Fast enzymatische verwerking van eiwitten voor MS Detection met een Flow-through Microreactor

Het algemene doel van dit protocol is het beschrijven van de fabricage van een flow-through tryptische microreactor die een snelle enzymatische digestie van eiwitten uitvoert om eiwitidentificatie met een massaspectrometer met elektrospray-ionisatie mogelijk te maken. De methode kan helpen bij het in kaart brengen van de aminozuurvolgorde van geïsoleerde en gezuiverde eiwitten ter ondersteuning van de verdere karakterisering van structuur en functie. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het snel en kosteneffectief is, en zich leent voor integratie in workflows die gebruikmaken van microgefabriceerde platforms.

Gebruik eerst een glazen capillairbreker om de grotere glazen capillairbuis op een lengte van zeven tot acht centimeter af te snijden, en de kleinere op een lengte van drie tot vijf centimeter. Gebruik een microscoop om te controleren of beide capillaire uiteinden een schone, rechte snede hebben, zonder uitstekende braampjes. Schuif de kleinere capillair ongeveer zes millimeter in één uiteinde van de grotere.

Gebruik vervolgens een wattenstaafje om een kleine druppel lijm aan te brengen rond de verbinding van de capillairen en laat de lijm een nacht uitharden bij kamertemperatuur. Knip daarna de ingevoerde capillair af tot een lengte van ongeveer 10 tot 15 millimeter. Dit uiteinde zal dienen als de emitter voor electrospray-ionisatie.

Steek het andere uiteinde van de capillair met de grotere diameter in een PEEK-buis van 1/32 inch die vooraf is afgesneden op een lengte tussen de vier en vijf centimeter en is verbonden met een PEEK-koppeling. Steek vervolgens het vijf centimeter lange stuk 1/16 PTFE-buis in het tegenovergestelde uiteinde van de koppeling en draai dit vast. Weeg in een schoon, droog glazen vial van twee milliliter vier milligram C18-deeltjes af en voeg vervolgens 0,5 milliliters isopropanol toe.

Sluit het flacon. Plaats deze in een ultrasoonbad en soniceer om de deeltjes gelijkmatig in de oplossing te dispergeren. Gebruik vervolgens een spuit van 250 µL om 200 µL van de C18-suspensie op te zuigen.

Plaats de spuit in de 1/16-inch PTFE-buis en breng de slurry langzaam over in de grote capillair. Observeer onder de microscoop hoe de capillair zich vult met deeltjes, totdat een pakking van twee tot drie millimeter is bereikt. De kleinere capillairbuis houdt deze deeltjes in de microreactor vast door middel van een keystone-effect.

Spoel tot slot de microreactor met 50 µL van een 50-op-50 oplossing van water en acetonitril, gevolgd door 50 µL van een oplossing bestaande uit 49 µL water gemengd met 1 µL acetonitril. Koppel de capillaire microreactor los van de PEEK-koppeling en sluit deze aan op een PEEK-Tstuk. Voer vervolgens een tweedimensionale platina draad van twee centimeter lang, geïsoleerd met een PEEK-huls van 1/32 inch voor een lekvrije verbinding, in de zijarm van het PEEK-Tstuk in.

Sluit een monsteroverdrachtcapillair van een halve meter lang aan op het tegenovergestelde uiteinde van de PEEK-T. Gebruik een PEEK-huls van 1/32-inch om een lekvrije verbinding te verkrijgen. Bevestig de PEEK-T op de XYZ-tafel.

Plaats de emitter voor electrospray-ionisatie ongeveer twee millimeter van de inlaatcapillair van de massaspectrometer. Sluit vervolgens de platina draad aan op de stroombron voor electrospray-ionisatie van de massaspectrometer. Sluit daarnaast het andere uiteinde van de capillair voor monstertransport aan op de roestvrijstalen koppeling, waarbij een PEEK-huls van 1/16-inch wordt gebruikt om een lekvrije verbinding te garanderen.

Sluit vervolgens een stuk PTFE-buis van 1/16 inch met een lengte van vier tot vijf centimeter aan op het tegenovergestelde uiteinde van de roestvrijstalen koppeling. Voer de parameters voor de tandem MS-data-acquisitie, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, in het softwarepakket in dat het MS-instrument aanstuurt. Sla deze op als een methodebestand om de opstelling gereed te maken voor het uitvoeren van de analyse.

Het LTQ MS-systeem is uitgerust met een aangepaste ESI-bron die een zelfgebouwde XYZ-tafel bevat, waardoor de massaspectrometer kan worden gekoppeld aan verschillende methoden voor monsterinvoer. Vul een spuit van 250 µL met een waterige oplossing van 50 mM bicarbonaat opgelost in 2% acetonitril. Sluit de spuit vervolgens aan op de microreactor en plaats deze onder de spuitpomp.

Spoel de microreactor met twee microliter per minuut gedurende vijf minuten om deze voor te bereiden op analyse. Laad vervolgens het eiwitmonster van belang in een spuit van 250 microliter en infuseer de monsteroplossing met twee microliter per minuut gedurende vijf minuten. Plaats daarna een spuit van 250 microliter, gevuld met een vijf micromolaire trypsine-oplossing, onder de spuitpomp en infuseer deze over het geabsorbeerde eiwit op de microreactor met twee microliter per minuut gedurende één tot drie minuten.

Het is van cruciaal belang dat de trypsine-oplossing voor elk experiment vers wordt ontdooid en klaargemaakt. Dit waarborgt dat het proteolytische enzym zijn activiteit behoudt en dat de operationele pH van de microreactor rond de 8 blijft. Vul een andere spuit van 250 µL met een waterige oplossing bestaande uit 0%1% trifluorazijnzuur toegevoegd aan 2% acetonitril.

Gebruik deze oplossing om het proteolytische digestieproces te stoppen door de microreactor gedurende vijf minuten te spoelen met twee microliters per minuut. Schakel vervolgens over naar een spuit gevuld met 0,1% trifluorazijnzuur toegevoegd aan 50% acetonitril, en schakel het MS-gegevensacquisitieproces in bij een electrospray-ionisatiespanning van ongeveer 2000 volt. Gebruik de aangezuurde oplossing om de proteïne-digest uit de microreactor te elueren met 300 nanoliters per minuut gedurende 20 tot 30 minuten.

Verwerf massaspectrometriegegevens met behulp van de parameters voor gegevensverwerving die worden vermeld in het bijbehorende tekstprotocol. Verwerk de LTQ MS raw-bestanden met een minimaal redundante proteïnedatabase door eerst de raw-gegevens in de zoekmachine te uploaden. Stel vervolgens de massatoleranties voor het ouder-ion en het fragment-ion respectievelijk in op twee en één dalton, en gebruik voor de zoekopdracht uitsluitend volledig tryptische fragmenten met maximaal twee gemiste splitsingen.

Stel daarnaast de false discovery rates voor hoge en medium betrouwbaarheid in op respectievelijk 1% en 3%, en sta geen post-translationele modificaties toe, tenzij er specifiek wordt gezocht naar bepaalde modificaties. Filter ten slotte de gegevens om alleen de peptide-matches met hoge betrouwbaarheid te selecteren. Hier wordt een massaspectrum getoond dat bestaat uit tryptische peptiden die zijn gegenereerd uit een eiwitmengsel dat proteolyse in de microreactor heeft ondergaan.

Deze labels vertegenwoordigen de meest intense tryptische peptide-ionen en vermelden hun sequentie en de corresponderende proteïne-identificatie. Deze microreactor biedt een eenvoudig te implementeren experimentele opstelling voor het uitvoeren van enzymatische digestie van proteïnen en maakt massa-analyse en identificatie mogelijk in minder dan 30 minuten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het behouden van de reinheid van de vials en instrumentatie die in contact komen met oplossingen cruciaal is om monstercontaminatie te voorkomen.

Na deze procedure kunnen andere methoden voor massaspectrometrische gegevensverwerving worden gebruikt om een betere karakterisering van de generatieve peptiden mogelijk te maken en aanvullende vragen over de structuur van eiwitten te beantwoorden. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de proteomics om snellere protocollen voor de analyse van eiwitten te ontwikkelen en de ontwikkeling van nieuwe microfalytische platforms te verkennen die high-throughput analyse van biologische monsters mogelijk maken. Deze techniek is beperkt tot de analyse van relatief eenvoudige eiwitmengsels die 25 tot 50 peptiden genereren.

Deze peptiden kunnen worden geanalyseerd via eenvoudige infusie-experimenten en vereisen geen vloeistofchromatografische scheiding voorafgaand aan de MS-analyse. Vergeet niet dat het werken met organische oplosmiddelen uiterst gevaarlijk kan zijn; neem daarom altijd voorzorgsmaatregelen, zoals het vermijden van open vuur, tijdens het uitvoeren van deze procedure.