Fast enzymatische verwerking van eiwitten voor MS Detection met een Flow-through Microreactor

Het algemene doel van dit protocol is om de fabricage van een doorstromende tryptische microreactor te beschrijven die snelle enzymatische vertering van eiwitten uitvoert om eiwitidentificatie mogelijk te maken met een elektrosprayionisatie-massaspectrometer. De methode kan helpen bij het illustreren van de aminozuursequentie van geïsoleerde en gezuiverde eiwitten om de downstream karakterisering van structuur en functie te ondersteunen. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het snel, kosteneffectief is en vatbaar is voor integratie in workflows die gebruik maken van microfabricageplatforms.

Om te beginnen, gebruik een glazen capillairklover om de grotere glazen capillaire buis af te snijden tot een lengte van zeven tot acht centimeter, en de kleinere tot een lengte van drie tot vijf centimeter. Gebruik een microscoop om te controleren of beide capillaire uiteinden een schone, rechte snede hebben, zonder uitstekende baarden. Plaats de kleinere capillair ongeveer zes millimeter in een uiteinde van de grotere.

Gebruik vervolgens een Q-tip om een kleine druppel lijm rond de verbinding van de capillairen aan te brengen, en laat de lijm een nacht bij kamertemperatuur uitharden. Snijd vervolgens de ingebrachte capillair tot een lengte van ongeveer 10 tot 15 millimeter. Dit uiteinde zal fungeren als de elektrosprayionisatie-emitter.

Plaats het tegenovergestelde uiteinde van de capillair met de grotere diameter in een 1/32-inch PEEK-buis die tussen vier en vijf centimeter in lengte is voorgesneden en verbonden is met een PEEK-verbinding. Plaats vervolgens en draai de vijf centimeter lange stuk 1/16 PTFE-buis in het tegenovergestelde uiteinde van de verbinding. Weeg in een schone, droge tweeduizend milliliter glazen file vier milligram C18-deeltjes af en voeg vervolgens 0,5 milliliter isopropanol toe.

Sluit de flacon. Plaats deze in een ultrasone bad en soniceer om de deeltjes gelijkmatig in de oplossing te verdelen. Gebruik vervolgens een 250 microliter-spuit om 200 microliter van de C18-slurry op te trekken.

Plaats de spuit in de 1/16-inch PTFE-buis en giet de slurry langzaam in de grote capillair. Observeer onder de microscoop terwijl de capillair met deeltjes vult, totdat twee tot drie millimeter deeltjespakking is bereikt. De kleinere capillaire buis houdt deze deeltjes in de microreactor vast door een keystone-effect.

Spoel ten slotte de microreactor met 50 microliter van een 50-tot-50-oplossing van water en acetonitril, gevolgd door 50 microliter van een oplossing die 49 microliter water bevat, gemengd met één microliter acetonitril. Koppel de capillaire microreactor los van de PEEK-verbinding en verbind deze met een PEEK-T. Plaats vervolgens een twee centimeter lange platinadraad, geïsoleerd met een 1/32-inch PEEK-huls om een lekvrije verbinding te bieden in de zijarm van de PEEK-T.

Verbind een halve meter lange monsterstroomkapillar met het tegenovergestelde uiteinde van de PEEK-T. Gebruik een 1/32-inch PEEK-huls om een lekvrije verbinding te bieden. Bevestig de PEEK-T op de XYZ-stand.

En plaats de elektrosprayionisatie-emitter ongeveer twee millimeter van de ingangskapillar van de massaspectrometer. Verbind vervolgens de platinadraad met de elektrosprayionisatie-voedingsbron van de massaspectrometer. Verbind ook het tegenovergestelde uiteinde van de monsterstroomkapillar met de roestvrijstalen verbinding, met behulp van een 1/16-inch PEEK-huls om een lekvrije verbinding te bieden.

Verbind vervolgens een vier tot vijf centimeter lang stuk 1/16-inch-lange PTFE-buis met het tegenovergestelde uiteinde van de roestvrijstalen verbinding. Voer de tandem MS-gegevensverwervingsparameters in zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol in de softwarepakket dat het MS-instrument bestuurt. Sla ze op als een methodebestand om de setup klaar te maken voor het uitvoeren van de analyse.

Het LTQ MS-systeem is uitgerust met een gemodificeerde ESI-bron die een zelfgemaakte XYZ-stand bevat, die de interface van de massaspectrometer met de verschillende monsterinvoerbenaderingen mogelijk maakt. Laad een 250 microliter-spuit met een waterige oplossing van 50 millimolair bicarbonaat opgelost in 2% acetonitril. Verbind vervolgens de spuit met de microreactor en plaats deze onder de spuitpomp.

Spoel de microreactor en twee microliter per minuut gedurende vijf minuten, om deze voor te bereiden op analyse. Laad vervolgens het eiwitmonster van belang in een 250 microliter-spuit en infuseer de monstersoplossing gedurende vijf minuten met twee microliter per minuut. Plaats vervolgens een 250 microliter-spuit geladen met een vijf micromolair trypsinoplossing onder de spuitpomp en infuseer over het geabsorbeerde eiwit op de microreactor gedurende één tot drie minuten met twee microliter per minuut.

Het is van cruciaal belang dat men voor elke experiment de trypsinoplossing vers versmelt en bereidt. Dit zorgt ervoor dat het protolytische enzym zijn activiteit en de operationele pH van de microreactor, die een pH van ongeveer 8 is, behoudt. Laad een andere 250 microliter-spuit met een waterige oplossing bestaande uit 0%1% trifluorazijnzuur toegevoegd aan 2% acetonitril.

Gebruik deze oplossing om het proteolytische verteringsproces te stoppen door de microreactor gedurende vijf minuten te spoelen met twee microliter per minuut. Schakel vervolgens over naar een spuit gevuld met 01% trifluorazijnzuur toegevoegd aan 50% acetonitril, en zet het MS Data Acquisition Process in de Electrospray Ionization voltage op ongeveer 2000 volt. Gebruik de verzuurde oplossing om het eiwitverteerproduct uit de microreactor te starten met elutie met 300 nanoliter per minuut gedurende 20 tot 30 minuten.

Verzamel massaspectrometrische gegevens met behulp van de gegevensverwervingsparameters die in het bijbehorende tekstprotocol zijn opgenomen. Verwerk de LTQ MS-rauwe bestanden met behulp van een minimaal redundante eiwitdatabase door eerst de ruwe gegevens in de zoekmachine te uploaden. Stel vervolgens de ouder- en fragmentionenmassatoleranties in op respectievelijk twee en een dalton, en gebruik alleen volledig tryptische fragmenten met maximaal