8762</td><td></td></tr><tr><td>Scanning electron microscopy studs</td><td>TED PELLA</td><td>16111</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Tabs: Carbon adhesive</td><td>TED PELLA</td><td>16084-3</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Critical Point Dryer</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slides</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe Tissue&nbsp;</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Paint Brush</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&times; Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&nbsp; (PFA) (EM Grade Required for EM)</td><td>Various</td><td></td><td>Bereid een 4% oplossing in 1&times; PBS die elke keer vers gemaakt wordt. EM Grade Required for EM.</td></tr><tr><td>2.5% Glutaraldehyde Grade1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 7.5)</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl 2</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G Mounting media</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>10&times; Hanks&rsquo; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>14065</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide (OsO4 )</td><td>Sigma-Aldrich/Fluka Analytical</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Tannic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti Arl13b</td><td>Protein Tech</td><td>17711-1-AP</td><td>Voorgestelde concentratie 1:1.000</td></tr><tr><td>anti acetylated tubulin (611-B1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>Voorgestelde concentratie 1:800</td></tr><tr><td>anti gamma tubulin (GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td>Voorgestelde concentratie 1:200</td></tr><tr><td>anti Zo_1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>40-2300</td><td>Voorgestelde concentratie 1:500</td></tr><tr><td>Myosin VI</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6791</td><td>Voorgestelde concentratie 1:1000</td></tr><tr><td>Myosin VIIa</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td>Voorgestelde concentratie 1:1.000</td></tr><tr><td>anti Vangl2</td><td>Merk Millipore</td><td>ABN373</td><td>Voorgestelde concentratie 1:250</td></tr><tr><td>anti G&alpha;i3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4040</td><td>Voorgestelde concentratie 1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td>Voorgestelde concentratie 1:300 - 1.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 568 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12380</td><td>Voorgestelde concentratie 1:300 - 1.000</td></tr></tbody></table>

evaluatie van planar-cell-polariteit phenotypes in ciliopathie mouse mutant cochlea

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In de afgelopen jaren zijn primaire cilia naar voren gekomen als belangrijke regulatoren bij ontwikkeling en ziekte door hun invloed op talrijke signaalroutes. Een van de vroegste signaalroutes waarvan is aangetoond dat ze geassocieerd zijn met ciliaire functie, was de niet-canonieke Wnt-signaalroute, ook wel aangeduid als planaire celpolariteits (PCP)-signalering. Een van de beste plaatsen om de effecten van planaire celpolariteits (PCP)-signalering tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren te bestuderen, is de cochlea van zoogdieren. Verstoring van PCP-signalering in de cochlea van muizen verstoort de uitgroei van de cochlea, cellulaire patroonvorming en oriëntatie van haarcellen, die allemaal worden beïnvloed door ciliaire disfunctie. Het doel van dit protocol is om de analyse van PCP-signalering in de zich ontwikkelende cochlea van zoogdieren te beschrijven via fenotypopsporing, immunohistochemie en rasterelektronenmicroscopie. Defecten in convergentie en extensie manifesteren zich als een verkorting van het cochleaire kanaal en/of veranderingen in cellulaire patroonvorming, die kunnen worden gekwantificeerd na dissectie van zich ontwikkelende muismutanten. Veranderingen in de oriëntatie van stereociliaire bundels en de lengte of positie van kinocilia kunnen worden waargenomen en gekwantificeerd met behulp van immunofluorescence of rasterelektronenmicroscopie (SEM). Een dieper inzicht in de rol van ciliaire eiwitten in cellulaire signaalroutes en andere biologische fenomenen is cruciaal voor ons begrip van cellulaire en ontwikkelingsbiologie, evenals voor de ontwikkeling van gerichte behandelingsstrategieën.

Slakkenhuis Dissection en Tissue Voorbereiding Na verwijdering van de hersenen, post middellijn sagittale dissectie van een P0 muis hoofd, de benige labyrint, van achteren gezien, kunnen worden gevisualiseerd (Figuur 1A, witte pijl) en verwijderd. Figuur 1B toont de geïsoleerde benige labyrint met cochleair haren naar boven, ventrale, (links) en van achteren, dorsale (rechts)....

Primaire cilia beïnvloeden verschillende signaalroutes. De cochlea van zoogdieren is ideaal voor het onderzoeken van planaire celpolariteit (PCP) signalering. Cilia-disfunctie beïnvloedt cochleaire uitgroei, cellulaire patterning en oriëntatie van haarcellen, uitlezingen van PCP. Ons doel is om PCP-signalering in muis cochlea te analyseren via fenotypische analyse, immunohistologie en rasterelektronenmicroscopie.

Evaluatie van Planar-Cell-Polariteit Phenotypes in ciliopathie Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Het algemene doel van dit protocol is om de cochlea van muizen met ciliaire mutaties te onderzoeken op fenotypen van de planaire celpolariteit. Deze technieken maken een uitgebreide detaillering van het cochleaire fenotype mogelijk, wat zal leiden tot een nauwkeuriger begrip van de ciliaire betrokkenheid bij het tot stand brengen van de PCP-signalering bij vertebraten. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat, zodra het beheerst is, de gedissecteerde cochleaire epithelia kunnen worden gebruikt voor diverse soorten fenotypische analyses.Nadat de reagentia en het weefsel van de proefdieren, in het ontwikkelingsstadium E16,5 tot p3, zijn voorbereid, gebruikt u een scalpelblad of een klein schaartje om de kop langs de sagittale middellijn te ontleden, beginnend bij de neus en uitlopend tot het achterhoofdsgat. Verwijder de hersenen uit elke schedelhelft met een pincet. Identificeer vervolgens de slaapbeenderen die de zich ontwikkelende benige labyrinten van het binnenoor bevatten.Terwijl u met het monster onder een dissectiemicroscoop werkt, gebruikt u een pincet om de benige labyrinten van de schedel te scheiden door het pincet voorzichtig onder de benige labyrinten door te bewegen. Gebruik na de dissectie de punt van het dissectiepincet om het ovale en het ronde venster vrij te maken en maak een klein gaatje in de apex van de cochleaire spiraal. Fixeer vervolgens de benige labyrinten gedurende vijf minuten op ijs in 1,5 milliliters 4%paraformaldehyde om de tectoriale membraan gemakkelijk te kunnen verwijderen.Plaats nu de botte labyrinten in een zwarte, met siliconen elastomeer gecoate dissectieschaal met PBS om de dissectie te vergemakkelijken. Gebruik een pincet nummer vijf om het buitenste kraakbeen te verwijderen, zodat het cochleaire ductus bloot komt te liggen. Begin bij het ovale venster, steek de onderste punt van het pincet in het ovale venster en wrik het kraakbeen voorzichtig open, terwijl u langzaam naar boven in de richting van de apex beweegt.Gebruik vervolgens een fijne pincet om het membraan van Reissner aan de basis van het cochleaire ductus vast te pakken en pel het met een opwaartse beweging af. Visualiseer de dorsale zijde van het cochleaire ductus, inclusief het sensorische epitheel. Gebruik daarna een nummer 55 pincet om het tectoriaal membraan aan de basis van de cochlea vast te pakken en pel dit opwaarts richting de apex af.Volledige verwijdering van het tectoriale membraan is vereist om de beste beelden met immunohistochemie te verkrijgen en is essentieel voor scanning elektronenmicroscopie. Nadat het Corti-orgaan is blootgelegd, wordt het weefsel verder gefixeerd en wordt immunohistochemie uitgevoerd, of wordt de preparatie voor scanning elektronenmicroscopie voorbereid, zoals gedetailleerd in het geschreven gedeelte van het protocol. Nadat het weefsel is gekleurd, wordt het monster geplaatst in een zwarte schaal van siliconen elastomeer met PBS.Verwijder met een fijne pincet de vestibulaire regio uit de cochleaire spiraal. Verwijder vervolgens zeer voorzichtig het onderliggende kraakbeen en mesenchym uit de cochleaire spiraal. De resterende cochleaire spiraal bevat de innerlijke sulcus, het Cortisch orgaan en de buitenste sulcus.Breng de cochleaire spiraal over naar een druppel PBS op een microscoopglaasje. Absorbeer de PBS met een absorberend tissue of een stuk filterpapier en positioneer de cochleaire spiraal voorzichtig opnieuw als het epitheel is verschoven en over zichzelf heen ligt. Voeg een druppel monteermedium direct toe aan het cochlea-monster en plaats voorzichtig een dekglas direct op het monster, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen luchtbellen ontstaan.Gebruik een epifluorescentie- of laser-scanning confocale microscoop die is uitgerust met objectieven met een hoge vergroting en een hoge numerieke apertuur om beelden van het apicale oppervlak van de cochleaire haarcel vast te leggen. Gebruik objectieven met een lagere vergroting om overlappende beelden van de cochleaire spiraal te maken om de lengte van het cochleaire ductus te kwantificeren. De volgende beelden tonen immunofluorescente kleuring van de basale winding van een cochlea op de eerste postnatale dag.Phalloïdine labelt filamenteus actine in stereocilia en corticaal actine aan de celperiferie. Myosine VIIA is een marker voor binnenste en buitenste haarcellen. ZO_1 labelt de tight junctions tussen de cellen, waardoor het een uitstekende marker is om celgrenzen te onderscheiden.Geacetyleerde alfa-tubuline wordt gebruikt als marker voor het kinocilium bij de top van het bundeltje, zoals aangegeven door de witte pijl. Interne microtubuli worden eveneens gelabeld door geacetyleerde alfa-tubuline, welke bijzonder overvloedig aanwezig zijn in pijlercellen, zoals aangegeven door de witte asterisken. Deze afbeelding van gedissecteerde cochleaire ducten bij E18.5, gekleurd met geacetyleerde tubuline, toont een duidelijke verkorting van de cochleaire ducten bij de IFT20 conditionele knockout in vergelijking met de controle.De volgende afbeelding is een whole-mount preparaat van de basale winding van het slakkenhuis bij BBS8-knockoutmuizen op postnatale dag nul. Stereociliaire bundels in BBS8-knockout cochleae zijn variabel geroteerd, zoals aangegeven door de rechterpijl, of afgeplat en verkeerd gelokaliseerd, zoals aangegeven door de middelste pijl. De kinocilia zijn verkeerd gelokaliseerd, of axonemen ontbreken, zoals aangegeven door de linkerpijl.Bij het voorbereiden van het cochleaire fenotype voor analyse is het belangrijk om te onthouden dat verschillen in de genetische achtergrond het cochleaire fenotype kunnen beïnvloeden. Daarom is het essentieel om nestgenoot-controles te gebruiken voor de analyse. Verdere analyses omvatten audiometrisch onderzoek en het kweken van cochleaire explantaten, wat behandeling met diverse signaleringsactivatoren of -remmers mogelijk maakt en zo bijdraagt aan het mechanistische begrip van de betrokken ontwikkelingsprocessen.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u cochleair weefsel prepareert voor het analyseren van de rol van ciliaire componenten en hun specifieke effecten op PCP-signalering.

evaluation-planar-cell-polarity-phenotypes-ciliopathy-mouse-mutant

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een eenvoudige procedure van vibratome snijden het orgaan van Corti, gevolgd door immunohistochemie en confocale microscopie is beschreven. Deze procedure zorgt voor een betere conservering van de fijne cytoarchitecture van de zoogdieren orgaan van Corti, en dus zorgt voor accurate kwantificering van celtypen.

Vibratome Sectioning voor Enhanced Behoud van de Cytoarchitecture van de zoogdieren orgaan van Corti

Flowcytometrie is een krachtig instrument waarmee specifieke celpopulaties kunnen worden geïsoleerd en bestudeerd. Dit protocol beschrijft de stappen voor het isoleren van LacZ-expresserende cellen uit cochleaire weefsels van neonatale transgene muizen. Gedissocieerde cochleaire cellen werden gelabeld met fluorescentie-geconjugeerde substraten van β-galactosidase voorafgaand aan de scheiding via flowcytometrie.

Isoleren van LacZ-expressie Cellen van Mouse Inner Ear weefsels met behulp van flowcytometrie

Live beeldvorming van de embryonale zoogdieren slakkenhuis is uitdagend omdat de ontwikkelingsprocessen bij de hand werken op een tijdelijke helling van meer dan tien dagen. Hier presenteren we een methode voor het kweken en dan het afbeelden embryonale cochleair explant weefsel afkomstig van een fluorescerende reporter muis over vijf dagen.

Langdurige Time Lapse Imaging van Muis Cochlear Explantaten

We presenteren een methode die de isolatie en kweek van cochleaire explantaten van het binnenoor van embryonale muizen beschrijft. We demonstreren ook een methode voor genoverdracht naar cochleaire explantaten via vierkantgolfelektroporatie. De in vitro explantaatkweek gekoppeld aan de genoverdrachtstechniek stelt onderzoekers in staat om de effecten van het veranderen van genexpressie tijdens de ontwikkeling te bestuderen.

Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie

We presenteren een methode om de volwassen orgaan van Corti isoleren drie intacte cochleaire windingen (apex, midden en base). We tonen ook een procedure voor immunokleuring met fluorescent gelabelde antilichamen. Samen technieken maken het bestuderen van haarcellen, steuncellen en andere celtypen in de cochlea.

Hele Mount Dissection en Immunofluorescentie van de Adult Mouse Cochlea

We presenteren een protocol om de auditieve bulla, capsule en gehoorbeentjes te isoleren van postnatale muizen voor gehele montage en histologische analyse.

Dissectie van de auditieve Bulla in postnatale muizen: Isolatie van het middenoor botten en histologische analyse

Driedimensionale organotypic culturen van de lymfkliertest utricle en het slakkenhuis in optisch duidelijk collageen ik gels behouden aangeboren weefsel morfologie, toestaan voor mechanische stimulatie via aanpassing van matrix stijfheid en virus-gemedieerde gene levering toestaan.

Driedimensionale Organotypic culturen van vestibulaire en auditieve zintuigen

Dit manuscript beschrijft een experimenteel protocol voor het evalueren van de morfologische kenmerken en functionele status van het lint synapsen in normale muizen. Het huidige model is ook geschikt voor door lawaai geïnduceerde en leeftijdsgebonden cochlear synaptopathy-beperkte modellen. De correlatieve resultaten van eerdere muizen studies worden ook besproken.

Morfologische en functionele evaluatie van het lint synapsen op specifieke frequentiegebieden van de muis cochlea

Dit artikel presenteert een gemodificeerde cochleaire oppervlakte bereidingsmethode die de decalcificatie en het gebruik van een cel en weefsellijm vereist om de stukjes cochleaire epitheel te hechten aan 10 mm ronde afdek stroken voor immunohistochemie in volwassen muis cochleae.

Cochleaire oppervlakte voorbereiding in de volwassen muis

Deze studie beschrijft hoe de endolymfatische zak op verschillende leeftijden uit het binnenoor van de muis kan worden ontleed. Het resultaat van een soortgelijke dissectie wordt getoond in een Slc26a4-null muismodel van vergroting van de endolymfatische zak. Een transgene muis met een fluorescerende reporter uitgedrukt in de endolymfatische zak wordt gepresenteerd als een model om de endolymfatische zak gemakkelijk te visualiseren en een educatief hulpmiddel.

Dissectie van de endolymfatische zak van muizen

Het huidige protocol is een update van eerdere protocollen en bevat relatief eenvoudige benaderingen voor het kweken van hoogwaardige cochleaire explantaten. Dit zorgt voor betrouwbare data-acquisitie en beeldvorming met hoge resolutie in levende en vaste cellen. Dit protocol ondersteunt de voortdurende trend om binnenoorcellen te bestuderen.

Volledige neonatale cochleaire explantaten als een in vitro model

Leer hoe je planar-cell-polariteit fenotypen analyseert in ciliopathie muizen met immunohistochemie en scanning elektronenmicroscopie. Deze methode versterkt inzicht in ciliaire functies bij cochleaire ontwikkeling.

Evaluatie van Planar-Cell-Polariteit Phenotypes in ciliopathie Mouse Mutant Cochlea

Meer video's verkennen