Name: Fast enzymatische verwerking van eiwitten voor MS Detection met een Flow-through Microreactor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Leer de fabricage van een doorstroom-microreactor voor snelle enzymatische eiwitdigestie met massaspectrometrie. Deze kosteneffectieve methode integreert eenvoudig in microgefabriceerde platforms voor proteomics-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NSF/DBI-1255991-subsidie aan IML.

1. Bereiding van de capillaire Microreactor <ol><li> Snijd de 100 urn inwendige diameter (ID) x 360 urn buitendiameter (OD) capillair met een lengte van 7-8 cm, en 20 urn x 90 urn ID OD capillaire 3-5 cm met de glazen capillair hakmes; controleren onder de microscoop dat beide capillaire uiteinden een schone, rechte snede, zonder uitstekende bramen. </li><li> Plaats de 20 um ID x 90 micrometer OD capillair in een einde van de 100 um ID x 360 urn OD capillair, een lengte van ~ 6 mm; in geval van nood, acht deze operatie onder een microscoop. </li><li> Breng een kleine druppel lijm E6000 rond de kruising van de 90 micrometer OD / 100 um ID capillairen met het uiteinde van een wattenstaafje en laat de lijm cure O / N bij kamertemperatuur. </li><li> Snijd de ingevoegde 20 um ID x 90 urn OD capillair met een lengte van ~ 10-15 mm; dit zal de electrospray ionisatie emitter zijn. </li><li> Pre-snijd de 1/32 &quot;OD PEEK, 1/16&quot; OD PEEK en 1/16 &quot;OD PTFE tubing in stukken van 4-5 cm lang; zullen de hulzen die in capillaire bonden voor het verschaffen van een lekvrije verbinding. </li><li> Sluit het andere uiteinde van de 100 um ID x 360 micrometer OD capillair een PEEK-unie; Gebruik een 1/32 &quot;PEEK huls voor het verschaffen van een lekvrije verbinding. </li><li> Invoegen / draai een stuk van ~ 5 cm lang 1/16 &quot;PTFE slang in de andere kant van de unie. </li><li> Weeg ~ 4 mg C18 (5 pm) deeltjes in een vooraf schoongemaakte / gedroogde 2 ml glazen flesje; Voeg 0,5 ml isopropanol, sluit de flacon en de verspreiding van de slurry in de ultrasonicator bad. </li><li> Terugtrekken met een 250 ul spuit ongeveer 200 ul slurry, steek de naald in de 1/16 &quot;PTFE-buis van de PEEK unie, en afzien langzaam de slurry in de 100 um ID x 360 micrometer OD capillaire; observeren onder de microscoop als capillair gevuld met deeltjes tot een lengte van 2-3 mm verpakking bedraagt, zal de microreactor (figuur 1) de 20 μ.m ID capillaire houdt de deeltjes in de microreactor door een Keystone effect. 15 </li><li> Spoel de microreactor met ~ 50 pi oplossing van H2O / CH3CN 50:50 v / v, en daarna met ~ 50 pi oplossing van H2O / CH3CN 98: 2 v / v. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Sample Solutions Opmerking: Bewerkingen die gepaard gaan hanteren van organische oplosmiddelen en zuren en oplossing voorbereiding moeten worden uitgevoerd in een zuurkast. Draag een veiligheidsbril, handschoenen en beschermende kleding. <ol><li> Spoelen met CH3OH en drogen enkele glazen flacons (4 ml) en polypropyleen buizen (15 ml). </li><li> Bereid 10 ml van een oplossing van H2O / CH3CN (98: 2 v / v) in een 15 ml polypropyleen buis door mengen van 9,8 ml H2O met 200 pl CH3CN; meng door sonicatie. </li><li> Bereid 10 ml van een oplossing van H2O / CH3CN (50:50 v / v) in een 15 ml polypropyleen buis door 5 ml H 2 &lt;/ sub&gt; O met 5 ml CH3CN; meng door sonicatie. </li><li> Bereid 4 ml van een aangezuurde waterige oplossing (/ v TFA 0,01% v) door toevoeging van 4 pl TFA (10%) aan 4 ml H2O / CH3CN (98: 2 v / v) in een 4 ml glazen flesje; meng door sonicatie. </li><li> Bereid 4 ml van een aangezuurde organische oplossing (/ v TFA 0,01% v) door toevoeging van 4 pl TFA (10%) aan 4 ml H2O / CH3CN (50:50 v / v) in een 4 ml glazen flesje; meng door sonicatie. </li><li> Weeg 16 mg NH 4 HCO 3 een analytische microbalans in een 4 ml glazen flesje; Voeg 4 ml H2O / CH3CN: oplossing (98 2 v / v) en dispergeren door sonicatie; Dit resulteert in een 50 mM oplossing van NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) in waterige buffer. </li><li> Weeg 5 mg van een standaard eiwit (bijvoorbeeld runderserumalbumine, hemoglobine α / β, cytochroom C, koolzuuranhydrase, α-2-HS-glycoproteine, etc.) met een analytische microbalans in een 4 ml glazen flesje; voeg 4 ml DI water en verspreiden door sonicatie; Dit resulteert meestal in een high-level uM concentratie oplossing. </li><li> Bereid 1 ml eiwitoplossing (1-2 uM) door verdunning van het hoge niveau uM concentratie oplossing met een geschikt volume NH 4 HCO 3 (50 mM) waterige buffer; meng door sonicatie. </li><li> Bereid de trypsine-oplossing (5 uM) door oplossen van 20 g sequencing-grade trypsine in 170 gl NH 4 HCO 3 (50 mM) waterige buffer; verspreiden door sonicatie. </li></ol> 3. Experimentele Setup Noot: De LTQ-MS systeem is uitgerust met een aangepaste ESI bron die een zelfgebouwde XYZ-fase die maakt koppeling van de massaspectrometer verschillende voorbeeldinvoer benaderingen omvat. <ol><li> Koppel de capillaire microreactor van het PEEK Unie en aan te sluiten op de PEEK-stuk. </li><li> Plaats een ~ 2 cm lang Pt draad in de zijarm van de PEEK-stuk; Gebruik een 1/32 &quot;PEEK sleeve voor het verstrekken van eenlekvrije verbinding en voor de isolatie van de draad Pt. </li><li> Sluit een 50 um ID x 360 micrometer OD (~ 0,5 m lang) sample overdracht capillair naar de andere kant van de PEEK-stuk; Gebruik een 1/32 &quot;PEEK huls voor het verschaffen van een lekvrije verbinding. </li><li> Zet de PEEK-stuk van de XYZ-podium en de positie van de ESI emitter ~ 2 mm afstand van de massaspectrometer inlaat capillair. </li><li> Sluit de Pt draad aan op de ESI voedingsbron van de massaspectrometer. </li><li> Sluit het andere uiteinde van de monsteroverdrachtsstrook capillair aan de roestvrij stalen eenheid; Gebruik een 1/16 &quot;PEEK huls voor het verschaffen van een lekvrije verbinding. </li><li> Sluit een 4-5 cm lange 1/16 &quot;PTFE slang aan het andere uiteinde van de roestvrijstalen eenheid en plaats de 250 ul spuitnaald in de PTFE-buis, zet de pomp en stellen de stroomsnelheid op de gewenste waarde (bijvoorbeeld 2 pl / min). </li><li> Input tandem MS data-acquisitie parameters in het softwarepakket dat de MS instrument een bestuurtd opslaan als een methode bestand klaar de opstelling voor het uitvoeren van de analyse; voor de LTQ-MS-systeem, gebruikt u de volgende gegevens afhankelijke analyse parameters: dynamische uitsluiting ingeschakeld voor 180 sec met uitsluiting massa breedte ± 1,5 m / z; een MS scan gevolgd door een zoom en MS 2 scans op de top 5 meest intense pieken, zoom scan breedte ± 5 m / z; botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) parameters ingesteld op isolatie breedte 3 m / z, genormaliseerd botsingsenergie 35%, activering Q 0,25, en activering tijd 30 ms. </li></ol> 4. microfluïdische Setup <ol><li> Bereid een microfluïdische apparaat uit glas of polymere substraten, 16-18 de indeling van de inrichting wordt in figuur 2A, bestaande uit een microreactor (1) (0,13 mm breedte x 2 mm lengte x 50 pm diep) is verbonden met een inlaat (2 ), uitlaat (3) en een zijpoort (4); de onderling verbonden kanalen voor fluïde manipulaties zijn ~110 micrometer breed en ~ 50 micrometer diep; een meerkanaals structuur (5), bestaande uit ~ 1,5-2 urn diep x 10 micrometer x 100 micrometer breed lange microkanalen geplaatst 25 urn uit elkaar, zal fungeren als een filter voor het vasthouden van de deeltjes in de microreactor. </li><li> Inschakelen fluïdum leverende verbindingen met de chip door lijmen gespecialiseerde aan op de inlaatpoorten, of door het ontwerpen van een polymeer stand het beslag past voor vloeistofafgifte (figuur 2B). 16 </li><li> Maak een suspensie van deeltjes C18 (5 pm) zoals beschreven in stap 1.8; leveren de slurry aan de microreactor met een spuit met 1/16 &quot;PTFE slang verbonden met de chip zijpoort (4), sluit de poort na deeltjesbelading met epoxylijm en genezing van 1 uur in een oven bij 90 ° C 16. </li><li> Plaats een capillair (20 um ID x 90 micrometer OD x 10 mm lengte) in de uitlaatpoort, afdichting met E6000 lijm, en genees O / N; dit zal de ESI zender geworden ( <strong&gt; 6). </li><li> Sluit een 50 um ID x 360 micrometer OD (~ 0,5 m lang) sample overdracht capillair aan de chip inlaatpoort (2); Sluit het andere uiteinde van de capillair een 250 ul en de naald pomp zoals beschreven in 3,6-3,7. </li><li> Plaats een lichtgewicht PEEK-stuk-connector op het monster overdracht lijn vlak voor de inlaat (2) en plaats een Pt draad op de zijarm van het stuk, zoals beschreven in 3.2; Dit zal de ESI elektrode. </li><li> Beveilig de microfluïdische apparaat op de XYZ podium met de ESI emitter geplaatst ~ 2 mm afstand van de massaspectrometer inlaat capillaire; bereiden MS als beschreven onder 3.8. </li></ol> 5. Sample laden, proteolytische digestie en Elution voor MS Analysis Opmerking: Alle oplossing / monsteroverdrachtsstrook stappen worden uitgevoerd met behulp van een spuitpomp en moeten een paar extra minuten in beslag, ter compensatie van de dode volumes verbonden aan de transportlijnen en naar de microreactor; de nodige tijd hangt af van de stroomsnelheden betrokken. <ol><li> Spoel de microreactor en voor te bereiden voor analyse door infusie van een waterige oplossing van NH 4 HCO 3 (50 mM) in H2O / CH3CN (98: / v 2 v) en 2 pl / min gedurende 5 min; Gebruik een 250 ul injectiespuit. </li><li> Laad het eiwitmonster (1 uM) aan de microreactor door het inbrengen van de monsteroplossing in 2 pl / min gedurende 5 min; Gebruik een 250 ul injectiespuit. </li><li> Infuseren de trypsine-oplossing (5 uM) via geadsorbeerde eiwit op de microreactor bij 2 pl / min gedurende 1-3 min. </li><li> Quench de proteolytische vertering door spoelen van de microreactor met een aangezuurde waterige oplossing van TFA (0,01% v / v) in H2O / CH3CN (98: 2 v / v) en 2 pl / min gedurende 5 min; Gebruik een 250 ul injectiespuit. </li><li> Start elueren van het eiwit verteren van de microreactor door het inbrengen van een aangezuurde organische oplossing van TFA (0,01%v / v) in H2O / CH3CN (50:50 v / v) en 300 nl / min. </li><li> Schakel de MS data-acquisitie-proces en de ESI spanning (~ 2000 V); verwerven MS-gegevens met behulp van de data-acquisitie parameters verschaft in stap 3.8; let op de elutie van de tryptische peptiden. </li></ol> 6. Data Processing <ol><li> Verwerk de tandem MS-gegevens met een zoekmachine verenigbaar is met de rauwe MS dataformaat. <ol><li> Verwerk de LTQ-MS Raw-bestanden met behulp van een organisme specifieke minimaal redundant eiwit databank; uploaden van de ruwe data in de zoekmachine, stelt de toleranties massa ouder en fragment ion tot en met 2 en 1 Da respectievelijk, en gebruik alleen volledig tryptische fragmenten met maximaal twee gemiste splitsingen voor de zoektocht; laten geen posttranslationele modificaties; Stel de hoge en middelhoge vertrouwen valse discovery tarieven (FDR) tot 1% en 3%, respectievelijk, en houden geen rekening met posttranslationele modificaties. </li></ol></li><li> Filter de gegevens alleen met veel vertrouwen te selecterenpeptide past bij de eiwitten in de databank; evalueren van de eiwit- en peptide-level resultaten. </li></ol>

<ol><li>Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetersen%2C+DH+%22Encyclopedia+of+Microfluidics+and+Nanofluidics%22">Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics</a>. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).</li>
<li>Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+applications+of+immobilized+microfluidic+enzymatic+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Technol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors.</a> J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).</li>
<li>Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+enzymatic+reactors+for+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidic enzymatic reactors for proteome research.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).</li>
<li>Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping%3A+strategy%2C+characterization%2C+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22LabChip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance.</a> LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).</li>
<li>Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchip-based+proteolytic+digestion+system+driven+by+electroosmotic+pumping%5BTitle%5D)+AND+%22LabChip%22%5BJournal%5D)">A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping.</a> LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).</li>
<li>Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-immobilized+microfluidic+process+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Enzyme-immobilized microfluidic process reactors.</a> Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).</li>
<li>Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).</li>
<li>Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+microfluidic+enzyme+reactor+utilizing+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads.</a> Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).</li>
<li>Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticle+assembly+microfluidic+reactor+for+efficient+on-line+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).</li>
<li>Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titania+and+alumina+sol-gel-derived+microfluidics+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping%3A+design%2C+characterization%2C+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance.</a> J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).</li>
<li>Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+protein+digestion+through+the+confinement+of+nanozeolite-assembled+microchip+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors.</a> Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).</li>
<li>Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+enzyme+reactor+and+high+resolving+chromatography+in+%26%2334%3Bsub-chip%26%2334%3B+dimensions+for+sensitive+protein+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in &#34;sub-chip&#34; dimensions for sensitive protein mass spectrometry.</a> Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).</li>
<li>Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-enhanced+enzyme+reaction+for+protein+mapping+by+mass+spectrometry%3A+A+new+approach+to+protein+digestion+in+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes.</a> Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).</li>
<li>Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-assisted+sample+preparation+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis.</a> Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).</li>
<li>Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tapers+and+restrictors+for+capillary+electrochromatography+and+capillary+electrochromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).</li>
<li>Lazar, I. M., Kabulski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+LC+Device+with+Orthogonal+Sample+Extraction+for+On-Chip+MALDI-MS+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection.</a> Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).</li>
<li>Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+and+sample+injection+systems+on+a+planar+glass+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip.</a> Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).</li>
<li>Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Injection+Schemes+and+Column+Geometry+on+the+Performance+of+Microchip+Electrophoresis+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices.</a> Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).</li>
<li>Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Proteomic+Protocol+for+Biomarker+Fingerprinting+in+Cancerous+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).</li>
<li>Doucette, A., Craft, D., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometric+Study+of+the+Effects+of+Hydrophobic+Surface+Chemistry+and+Morphology+on+the+Digestion+of+Surface-Bound+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).</li>
<li>Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Liquid+Chromatography+System+for+Proteomic+Applications+and+Biomarker+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening.</a> Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).</li>
<li>Lazar, I. M., Karger, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Open-Channel+Electroosmotic+Pumping+System+for+Microfluidic+Sample+Handling%2C%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,&#34.</a> Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).</li>
<li>Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+TOFMS+Detection+for+Capillary+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis.</a> Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

De in dit werk beschreven microreactor biedt een eenvoudig te implementeren experimentele opstelling voor het uitvoeren van enzymatische vertering van eiwitten MS analyse en identificatie in minder dan 30 minuten mogelijk. De duidelijke voordelen van dit systeem, in vergelijking met conventionele methoden, onder meer eenvoud, snelheid, laag reagensverbruik en lage kosten. In het bijzonder is er geen dure geïmmobiliseerd trypsine kralen en patronen. De bereiding van de capillaire microreactor is eenvoudig (figuur...

De identificatie en karakterisering van gezuiverde eiwitten wordt vaak bereikt door MS technieken. Het eiwit wordt geknipt met een enzym en de peptiden worden verder geanalyseerd door MS via een eenvoudige infusie experimentele opstelling. Proteolytische digestie noodzakelijk voor het genereren van kleine peptidefragmenten die in de nuttige massabereik meeste MS analyzers vallen, en die gemakkelijk worden gefragmenteerd door lage botsenergie fragmentatie te aminozuursequentie informatie te genereren. Voor geïsoleerde eiwitten of eiwitmengsels eenvoudig, er geen verdere behoefte voor chromatografische scheiding van peptiden voorafgaand aan MS detectie. Een mengsel van 25-50 peptiden kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd door het inbrengen van het monster met een spuitpomp direct in het MS ionenbron. De massaspectrometer kan de analyse uit te voeren en bevestig de sequentie van een eiwit binnen een kort tijdsbestek. Met moderne data-acquisitie methoden, kan dit proces worden bereikt wedurende enkele minuten of zelfs seconden. De beperkende factor bij het voltooien van het hele proces op een korte tijdschaal is de proteolytische vertering stap. Dit wordt typisch uitgevoerd gedurende enkele uren (of O / N) in oplossing bij 37 ° C met behulp van substraat: enzym verhoudingen van (50-100): 1. De enzymatische digestie tijd om minuten of seconden, geïmmobiliseerd enzym microreactoren Gewoonlijk verminderen, in de vorm van microfluïdische reactoren of commercieel verkrijgbaar cartridges, zijn beschreven. 1-6, wordt het enzym geïmmobiliseerd door covalente, niet-covalente / fysische adsorptie, complex formatie of inkapseling, 3,6 verhoogde de efficiëntie van het enzymatisch proces wordt mogelijk gemaakt door het grote oppervlak-tot-volume en enzym tot substraat verhouding. Bijkomende voordelen van geïmmobiliseerde reactoren onder verminderde autolyse en interferentie van het enzym in MS analyse verbeterde enzymstabiliteit en herbruikbaarheid. Een verscheidenheid van benaderingen, zoals glas of polymere microgefabriceerde inrichtingen zijn beschreven,gebruik enzymen geïmmobiliseerd op magnetische beads met antilichaam-antigen interacties 7,8 ingevangen in goud nanodeeltjes netwerken, 9 ingekapseld in titania-alumina sol-gels 10 en nanozeolites, 11 of gevangen met Ni-NTA en His-Tag complexvorming. 6 Alternatief , open buisvormige capillairen met geïmmobiliseerde enzymen zijn ontwikkeld en. 12 Bovendien verbeterde proteolytische splitsing werd aangetoond met gecontroleerde microgolfbestraling 13 of drukondersteunde of drukwisselingen technologie (PCT) om het reactietijden 30-120 min. 14 Ondanks de vele voordelen van geïmmobiliseerde enzym reactoren, de kosten voor commerciële cartridges is hoog, de beschikbaarheid van microfluïdische inrichtingen voor routinegebruik beperkt en het gebruik van microgolf of PCT technieken leidt tot behoefte aan extra apparatuur. Het doel van dit werk was om een ​​methode te ontwikkelen die circumvents deze nadelen en die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd in elk laboratorium onderzoekers machtigen met een eenvoudige en doeltreffende benadering voor het uitvoeren van enzymatische splitsing van eiwitten ter voorbereiding MS analyse binnen minuten. De benadering is gebaseerd op het gebruik van hydrofobe, C18-deeltjes die vooraf geïnstalleerd op een capillair of microfluïdische apparaat en de adsorptie van het eiwit (ten) van belang op deze deeltjes, gevolgd door enzymatische digestie tijdens de infusie van het enzym via gepakt bed en veroverde eiwit (s). In deze benadering wordt het substraat geïmmobiliseerd door niet-covalente interacties, en het enzym wordt toegediend via geïmmobiliseerde eiwit. De proteolytische digestie efficiëntie verhoogd met het grote deeltjesoppervlak gebieden die het eiwit enzymatische verwerking, verminderde afstanden en diffusie tijden en naar het oppervlak van de deeltjes bloot te leggen, verbeterde massaoverdracht, geen covalente binding die de activiteit van het enzym beïnvloeden, vermogen om snel evaluate combinaties van verschillende enzymen, disposability en multiplexing als het proces wordt uitgevoerd in een microfluïdische formaat. Deze aanpak wordt gedemonstreerd met behulp van een mengsel van standaard eiwitten en trypsine-de meest gebruikte enzym proteolytische digestie voorafgaand aan ESI-MS detectie. De massaspectrometer gebruikt voor detectie in deze studie was een lineair trap quadrupole (LTQ) instrument.

<table><tbody><tr><td>Ion trap ESI-MS</td><td>Thermo Electron</td><td>LTQ</td><td>De LTQ massaspectrometer wordt gebruikt voor het verkrijgen van tandem MS-gegevens</td></tr><tr><td>XYZ stage</td><td>Newport</td><td>Meerdere onderdelen</td><td>De zelfgebouwde XYZ stage wordt gebruikt om de commerciële LTQ nano-ESI bron aan te passen om invoer van verschillende sample-leveringssystemen te ontvangen</td></tr><tr><td>Stereo microscoop</td><td>Edmund optics</td><td>G81-278</td><td>De microscoop wordt gebruikt om het microreactor-vulproces te observeren</td></tr><tr><td>Analytische weegschaal/Metler</td><td>VWR</td><td>46600-204</td><td>De weegschaal wordt gebruikt om de eiwitsamples te wegen</td></tr><tr><td>Ultrasoon bad/Branson</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>Het sonische bad wordt gebruikt voor het mengen/homogeniseren van de samples en het verspreiden van de C18 deeltjesslurry</td></tr><tr><td>Spuitpomp 22</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552222</td><td>De micropomp wordt gebruikt voor het laden, spoelen en elueren van de sample en het enzym op en van de gevulde capillaire microreactor</td></tr><tr><td>Milli-Q ultrapuur watersysteem</td><td>EMD Millipore</td><td>ZD5311595&nbsp;</td><td>Het MilliQ watersysteem wordt gebruikt om gezuiverde DI water te bereiden</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (1.000&nbsp;&micro;l)</td><td>VWR</td><td>53513-410</td><td>De pipettor wordt gebruikt om kleine volumes van sampleoplossingen te meten</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (100&nbsp;&micro;l)</td><td>VWR</td><td>53513-406</td><td>De pipettor wordt gebruikt om kleine volumes van sampleoplossingen te meten</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (10&nbsp;&micro;l)</td><td>VWR</td><td>53513-402</td><td>De pipettor wordt gebruikt om kleine volumes van sampleoplossingen te meten</td></tr><tr><td>Gesmolten silica capillair (100 &micro;m ID x 360 &micro;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>Deze capillair wordt gebruikt voor de fabricage van de microreactor</td></tr><tr><td>Gesmolten silica capillair (20&nbsp;&micro;m ID x 100 &micro;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP020090</td><td>Deze capillair wordt gebruikt voor de fabricage van de ESI emitter</td></tr><tr><td>Gesmolten silica capillair (50&nbsp;&micro;m ID x 360 &micro;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>Deze capillair wordt gebruikt om de samples en het eluent van de spuitpomp naar de capillaire microreactor over te brengen</td></tr><tr><td>Glas capillair splijtwerktuig</td><td>Supelco</td><td>23740-U</td><td>Dit is een gereedschap voor het snijden van gesmolten silica capillairen op de gewenste lengte</td></tr><tr><td>Lijm</td><td>Eclectic Products</td><td>E6000 Craft</td><td>Deze lijm wordt gebruikt voor het bevestigen van de ESI emitter in de capillaire microreactor of de microfluïdische chip</td></tr><tr><td>Epoxy lijm</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td><td>Deze lijm wordt gebruikt om het microfluïdische inlaatgat te verzegelen waardoor de C18 deeltjes worden geladen</td></tr><tr><td>Omgekeerde fase C18 deeltjes (5&nbsp;&micro;m)</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>Dit zijn C18 deeltjes waarop de eiwitten worden geadsorbeerd; de deeltjes zijn geëxtraheerd uit een 4&nbsp;mm x 20 cm C18 LC kolom van Agilent</td></tr><tr><td>Spuit/glas (250 &micro;l)</td><td>Hamilton</td><td>81130-1725RN</td><td>De glazen spuiten worden gebruikt om de C18 deeltjesslurry in de capillaire microreactor te laden en om de sample en eluenten naar de microreactor te brengen</td></tr><tr><td>Interne reducerende PEEK Unie (1/16&rdquo; tot 1/32&rdquo;)</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>Deze unie wordt gebruikt om de 250 &micro;l spuit aan de microreactor te verbinden voor het laden van de 5 &micro;m deeltjesslurry</td></tr><tr><td>Roestvrij stalen unie (1/16&rdquo;)</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>De roestvrij stalen unie wordt gebruikt om de glasnaald van de spuit aan de infusie capillair te verbinden</td></tr><tr><td>Microvolume PEEK Tee connector (1/32&rdquo;)</td><td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>De Peek tee wordt gebruikt om de sampletransfer capillair aan de capillaire microreactor te verbinden; op zijn zijarm maakt het de invoer van de Pt draad mogelijk</td></tr><tr><td>Tee connector (lichtgewicht)</td><td>Valco</td><td>C-NTXFPK</td><td>Deze Tee connector wordt gebruikt om ESI-spanning op de microfluïdische chip toe te passen via de sampletransfer lijn</td></tr><tr><td>Pt draad (0.404 mm)</td><td>VWR</td><td>66260-126</td><td>De Pt draad zorgt voor elektrische verbinding voor ESI generatie en is verbonden met de ESI voeding van de massaspectrometer</td></tr><tr><td>PTFE buis (1/16&rdquo; OD)</td><td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>De Teflon buis wordt gebruikt om een luchtdichte verbinding tussen de spuitnaald en de roestvrij stalen unie mogelijk te maken&nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK buis (0.015&rdquo; ID x 1/16&rdquo; OD)</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>De Peek buis wordt gebruikt als hoes om een luchtdichte verbinding tussen de roestvrij stalen unie en de 50&nbsp;&micro;m ID transfer capillair mogelijk te maken</td></tr><tr><td>PEEK buis (0.015&rdquo; ID x 1/32&rdquo; OD)</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>De Peek buis wordt gebruikt als hoes om een lek-vrije verbinding tussen de gesmolten silica capillairen en de Peek Tee mogelijk te maken</td></tr><tr><td>Polimeer buis snijder</td><td>Valco</td><td>JR-797</td><td>Deze snijder wordt gebruikt om de 1/16&rdquo; en 1/32&rsquo; Peek polimeer buis die als hoes voor lek-vrije verbindingen wordt gebruikt in stukken van ~4-5 cm lengte voor te snijden</td></tr><tr><td>Bernstein vial (2 ml)</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>HP-5183-2069</td><td>De vialen worden gebruikt om sampleoplossingen en de C18 deeltjesslurry te bereiden&nbsp;</td></tr><tr><td>Bernstein vial (4 ml)</td><td>VWR</td><td>66011-948</td><td>De vialen worden gebruikt om sampleoplossingen te bereiden</td></tr><tr><td>Polypropyleen buis (15&nbsp;ml)</td><td>Fisher</td><td>12-565-286D</td><td>De vialen worden gebruikt om bufferoplossingen

fast enzymatische verwerking van eiwitten voor ms detection met een flow-through microreactor

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

De overgrote meerderheid van massaspectrometrie (MS) -gebaseerde eiwitanalyse werkwijzen omvatten een enzymatische digestie stap voorafgaand aan detectie, typisch met trypsine. Deze stap is noodzakelijk voor het genereren van kleine moleculaire gewicht peptides, doorgaans MW &lt;3000-4000 Da, dat binnen het effectieve scanbereik van massaspectrometrie instrumenten vallen. Gebruikelijke protocollen betrekking O / N enzymatische digestie op 37 ° C. Recente ontwikkelingen hebben geleid tot de ontwikkeling van verschillende strategieën, gewoonlijk met het gebruik van een microreactor met geïmmobiliseerde enzymen of een reeks aanvullende fysische processen die de tijd die voor proteolytische digestie reduceren tot een paar minuten (bijvoorbeeld magnetron of high- druk). In dit werk beschrijven we een eenvoudige en rendabele benadering die in elk laboratorium kan worden toegepast voor het bereiken van snelle enzymatische vertering van een proteïne. Het eiwit (of eiwit mengsel) wordt geadsorbeerd op C18-gebonden omgekeerde fase performance vloeistofchromatografie (HPLC) silicadeeltjes voorgeladen in een capillaire kolom en trypsine in waterige buffer wordt toegediend gedurende de deeltjes gedurende korte tijd. Om on-line MS detectie mogelijk te maken, worden de tryptische peptiden geëlueerd met een oplosmiddel systeem met een verhoogd gehalte aan organisch materiaal direct in het MS ionenbron. Deze aanpak vermijdt het gebruik van dure geïmmobiliseerde enzymdeeltjes en vereist niet geen steun voor voltooiing van het proces. Eiwitvertering en volledige monsteranalyse kan worden uitgevoerd in minder dan 3 min ~ en ~ 30 min, respectievelijk.

Een representatief resultaat van een proteolytische digestie proces gelijktijdig uitgevoerd op een mengsel van eiwitten, met de hierboven beschreven microreactoren (figuren 1 of 2), is opgenomen in tabel 1. De tabel omvat de unieke peptidesequenties die een bepaald eiwit te identificeren, het kruis correlatie score (Xcorr) (dat wil zeggen, een score die de kwaliteit van de experimentele-to-theoretische match voor de overeenkomstige tandem massas...

Een snel protocol voor proteolytische vertering met een zelfgebouwde flow-through tryptische microreactor gekoppeld aan een elektrospray-ionisatie (ESI) massaspectrometer wordt gepresenteerd. De fabricage van de microreactor, de experimentele opstelling en het proces voor gegevensverzameling worden beschreven.

Fast enzymatische verwerking van eiwitten voor MS Detection met een Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Het algemene doel van dit protocol is het beschrijven van de fabricage van een flow-through tryptische microreactor die een snelle enzymatische digestie van eiwitten uitvoert om eiwitidentificatie met een massaspectrometer met elektrospray-ionisatie mogelijk te maken. De methode kan helpen bij het in kaart brengen van de aminozuurvolgorde van geïsoleerde en gezuiverde eiwitten ter ondersteuning van de verdere karakterisering van structuur en functie. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het snel en kosteneffectief is, en zich leent voor integratie in workflows die gebruikmaken van microgefabriceerde platforms.Gebruik eerst een glazen capillairbreker om de grotere glazen capillairbuis op een lengte van zeven tot acht centimeter af te snijden, en de kleinere op een lengte van drie tot vijf centimeter. Gebruik een microscoop om te controleren of beide capillaire uiteinden een schone, rechte snede hebben, zonder uitstekende braampjes. Schuif de kleinere capillair ongeveer zes millimeter in één uiteinde van de grotere.Gebruik vervolgens een wattenstaafje om een kleine druppel lijm aan te brengen rond de verbinding van de capillairen en laat de lijm een nacht uitharden bij kamertemperatuur. Knip daarna de ingevoerde capillair af tot een lengte van ongeveer 10 tot 15 millimeter. Dit uiteinde zal dienen als de emitter voor electrospray-ionisatie.Steek het andere uiteinde van de capillair met de grotere diameter in een PEEK-buis van 1/32 inch die vooraf is afgesneden op een lengte tussen de vier en vijf centimeter en is verbonden met een PEEK-koppeling. Steek vervolgens het vijf centimeter lange stuk 1/16 PTFE-buis in het tegenovergestelde uiteinde van de koppeling en draai dit vast. Weeg in een schoon, droog glazen vial van twee milliliter vier milligram C18-deeltjes af en voeg vervolgens 0,5 milliliters isopropanol toe.Sluit het flacon. Plaats deze in een ultrasoonbad en soniceer om de deeltjes gelijkmatig in de oplossing te dispergeren. Gebruik vervolgens een spuit van 250 µL om 200 µL van de C18-suspensie op te zuigen.Plaats de spuit in de 1/16-inch PTFE-buis en breng de slurry langzaam over in de grote capillair. Observeer onder de microscoop hoe de capillair zich vult met deeltjes, totdat een pakking van twee tot drie millimeter is bereikt. De kleinere capillairbuis houdt deze deeltjes in de microreactor vast door middel van een keystone-effect.Spoel tot slot de microreactor met 50 µL van een 50-op-50 oplossing van water en acetonitril, gevolgd door 50 µL van een oplossing bestaande uit 49 µL water gemengd met 1 µL acetonitril. Koppel de capillaire microreactor los van de PEEK-koppeling en sluit deze aan op een PEEK-Tstuk. Voer vervolgens een tweedimensionale platina draad van twee centimeter lang, geïsoleerd met een PEEK-huls van 1/32 inch voor een lekvrije verbinding, in de zijarm van het PEEK-Tstuk in.Sluit een monsteroverdrachtcapillair van een halve meter lang aan op het tegenovergestelde uiteinde van de PEEK-T. Gebruik een PEEK-huls van 1/32-inch om een lekvrije verbinding te verkrijgen. Bevestig de PEEK-T op de XYZ-tafel.Plaats de emitter voor electrospray-ionisatie ongeveer twee millimeter van de inlaatcapillair van de massaspectrometer. Sluit vervolgens de platina draad aan op de stroombron voor electrospray-ionisatie van de massaspectrometer. Sluit daarnaast het andere uiteinde van de capillair voor monstertransport aan op de roestvrijstalen koppeling, waarbij een PEEK-huls van 1/16-inch wordt gebruikt om een lekvrije verbinding te garanderen.Sluit vervolgens een stuk PTFE-buis van 1/16 inch met een lengte van vier tot vijf centimeter aan op het tegenovergestelde uiteinde van de roestvrijstalen koppeling. Voer de parameters voor de tandem MS-data-acquisitie, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, in het softwarepakket in dat het MS-instrument aanstuurt. Sla deze op als een methodebestand om de opstelling gereed te maken voor het uitvoeren van de analyse.Het LTQ MS-systeem is uitgerust met een aangepaste ESI-bron die een zelfgebouwde XYZ-tafel bevat, waardoor de massaspectrometer kan worden gekoppeld aan verschillende methoden voor monsterinvoer. Vul een spuit van 250 µL met een waterige oplossing van 50 mM bicarbonaat opgelost in 2% acetonitril. Sluit de spuit vervolgens aan op de microreactor en plaats deze onder de spuitpomp.Spoel de microreactor met twee microliter per minuut gedurende vijf minuten om deze voor te bereiden op analyse. Laad vervolgens het eiwitmonster van belang in een spuit van 250 microliter en infuseer de monsteroplossing met twee microliter per minuut gedurende vijf minuten. Plaats daarna een spuit van 250 microliter, gevuld met een vijf micromolaire trypsine-oplossing, onder de spuitpomp en infuseer deze over het geabsorbeerde eiwit op de microreactor met twee microliter per minuut gedurende één tot drie minuten.Het is van cruciaal belang dat de trypsine-oplossing voor elk experiment vers wordt ontdooid en klaargemaakt. Dit waarborgt dat het proteolytische enzym zijn activiteit behoudt en dat de operationele pH van de microreactor rond de 8 blijft. Vul een andere spuit van 250 µL met een waterige oplossing bestaande uit 0%1% trifluorazijnzuur toegevoegd aan 2% acetonitril.Gebruik deze oplossing om het proteolytische digestieproces te stoppen door de microreactor gedurende vijf minuten te spoelen met twee microliters per minuut. Schakel vervolgens over naar een spuit gevuld met 0,1% trifluorazijnzuur toegevoegd aan 50% acetonitril, en schakel het MS-gegevensacquisitieproces in bij een electrospray-ionisatiespanning van ongeveer 2000 volt. Gebruik de aangezuurde oplossing om de proteïne-digest uit de microreactor te elueren met 300 nanoliters per minuut gedurende 20 tot 30 minuten.Verwerf massaspectrometriegegevens met behulp van de parameters voor gegevensverwerving die worden vermeld in het bijbehorende tekstprotocol. Verwerk de LTQ MS raw-bestanden met een minimaal redundante proteïnedatabase door eerst de raw-gegevens in de zoekmachine te uploaden. Stel vervolgens de massatoleranties voor het ouder-ion en het fragment-ion respectievelijk in op twee en één dalton, en gebruik voor de zoekopdracht uitsluitend volledig tryptische fragmenten met maximaal twee gemiste splitsingen.Stel daarnaast de false discovery rates voor hoge en medium betrouwbaarheid in op respectievelijk 1% en 3%, en sta geen post-translationele modificaties toe, tenzij er specifiek wordt gezocht naar bepaalde modificaties. Filter ten slotte de gegevens om alleen de peptide-matches met hoge betrouwbaarheid te selecteren. Hier wordt een massaspectrum getoond dat bestaat uit tryptische peptiden die zijn gegenereerd uit een eiwitmengsel dat proteolyse in de microreactor heeft ondergaan.Deze labels vertegenwoordigen de meest intense tryptische peptide-ionen en vermelden hun sequentie en de corresponderende proteïne-identificatie. Deze microreactor biedt een eenvoudig te implementeren experimentele opstelling voor het uitvoeren van enzymatische digestie van proteïnen en maakt massa-analyse en identificatie mogelijk in minder dan 30 minuten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het behouden van de reinheid van de vials en instrumentatie die in contact komen met oplossingen cruciaal is om monstercontaminatie te voorkomen.Na deze procedure kunnen andere methoden voor massaspectrometrische gegevensverwerving worden gebruikt om een betere karakterisering van de generatieve peptiden mogelijk te maken en aanvullende vragen over de structuur van eiwitten te beantwoorden. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de proteomics om snellere protocollen voor de analyse van eiwitten te ontwikkelen en de ontwikkeling van nieuwe microfalytische platforms te verkennen die high-throughput analyse van biologische monsters mogelijk maken. Deze techniek is beperkt tot de analyse van relatief eenvoudige eiwitmengsels die 25 tot 50 peptiden genereren.Deze peptiden kunnen worden geanalyseerd via eenvoudige infusie-experimenten en vereisen geen vloeistofchromatografische scheiding voorafgaand aan de MS-analyse. Vergeet niet dat het werken met organische oplosmiddelen uiterst gevaarlijk kan zijn; neem daarom altijd voorzorgsmaatregelen, zoals het vermijden van open vuur, tijdens het uitvoeren van deze procedure.

fast-enzymatic-processing-proteins-for-ms-detection-with-flow-through

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Digitale Microfluidics is een techniek die gekenmerkt wordt door de manipulatie van discrete druppels (~ nL - ml) op een reeks van elektroden door de toepassing van elektrische velden. Het is goed geschikt voor het uitvoeren van een snelle, sequentiële, geminiaturiseerde geautomatiseerde biochemische assays. Hier melden wij een platform in staat is het automatiseren van een aantal proteoomanalyse processtappen.

Digitale Microfluidics voor Geautomatiseerde Proteoom verwerking

In dit werk leggen we de fabricage en het gebruik van een microfluïdische mixer voor het mengen van twee oplossingen in ~ 8 ps. We tonen ook aan het gebruik van deze mixers met spectroscopische detectie met behulp van UV-fluorescentie en fluorescentie resonantie energie overdracht (FRET).

Microfluïdische Mixers voor het bestuderen van eiwitten vouwen

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een protocol voor een verterings techniek op membraan voor de bereiding van monsters voor massaspectrometrie. Deze techniek vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties.

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Elektrowetting-gebaseerde digitale microfluidic is een techniek die gebruik maakt van een spanning-gedreven verandering in de schijnbare contacthoek van een microliter-volume druppel om de manipulatie te vergemakkelijken. Door dit te combineren met gefunctionaliseerde magnetische kralen, kunnen meerdere laboratoriumeenheden worden ingebracht voor monstervoorbereiding en identificatie van ziekteverwekkers met behulp van immunosorbent Assay (ELISA) met enzymgebonden immunosorbent assay.

Elektrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Lanthipeptide synthetases katalyseren multistep reacties tijdens de biosynthese van peptide natuurlijke producten. Hier beschrijven we een continue, bottom-up, waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) workflow die kan worden gebruikt om de conformationele dynamiek van lanthipeptide synthetases te bestuderen, evenals andere vergelijkbare enzymen die betrokken zijn bij peptide natuurlijke productbiosynthese.

Een Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform voor het onderzoeken van Peptide Biosynthetische Enzymen

Het protocol is bedoeld om het gebruik van een triple quadrupole mass spectrometer voor Multiple Reaction Monitoring (MRM) van eiwitten uit klinische monsters in te voeren. We hebben een systematische workflow voorzien, van monstervoorbereiding tot gegevensanalyse voor klinische monsters met alle nodige voorzorgsmaatregelen die moeten worden genomen.

Kwantitatieve Proteomics Workflow met behulp van multiple reaction monitoring gebaseerde detectie van eiwitten uit menselijk hersenweefsel

Een nieuw statisch platform wordt gebruikt om eiwitstructuur en interactielocaties in de inheemse celomgeving te karakteriseren met behulp van een eiwitvoetafdruktechniek genaamd in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (IC-FPOP).

Platform Incubator met beweegbare XY Stage: een nieuw platform voor het implementeren van in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

Het structurele ensemble van monomeer alfa-synucleïne beïnvloedt de fysiologische functie en fysisch-chemische eigenschappen. Het huidige protocol beschrijft hoe milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie en daaropvolgende data-analyses kunnen worden uitgevoerd om conformatie-informatie over het monomeer van dit intrinsiek ongeordende eiwit onder fysiologische omstandigheden te bepalen.

Milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie voor de studie van alfa-synucleïne structurele dynamica onder fysiologische omstandigheden

Hier presenteren we een protocol om het vastleggen en identificeren van ziektespecifieke eiwit-eiwitinteracties van natuurlijke cellen en weefsels mogelijk te maken met behulp van chemische sondes en massaspectrometrie. De resulterende interactiedatasets worden geanalyseerd via een speciaal webgebaseerd platform om dynamische netwerkdisfuncties en routeveranderingen die verband houden met ziekte aan het licht te brengen.

In kaart brengen van disfunctionele eiwit-eiwitinteracties bij ziekte

Leer de fabricage van een doorstroom-microreactor voor snelle enzymatische eiwitdigestie met massaspectrometrie. Deze kosteneffectieve methode integreert eenvoudig in microgefabriceerde platforms voor proteomics-onderzoek.

Fast enzymatische verwerking van eiwitten voor MS Detection met een Flow-through Microreactor

Meer video's verkennen