Name: Hele Mount Dissection en Immunofluorescentie van de Adult Mouse Cochlea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor whole mount dissectie van de volwassen muizen-cochlea met behoud van drie intacte windingen. Deze techniek combineert immunofluorescentie en confocale microscopie voor gedetailleerde visualisatie van haarcellen en ondersteunende cellen in het orgaan van Corti.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een subsidie van het Office of Naval Research (N000141310569). De apparatuur van de Research Imaging Facility van de Southern Illinois University School of Medicine werd ondersteund door het National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).

Ethiek Verklaring: Procedure waarbij proefdieren zijn door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Southern Illinois University School of Medicine. 1. Winning van Temporal Bones <ol><li> Identificeren temporale botten in de onderkant van de muis schedel 13 en schraap de hersenzenuwen met behulp van standaard patroon tang. </li><li> Plaats standaard patroon tang op het puntje van de otic capsule en met de duim van de andere hand drukt op de achterste halfronde kanaal naar de ingekapselde slakkenhuis verjagen. </li><li> Bevrijd de onderste helft van de temporale bot van de schedel van de hand met de duim en wijsvinger of met behulp van 10,5 cm fijne schaar. </li></ol> 2. Post-fix Temporal Bones <ol><li> Plaats rotsbeenderen in 2 ml microcentrifuge buisjes die 250 - 500 pi 4% paraformaldehyde (PFA) verdund in 10 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 en incubaten bij kamertemperatuur gedurende 2 - 20 uur. OPMERKING: nr opening van de apicale dop of injectie van PFA in de ronde of ovale venster nodig. Raden het gebruik van methanol vrij, ultra-zuivere, elektronenmicroscopie (EM) rang PFA die kunnen worden gekocht bij een concentratie van 16% in glazen flesjes. Zodra een injectieflacon geopend en verdund 1: 4 in PBS, waardoor een 4% oplossing, kan het worden gebruikt voor maximaal 2 weken indien bewaard bij 4 ° C (sommige antilichamen vereisen korte fixatie en anderen kunnen verdragen O / N (O / N) fixatie). </li></ol> 3. ontkalken Temporal Bones <ol><li> Na fixatie verwijdert PFA met een pipet en vervangen door 120 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), iets meer dan 2 ml. Zorg ervoor dat u de volledige 2 ml microcentrifugebuis om te voorkomen dat luchtbellen wanneer de buis wordt gesloten te vullen. <ol><li> Als het niet onmiddellijk ontkalken, vervang PFA met 10 mM PBS pH 7,4 en bewaar monsters bij 4 ° C. NB: Na fixatie, kan temporale botten worden opgeslagen voor variable bedragen van tijd voordat ontkalking afhankelijk van de antigenen wordt onderzocht. </li></ol></li><li> Plaats de buisjes op end-over-end rotator en draaien met 4 rpm bij kamertemperatuur. Verander EDTA-oplossing dagelijkse pipetteren. Lengte van de ontkalking is afhankelijk van de leeftijd van het monster en de voorkeur van de wetenschapper het doen van de dissectie. <ol><li> Incubate temporale botten in EDTA met de volgende richtlijnen voor de incubatietijd: Voor monsters postnatale dag (P) 8 tot P15: 2-4 uur; Voor monsters P15 naar P21: O / N; Voor monsters P21 naar P30: 2 O / N; Voor monsters boven de P30: 3 of meer O / N. OPMERKING: Ontkalken tijden zijn afhankelijk van de voorkeur van de gebruikers en kan zo nodig worden verlengd. Ontkalkingstijdstip kan worden verminderd door de EDTA-oplossing tweemaal per dag, ongeveer 8 uur apart. Sommige laboratoria voeg 1% PFA aan de EDTA-oplossing bij het ontkalken langer dan 3 dagen om besmetting te voorkomen. </li></ol></li><li> Om te bepalen of het monster afdoende is ontkalkt, plaatst temporale botten ona silicium elastomeer-gecoate dissectie gerecht en druk voorzichtig op een tang op de slak-vormige slakkenhuis. Wanneer het weefsel spongey, dan ontkalking voltooid. </li><li> Zodra ontkalking is voltooid, verwijdert EDTA met een pipet en voeg 500 -1000 pl 10 mM PBS pH 7,4. Store monsters bij 4 ° C tot klaar te ontleden. </li></ol> 4. Maak Silicone elastomeer gecoate Dissection Dish <ol><li> Combineer de basis en verharder van een siliconenelastomeer inkapselingsmiddel kit volgens de instructies van de fabrikant en meng. </li><li> Voeg ongeveer 2 - 3 eetlepels poederkool tot de oplossing zwart en meng. OPMERKING: Vloeibare inkt of houtskool niet mengen met de oplossing en kan niet worden gebruikt. Siliconenelastomeer inkapselingsmiddel kits kunnen worden gekocht in het zwart, waardoor stap 4.2 worden weggelaten. </li><li> Giet de oplossing in 60 mm glazen of plastic Petrischalen, vullen genoeg het bekleden van de bodem. Als bubbles aanwezig, bladerdeeg met lucht op het oppervlak. Laat staan ​​ten minste 24 uur bij kamertemperatuur in te stellen. OPMERKING: Silicone-elastomeer gecoate gerechten kunnen herhaaldelijk worden gebruikt voor jaren. Echter niet gebruiken ethanol reinigen, aangezien hierdoor het siliconenelastomeer te kraken. </li></ol> 5. Hele Mount Dissectie van het slakkenhuis (voor P7 en Oudere Samples) <ol><li> Scheid de basale beurt vanaf midden / apicale beurt <ol><li> Plaats een ontkalkt temporale bot in een siliconenelastomeer-gecoate dissectie schotel gevuld tweederde vol met 10 mM PBS pH 7,4 en het gebruik van een stereo-dissectie microscoop voor de volgende stappen. </li><li> Houd de temporale bot in het evenwichtsorgaan regio met # 4 of # 5 tang recht juwelier en het gebruik van 5 mm Vannas-Tübingen lente schaar, weggesneden overtollige otic capsule weefsel langs de zijkanten en boven de apex. </li><li> Met 2,5 mm Vannas lente schaar, steek een mes in het ovale venster en maak een aantal kleine sneetjes langs de spiraal ligament / lateralewand van de basale turn. </li><li> Met behulp van 5 mm Vannas-Tübingen lente schaar, steek een mes in de regio gewoon knippen en plaats de overige mes op de buitenkant van de temporale bot, mediaal van het ovale venster. Dit gesneden scheidt de basale beurt uit midden en apicale bochten. </li></ol></li><li> Volledige dissectie van de basale beurt. <ol><li> Gebruik 2,5 mm Vannas spring schaar, knip de ganglion spirale zenuwvezels die aansluiten op de modiolus om de spanning in de basale beurt loslaten en onder de basale beurt gesneden scheiden van vestibulaire organen. </li><li> Gebruik 2,5 mm Vannas spring schaar, maak een reeks kleine bezuinigingen op de spiraalvormige ligament / zijwand van zowel boven als onder het orgaan van Corti verwijderen. Gebruik # 4 of # 5 tang rechtstreeks juwelier om het weefsel te leiden. Speld de spiraal ganglion zenuwvezels naar de siliconen-elastomeer gecoate dissectie gerecht, maar niet in het bezit op dit gebied als het weefsel scheurt. </li><li> Tijdens de vorige stappen, een aantal van Reissner&#39;s membrane zal vaak worden verwijderd. Als een nog steeds, het grijpen van de Reissner membraan met een pincet # 4 of # 5 recht juwelier en weg te trekken van het orgaan van Corti. LET OP: De tectorial membraan is zelden zichtbaar en typisch zweeft weg zonder dat er een specifieke stap voor verwijdering. </li><li> Eindelijk meerdere sneden om de dikte van de ganglion spirale axonen te verminderen, uit het begin zo vlak mogelijk te maken en te gebruiken # 4 en # 5 tang rechte juwelier de ontleed basale turn overbrengen door grijpen de resterende axonen van de ganglion spirale aan een 48-well plaat (of kamer slide) met -500 pl 10 mM PBS pH 7,4. </li></ol></li><li> Aparte middelste en apicale bochten <ol><li> Leg de resterende tweederde van de cochlea, apicale naar beneden. </li><li> Gebruik 2,5 mm Vannas spring schaar, steek een mes in de scala media waarin de middelste draai vroeger verbonden met de basale beurt en maak een aantal kleine sneden langs de spiraalvormige ligament / zijwand van the midden beurt. </li><li> Met behulp van 5 mm Vannas-Tübingen spring schaar, steek een mes in het gebied knip de middelste draai bovenop het blad, en plaats het andere mes op de buiten de benige labyrint, een 90 o hoek vanaf het apicale uiteinde. Dit scheidt het midden beurt van de apicale beurt. </li></ol></li><li> Volledige ontleding van de middelste draai op dezelfde wijze als de basale bocht (zie stap 5.2.2 tot 5.2.4). </li><li> Volledige dissectie van de apicale beurt. <ol><li> Met 2,5 mm Vannas lente schaar, open de kap die de apicale beurt bedekt. Compleet dissectie op soortgelijke wijze als de basale bocht (zie stap 5.2.2 tot 5.2.4). OPMERKING: De ontlede cochleaire windingen kunnen worden opgeslagen in 10 mM PBS pH 7,4 in een 48-well plaat (of kamer slide) bij 4 ° C gedurende enkele weken voor immunokleuring. Echter PBS langer dan 2 verdampen en moet periodiek worden bijgevuld en opslag - 3 weken kan leiden tot bacteriële of schimmelgroei opweefsel dat de kwaliteit van het beeld kan verminderen. Wij adviseren langdurige opslag van de monsters als undissected temporale botten. </li></ol></li></ol> 6. Immunokleuring met fluorescent Tagged Antilichamen <ol><li> Na dissectie, leg elk cochleaire beurt in een afzonderlijk putje in een 48-well plaat (of kamer slide), ondergedompeld in ~ 500 pi 10 mM PBS pH 7,4. Voor elk van de volgende stappen het cochleair weer moet worden ondergedompeld in vloeibare, niet zwevend boven of vast aan de zijkant van de put. OPMERKING: Bij het verwijderen van vloeistof uit elk putje, is het gemakkelijk om het cochleair beurt te verliezen of suck it up in de pipetpunt. Veranderen van oplossingen met een 200 ul pipet met behulp van een dissectie scope zal helpen dit te voorkomen. </li><li> Pipetteer verwijdert PBS uit elk putje en vervangen door ~ 200 - 300 pl per putje van blokkerende / permeabilisatie oplossing (1% Triton X-100, 1% runderserumalbumine (BSA) en 10% normaal geit serum (NGS) verdund in 10 mM PBS pH 7,4). Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur op een 3D-rotator. LET OP: Als een primair antilichaam gebruikt werd gemaakt in een geit gastheer, dan is een secundaire anti-geit antilichaam zal nodig zijn en NGS mag NIET worden gebruikt voor een van de stappen. Paardennormaalserum kan worden gebruikt als vervanging voor NGS. </li><li> Verwijder geblokkeerde / permeabilisatie oplossing met een pipet en vervangen ~ 100 ul per putje primair antilichaam-oplossing (0,1% Triton X-100, 1% BSA en 5% NGS verdund in 10 mM PBS pH 7,4). De verdunningsfactor voor elke primaire antilichaam varieert. Incubeer O / N (minimaal 14 uur) bij 4 ° C op een rotator 3D. OPMERKING: Indien meer dan één primaire antilichaam wordt gebruikt, ook gecombineerd in dezelfde oplossing incubatie zorg ervoor dat elke primaire antilichaam een ​​andere host. </li><li> Verwijder primair antilichaam oplossing met een pipet en voer 3 wasbeurten van 10 mM PBS pH 7,4 bij ~ 500 ul per putje. Elke wasbeurt broedt een minimum van 5 min bij RT op een 3D-rotator. </li><li> Verwijder laatste PBS wassen met een pipet vervangen ~ 100 ul per putje van secundair antilichaam-oplossing (0,1% Triton X-100, 1% BSA en 5% NGS verdund in 10 mM PBS pH 7,4). De verdunningsfactor voor elk fluorescent gelabeld secundair antilichaam is gewoonlijk 1: 500 of 1: 1000. Plaats 48-well plaat in een zwarte doos te beschermen fluorescent gelabeld secundaire antilichamen tegen licht. Incubeer 2 - 3 uur bij kamertemperatuur op een rotator 3D. OPMERKING: Indien meer dan één secundaire antilichaam nodig, kunnen zij worden gecombineerd in dezelfde oplossing voor incubatie. Zorg ervoor dat er geen mogelijkheid van cross-labeling (bijv., Met behulp van geit anti-konijn en kip anti-geit secundaire antilichamen) </li><li> Verwijder secundair antilichaam oplossing met een pipet en voer 3 wasbeurten van 10 mM PBS pH 7,4 bij ~ 500 ul per putje. Incubeer elke wasbeurt gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur op een rotator 3D. Houd 48-well plaat in een zwarte doos te beschermen tegen licht. </li><li> Verwijder laatste PBS wassen met een pipet en te vervangen door ~ 100 ul per putje van Hoechst 33.342 (verdund 1: 2000 in 10 mM PBS pH 7,4) om kernen te labelen. Incubeer 15 - 20 min bij kamertemperatuur op een rotator 3D. Houd 48-well plaat in een zwarte doos te beschermen tegen licht. NIET broeden langer dan 20 min. </li><li> Verwijder Hoechst oplossing met een pipet en voer 3 wasbeurten van 10 mM PBS pH 7,4 bij ~ 500 ul per putje. Incubeer elke wasbeurt gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur op een rotator 3D. Houd 48-well plaat in een zwarte doos te beschermen tegen licht. </li><li> Alle stappen kunnen worden verlengd, behalve Hoechst incubatie verschillende uren indien nodig. Om de reactie te onderbreken in elk stadium, net onderdompelen monsters in ~ 500 ul van 10 mM PBS pH 7,4 en opslaan van de 48 -goed plaat (of kamer slide) bij 4 ° C tot klaar om het protocol uur of 1 hervatten - 2 dagen later . </li></ol> 7. Mount Cochlear Schakelt Slides <ol><li> Etiket schuift met relevante informatie over het monster en antilichamen gebruikt. </li><li> Pipet ~ 50 ul van de montage media op elke dia en wees voorzichtigom luchtbellen te voorkomen. Centrifugeer de buis met de montage media om eventuele luchtbellen te verwijderen. </li><li> Met behulp van # 4 of tang # 5 recht juwelier, pakt u de axonen van de spiraal ganglion om voorzichtig te dragen een cochleair beurt van de 48-wells plaat aan de dia en plaats in de montage media. Mount een cochleair beurt per dia om blootstelling aan licht en fotobleken tijdens de beeldvorming proces te voorkomen. </li><li> Gebruik een stereo dissectie microscoop om ervoor te zorgen dat cochleair beurt niet is gevouwen, verdraaid, of in de buurt van een luchtbel. Als een van deze situaties zich voordoet, pincet gebruiken # 4 of # 5 straight juwelier aan het cochleair beurt verplaatsen. </li><li> Plaats een uiteinde van een dekglaasje op het objectglaasje en laten ontsnappen aan het dekglaasje laten vallen. </li><li> Gebruik een stereo dissectie microscoop opdat het cochleair beurt niet gevouwen, verdraaid, of nabij een luchtbel. Als een van deze situaties zich voordoet, beweeg het dekglaasje heen en weer om het cochleair beurt verplaatsen. </li><li> Plaats de glaasjesin een map dia zodat ze plat. Laat de montage media cure O / N bij RT (houden in het donker) </li><li> Afdichting coverslips met duidelijke nagellak en bewaar bij kamertemperatuur of -20 ° C tot afgebeeld. Slides kunnen worden opgeslagen in een map dia of doos. OPMERKING: Dia&#39;s kunnen worden opgeslagen op lange termijn bij -20 ° C of -80 ° C en fluorescentie zal worden gehandhaafd voor enkele maanden. </li><li> Afbeelding dia&#39;s met behulp van een confocale microscoop met de geschikte golflengte op basis van de secundaire antilichamen tijdens de immunokleuring procedure. Helderheid en contrast aanpassingen kunnen worden uitgevoerd via de beeldvormende software van de confocale verkoper. </li></ol>

<ol><li>Robles, L., Ruggero, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanics of the mammalian cochlea.</a> Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).</li>
<li>Ehret, G., Frankenreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitattive+analysis+of+cochlear+structures+in+the+house+mouse+in+relation+to+mechanisms+of+acoustical+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing.</a> J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).</li>
<li>Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+damage+in+the+C57BL%2FCBA+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea.</a> Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).</li>
<li>Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEngstrom%2C+H+%22Structural+pattern+of+the+organ+of+Corti.+A+systematic+mapping+of+sensory+cells+and+neural+elements%22">Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements</a>. , Almqvist and Wiksell. (1966).</li>
<li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Recordings+at+Afferent+Dendrites+Contacting+Cochlear+Inner+Hair+Cells%3A+Monitoring+Multivesicular+Release+at+a+Ribbon+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse.</a> J Vis Exp. (48), e2442(2011).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross%2C+cellular+and+subcellular+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBohne%2C+BA+%22Handbook+of+Mouse+Auditory+Research%22">Handbook of Mouse Auditory Research</a>. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).</li>
<li>Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/">http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/</a> (2015).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+proliferation+of+postmitotic+cochlear+supporting+cells+by+acute+ablation+of+the+retinoblastoma+protein+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice.</a> J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).</li>
<li>Steigelman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystin-1+Is+Required+for+Stereocilia+Structure+But+Not+for+Mechanotransduction+in+Inner+Ear+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells.</a> J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+in+vivo+conversion+of+mouse+cochlear+pillar+and+Deiters%27+cells+to+immature+hair+cells+by+Atoh1+ectopic+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression.</a> J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), e1685(2010).</li>
<li>Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+half+the+hair+cells+in+the+mouse+utricle+first+appear+after+birth%2C+with+significant+numbers+originating+from+early+postnatal+mitotic+production+in+peripheral+and+striolar+growth+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).</li>
<li>Collado, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+postnatal+accumulation+of+junctional+E-cadherin+is+inversely+correlated+with+the+capacity+for+supporting+cells+to+convert+directly+into+sensory+hair+cells+in+mammalian+balance+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs.</a> J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).</li>
<li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li>
<li>Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+dysregulation+in+the+stria+vascularis+of+mice+with+Alport+syndrome%3A+implications+for+capillary+basement+membrane+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology.</a> Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

<html> Er zijn een aantal cruciale stappen voor een succesvolle ganse berg dissectie en immunokleuring. Echter voordat een van deze werkwijzen worden uitgevoerd, wordt goede fixatie van de cochleaire weefsel nodig. We raden het gebruik van methanol vrij, ultra-zuivere, EM leerjaar PFA. PFA uit poeder kan sporen van methanol en een instabiele pH die de kwaliteit van immunofluorescentie afneemt hebben. Andere groepen hebben ook aangetoond dat soortgelijke dissecties mogelijk met fixatieven die geen formaldehyde 14-16<...

De spiraalvormige slakkenhuis van het binnenoor, vervat in de temporale, herbergt het orgaan van Corti, het auditieve sensorische eindorgaan bij zoogdieren. De cochlea is tonotopically georganiseerd en gewoonlijk verdeeld in apicale, midden en basale bochten overeenkomen met verschillende frequentiegebieden met hoogfrequent geluid detectie in de basis en laagfrequente detectie in de apex 1. Haarcellen, de mechanosensorische cellen van het orgaan van Corti, lopen de lengte van het slakkenhuis, dat is ongeveer 6 mm lang in muizen 2,3. Deze cellen zet de mechanische energie van geluidsgolven, die worden uitgezonden via de met vloeistof gevulde membraneuze labyrint, in neurale signalen die worden verwerkt door de centrale auditieve structuren. De hier beschreven techniek verschaft een werkwijze voor het bereiden whole mounts van het orgaan van Corti na verkalking van het slakkenhuis is voltooid (voor monsters die variëren van één week tot volwassenheid). Wij stellen ook een werkwijze voor het immunostaining de hele gemonteerd cochleaire weefsel. Cochleaire whole mounts zijn cruciaal voor visualisatie van haarcellen en omliggende steuncellen in hun natuurlijke ruimtelijke indelingen en maken voor analyse in drie dimensies door het gebruik van confocale microscopie. Drs. Hans Engstrom en Harlow Ades oorspronkelijk beschreven geheel mount cochleair versnijdingsmethode in 1966. Zij gedetailleerd techniek snel oplossen en ontleden verkalkte cochleae ondergedompeld in vloeistof uit verschillende zoogdieren, behoud korte intacte segmenten van het orgaan van Corti voor microscopische analyse 4. De ontleding van een losgemaakte, verkalkte rat cochlea is ook geïllustreerd in een instructievideo 5. Drs. Barbara Bohne en Gary Harding aan de Washington University maakte een aantal belangrijke wijzigingen in deze methode. In hun versie van het cochleair hele berg methode, de temporale bot is ontkalkt, ingebed in kunststof, en vijf halve bochten of tien kwart-bochten waren dissected 6,7. Dr. Charles Liberman en collega&#39;s bij Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Eye en Ear Infirmary, bewerkt deze techniek, zodat plastic inbedding niet verplicht was 8. Verdere modificatie van de techniek zich heeft voorgedaan in het lab Dr Jian Zuo&#39;s in het St. Jude Children&#39;s Research Hospital 9-12 waarin de dissectie methode hier gepresenteerde geïnformeerd. We gebruiken een andere strategie om de toegang tot het orgaan van Corti dan Bohne en Liberman, die isolatie van volledige apicale, midden en basale bochten maakt krijgen. Zo is de ontleed weefsel is groter en minder waarschijnlijk worden verloren of beschadigd tijdens de dissectie of immunokleuring processen. Bovendien vergemakkelijkt de huidige methode van het meten van het apicale of basale uiteinde haak om een ​​frequentiegebied te identificeren. Hoewel veel labs voeren immunokleuring van cochleaire weefsel, het is onduidelijk waar deze methode is ontstaan. Dientengevolge zijn er diverse recepten voor het blokkeren buffers en antilichaam incubatie buffers die de prestaties van individuele primaire antilichamen kunnen beïnvloeden. Hier presenteren we een methode voor immunokleuring met fluorescent gelabelde antilichamen die toepassing meest gebruikte antilichamen in het auditieve veld. De complexe vorm van de cochlea, delicate structuur van het orgaan van Corti, en benige omhulsel vormen een uitdaging voor histologische en biochemische analyse. Verschillende technieken worden momenteel in het gebied gehoor deze moeilijke functies overwinnen en visualiseren van de cellen in het orgaan van Corti, elke techniek met zijn eigen voor- en nadelen. De hier gepresenteerde protocol maakt ganse berg dissectie van de volwassen muis cochlea en met kleine wijziging, potentieel kan worden gebruikt om de kritische structuren binnen het cochleae onderzoeken vanuit verschillende andere modelorganismen gebruikt in het veld.

<table><tbody><tr><td>Standard&nbsp; pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>10.5 cm fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>2 ml microcentrifuge tubes</td><td>MidSci</td><td>AVSS2000</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade</td><td>Polysciences</td><td>18814</td><td>TOXIC -- draag handschoenen en mag niet in de gootsteen worden gedumpt. Kan worden gekocht bij andere verkopers. </td></tr><tr><td>PBS pH 7.4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>end-over-end tube rotator</td><td>Fisher</td><td>05-450-127</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>60 mm petri dish</td><td>Fisher</td><td>50-202-037</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>activated charcoal</td><td>Fisher</td><td>AC134372500</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>stereo dissection microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Dumont #4 jeweler's forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 jeweler's forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mm Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>gebogen&nbsp;</td></tr><tr><td>5 mm Vannas-Tubingen spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>recht</td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Fisher</td><td>08-772-52</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>Fisher</td><td>1256518</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>BSA, fraction V</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Vector labs</td><td>S-1000</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>NHS</td><td>Vector labs</td><td>S-2000</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>3D rotator</td><td>Midsci</td><td>R3D-710</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Western blot incubation box XL</td><td>Licor</td><td>929-97401</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade mounting media</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers, maar mounting medias variëren in hun vermogen om te beschermen tegen fotobleken</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>coverslips 22 x 22 x 1</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>clear nail polish</td><td>Local drug store</td><td></td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>cardboard slide folder</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr><tr><td>plastic slide box</td><td>Fisher</td><td>03-448-10</td><td>kan worden gekocht bij andere verkopers</td></tr></tbody></table>

hele mount dissection en immunofluorescentie van de adult mouse cochlea

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Het orgaan van Corti, gehuisvest in de cochlea van het binnenoor, bevat mechanosensorische haarcellen en omringende ondersteunende cellen die georganiseerd zijn in een spiraalvormige vorm en een tonotopische gradiënt hebben voor geluidsdetectie. De muizencochlea is ongeveer 6 mm lang en wordt vaak verdeeld in drie slagen (apex, midden en basis) voor analyse. Om celverlies, celdeling of mozaïek genexpressie te onderzoeken, is de volledige montage of oppervlaktevoorbereiding van de cochlea nuttig. Deze dissectiemethode maakt visualisatie van alle cellen binnen het orgaan van Corti mogelijk in combinatie met immunokleuring en confocale microscopie om cellen op verschillende vlakken in de z-as te beeld. Meervoudige optische dwarsdoorsneden kunnen ook worden verkregen uit deze z-stack-beelden. Bovendien kan de volledige montage dissectiemethode worden gebruikt voor rasterelektronenmicroscopie, hoewel een andere fixatiemethode nodig is. Hier presenteren we een methode om het orgaan van Corti te isoleren als drie intacte cochleaire slagen (apex, midden en basis). Deze methode kan worden gebruikt voor muizen vanaf één week oud tot volwassenheid en verschilt van de techniek die wordt gebruikt voor neonatale monsters waarbij de calcificatie van de cochlea onvolledig is. Een licht gemodificeerde versie kan worden gebruikt voor de dissectie van de rattencochlea. We demonstreren ook een procedure voor immunokleuring met fluorescent gelabelde antilichamen.

We stellen een werkwijze voor het orgaan van Corti isoleren drie intacte cochleaire windingen (apex, midden en base) vanaf cochleaire weefsel dat verkalkt, met belangrijke dissectie stappen weergegeven in figuur 1. In de eerste postnatale week van ontwikkeling, verkalking van de muis cochlea onvolledig en een eenvoudigere versnijdingsmethode kan worden gebruikt 13. Met behulp van de neonatale hele berg versnijdingsmethode met slakkenhuis van P7 en ouder muizen...

We presenteren een methode om de volwassen orgaan van Corti isoleren drie intacte cochleaire windingen (apex, midden en base). We tonen ook een procedure voor immunokleuring met fluorescent gelabelde antilichamen. Samen technieken maken het bestuderen van haarcellen, steuncellen en andere celtypen in de cochlea.

Hele Mount Dissection en Immunofluorescentie van de Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Het algemene doel van deze whole mount dissectiemethode is om het sensorische gebied van de verkalkte volwassen cochlea te isoleren als drie intacte windingen: de apex, het midden en de basis. Deze dissectiemethode behoudt de driedimensionale structuur van het Corti-orgaan en maakt visualisatie van alle cellen mogelijk wanneer dit wordt gecombineerd met immunovlekking en confocale microscopie om beelden op verschillende vlakken in de Z-as te verkrijgen. In vergelijking met eerdere dissectiemethoden gebruiken we een andere strategie die drie cochleaire windingen oplevert die groter zijn en minder vatbaar zijn voor verlies of beschadiging tijdens het proces van immunovlekking.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de dissectie moeilijk aan te leren is. Omdat het Corti-orgaan fragiel is, is er weinig ruimte voor fouten bij het verwijderen van het spiraalbandje. Nadat het dier volgens de goedgekeurde procedures is geëuthanaseerd en de hersenen zijn verwijderd, begint u met het identificeren van de slaapbeenderen in de basis van de schedel van de muis.Schraap vervolgens de hersenzenuwen weg met standaard pincetten. Plaats de pincet bij de punt van de otische

whole-mount-dissection-immunofluorescence-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een eenvoudige procedure van vibratome snijden het orgaan van Corti, gevolgd door immunohistochemie en confocale microscopie is beschreven. Deze procedure zorgt voor een betere conservering van de fijne cytoarchitecture van de zoogdieren orgaan van Corti, en dus zorgt voor accurate kwantificering van celtypen.

Vibratome Sectioning voor Enhanced Behoud van de Cytoarchitecture van de zoogdieren orgaan van Corti

Primaire cilia beïnvloeden verschillende signaalroutes. De cochlea van zoogdieren is ideaal voor het onderzoeken van planaire celpolariteit (PCP) signalering. Cilia-disfunctie beïnvloedt cochleaire uitgroei, cellulaire patterning en oriëntatie van haarcellen, uitlezingen van PCP. Ons doel is om PCP-signalering in muis cochlea te analyseren via fenotypische analyse, immunohistologie en rasterelektronenmicroscopie.

Evaluatie van Planar-Cell-Polariteit Phenotypes in ciliopathie Mouse Mutant Cochlea

Hier beschrijven we een hoge resolutie geheel-mount beeldvorming methode in de hele volwassen muis oor huid, waarmee we kunnen visualiseren vertakkende genuitdrukking en patronen van perifere zenuwen en bloedvaten, evenals immuun cel distributie.

Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie

Dit manuscript beschrijft een experimenteel protocol voor het evalueren van de morfologische kenmerken en functionele status van het lint synapsen in normale muizen. Het huidige model is ook geschikt voor door lawaai geïnduceerde en leeftijdsgebonden cochlear synaptopathy-beperkte modellen. De correlatieve resultaten van eerdere muizen studies worden ook besproken.

Morfologische en functionele evaluatie van het lint synapsen op specifieke frequentiegebieden van de muis cochlea

Dit artikel presenteert een gemodificeerde cochleaire oppervlakte bereidingsmethode die de decalcificatie en het gebruik van een cel en weefsellijm vereist om de stukjes cochleaire epitheel te hechten aan 10 mm ronde afdek stroken voor immunohistochemie in volwassen muis cochleae.

Cochleaire oppervlakte voorbereiding in de volwassen muis

In deze studie presenteren we een real-time beeldvormingsmethode met confocale microscopie om cellen te observeren die naar beschadigd weefsel bewegen door ex vivo incubatie met het cochleaire epitheel dat het orgaan van Corti bevat.

In vitro time-lapse live-cell imaging om celmigratie naar het orgaan van Corti te verkennen

Een protocol voor het verwerken van jongvolwassen en oud gerbil slakkenhuis door immunolabeling van de afferente synaptische structuren en haarcellen, het blussen van autofluorescentie in verouderd weefsel, het ontleden en schatten van de lengte van het slakkenhuis en het kwantificeren van de synapsen in beeldstapels verkregen met confocale beeldvorming wordt gepresenteerd.

Immunolabeling en counting ribbon synapsen bij jongvolwassen en oude Gerbil Cochleae

Hier presenteren we een protocol voor een muismodel van lawaai-geïnduceerd gehoorverlies (NIHL). Om NIHL te induceren, ontwikkelden we een nieuw en eenvoudig apparaat met golfkarton, een rattenvangkooi en een luidspreker. Auditieve hersenstamrespons en immunofluorescentie beeldvorming werden gebruikt om respectievelijk de gehoorfunctie en de buitenste haarcelbeschadiging te beoordelen.

Gewijzigde experimentele omstandigheden voor lawaai-geïnduceerd gehoorverlies bij muizen en beoordeling van de gehoorfunctie en schade aan de buitenste haarcellen

Er werd een lichtplaatmicroscoop ontwikkeld om het hele slakkenhuis in beeld te brengen en te digitaliseren.

Het verouderende slakkenhuis in beeld brengen met light-sheet fluorescentiemicroscopie

De stria vascularis is van vitaal belang voor het genereren van endocochleair potentieel. Hier presenteren we de dissectie van de volwassen muis stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining.

Dissectie van volwassen muis Stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining

Dit protocol, bedoeld voor beginnende gebruikers van binnenoorweefsel van muizen, beschrijft uitgebreid de stappen voor het verwerken van de binnenoren van muizen in verschillende ontwikkelingsstadia voor sectie-immunokleuring.

Cryosectie en immunokleuring van het binnenoorweefsel van muizen: van embryonale tot volwassen stadia

Leer een betrouwbare methode voor whole mount dissectie van de volwassen muizen-cochlea met behoud van drie intacte windingen. Deze techniek combineert immunofluorescentie en confocale microscopie voor gedetailleerde visualisatie van haarcellen en ondersteunende cellen in het orgaan van Corti.

Hele Mount Dissection en Immunofluorescentie van de Adult Mouse Cochlea

Meer video's verkennen