Name: Genererende Primaire fibroblastculturen van Mouse Oor en de Staart Tissues (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Leer primaire fibroblastculturen genereren uit muizenoren en -staarten voor celbiologisch onderzoek. Deze methode maakt gebruik van weefsels tot 10 dagen bewaard bij kamertemperatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de NRF-subsidie HUJ-CREATE - Cellulaire en Moleculaire Mechanismen van Ontsteking.

Muizen werden gehuisvest in pathogeenvrije omstandigheden in overeenstemming met de institutionele richtlijnen tot euthanization (De Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen aan de Nationale Universiteit van Singapore en de Nationale Adviescommissie voor Laboratory Animal Research (NACLAR) richtlijnen). 1. Muizen <ol><li> Bestel een muis van de juiste genetische achtergrond. Dit protocol is gebaseerd op weefsels afkomstig van een C57BL / 6 muis. </li></ol> 2. Bereiding van compleet medium <ol><li> Bereid compleet medium door toevoeging van de volgende componenten aan Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium: 10% foetaal kalfsserum (FCS), 50 uM 2-mercaptoethanol, 100 uM asparagine, 2 mM glutamine, 1% penicilline-streptomycine oplossing. </li></ol> 3. Bereiding van enzymoplossingen <ol><li> Bereid collagenase D oplossing in een 15 ml conische bodem buis. <ol><li> Weeg 10 mg collagenase D. Dissolve collagenase D in 4 ml compleet medium. </li></ol></li><li> Bereid pronase oplossing in een 1,7 ml microcentrifugebuis. <ol><li> Weeg 10 mg pronase. </li><li> Voeg 5 ul van 1 M Tris-buffer (pH 8,0). Voeg 1 pl 0,5 M EDTA (pH 8,0). </li><li> Bijvullen met 494 ul steriel water. </li><li> Incubeer de pronase oplossing bij 37 ° C in een waterbad gedurende 30 min. </li></ol></li></ol> 4. Voorbereiding van de Collagenase D-pronase Mix (≤2 Tails) Opmerking: Voer de volgende stappen in een steriele celkweek kap. <ol><li> Voeg 250 ul van pronase oplossing van 4 ml collagenase D oplossing. </li><li> Passeer de collagenase D-pronase mengsel door een 0,2 um spuit filter in een steriele 15 ml conische bodem buis. </li></ol> 5. Winning van fibroblasten van oor en Tail Tissues <ol><li> Euthanaseren muizen volgens de passende institutionele richtlijnen.</li><li> Plaats geautoclaveerd chirurgische instrumenten (schaar en pincet) in de celkweek kap. </li><li> Voeg 10 ml compleet medium in twee 10 cm celcultuurschalen elk. </li><li> Knip oren (~ 1 cm straal) en 5 cm van de staart (vanaf de punt van de staart) van een muis met een schaar en incubeer gedurende 5 min in 40 ml 70% ethanol in een steriele 50 ml conische bodem buis. </li><li> De lucht drogen oren en staart door ze in een open 10 cm celkweek schotel in de kap 5 min. Eenmaal gedroogd, overdracht oor en staartstukken twee kweekschalen label &quot;oren&quot; en &quot;staart&quot; met 10 ml compleet medium zoals beschreven in stap 5.3. </li><li> Haal haar uit de oren en staart met een schaar. </li><li> Snijd oren en staart in stukken kleiner dan 3 mm groot met een schaar. </li><li> Breng de snede weefsels in 1,8 ml cryotube flesjes label &quot;oren&quot; en &quot;staart&quot; en voeg voldoende collagenase D-pronase oplossing voor het volume van de 1,8 ml markering op de flacon te bereiken. </li><li> Pkant de cryotube flesjes horizontaal op een shaker en schud de monsters bij 200 rpm gedurende 90 min bij 37 ° C. </li><li> Na 90 min incubatie, verwijder de cryotube flacons uit de shaker en plaats de flacons in de kap. </li><li> Voeg 10 ml compleet medium in twee 10 cm celkweek gerechten, het label &quot;oren&quot; en &quot;staart&quot; elk, en zet een 70 um cel zeef in elk gerecht. </li><li> Plaats de verteerde oor en staart weefsels in de 70 micrometer cel zeef in de dienovereenkomstig geëtiketteerd gerechten bereid in stap 5.11 en krachtig maal de weefsels met behulp van een 10 ml spuit zuiger&gt; 5 min. Schud de cel zeef af en toe op de middellange tot de cellen te wassen uit de cel zeef. </li><li> Pipet de celsuspensie uit elk gerecht in twee 15 ml conische bodem buizen label &quot;oren&quot; en &quot;staart&quot;. Was de schaal en zeef met extra 10 ml compleet medium en voeg het medium om de juiste 15 ml konische buisjes. </li><li> Spin down de celsuspensie gedurende 7 min bij ~ 580 xg en 4 ° C met een koelcel centrifuge. </li><li> Verwijder supernatant, voeg 10 ml compleet medium aan de celpellet in 15 ml conische bodem buis en resuspendeer de cellen. </li><li> Herhaal stap 5.14 en 5.15. </li></ol> 6. Opkweek celmengsel <ol><li> Verwijder supernatant. Zorg ervoor dat de cel pellet blijft ongestoord. </li><li> Resuspendeer cellen in 10 ml compleet medium en voeg het mengsel respectievelijke twee 10 cm celcultuurschalen label &quot;oren&quot; en &quot;staart&quot;. </li><li> Voeg 10 ul amfotericine B oplossing (voorraadoplossing: 250 ug / ml) aan de kweek. </li><li> Incubeer cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator. </li><li> Op de derde dag vervangen door het medium 10 ml vers compleet medium bevattende 10 ui van amfotericine B om vuil te verwijderen (Figuren 1 en 2). </li></ol> 7. Sub-cultuur van fibroblasten <ol><li> When cultuur bereikt ongeveer 70% confluentie (dag 3-4 van de cultuur), verwijder het medium en was de cellen met 5 ml steriel 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Verwijder PBS en voeg 2 ml steriel 1x trypsine-EDTA-oplossing aan de cellen. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 5 min bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator. </li><li> Na 5 minuten, tik de cultuur schotel en voeg 6 ml compleet medium aan de cellen. </li><li> Breng de celsuspensie om een ​​15 ml conische bodem buis en spin de buis gedurende 5 minuten bij ~ 450 xg en 4 ° C met een koelcel centrifuge. </li><li> Verwijder supernatant en voorzichtig resuspendeer de celpellet in 5 ml compleet medium. </li><li> Seed 2 x 10 5 cellen in een 10 cm celkweekschaal en incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator gedurende 3-4 dagen voor het herhalen van stappen 7,1-7,6. </li></ol> 8. Voorbereiding van de Oren voor verzending Opmerking: Voer thij volgende stappen in een steriele celkweek kap. <ol><li> Euthanaseren muizen volgens de passende institutionele richtlijnen. </li><li> Plaats geautoclaveerd schaar en pincet in de celkweek kap. </li><li> Voeg 50 ml compleet medium in een 50 ml conische bodem buis. </li><li> Knip oren (~ 1 cm straal) van een muis met een schaar. </li><li> Breng de oren in de 50 ml conische bodem buis (zoals bereid in stap 3) onder gebruikmaking van een tang. </li><li> Verzegeling van de 50 ml conische bodem buis met parafilm voor de scheepvaart bij RT in een geschikte doos. </li></ol>

<ol><li>Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+matrices+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications.</a> Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).</li>
<li>Elenbaas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+cells+generated+by+oncogenic+transformation+of+primary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells.</a> Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).</li>
<li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> J Neuroinflammation. 9 (1), 115(2012).</li>
<li>Lim, J., Dobson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+transfection+of+HUVEC+and+MEF+cells+using+DNA+complexes+with+magnetic+nanoparticles+in+an+oscillating+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet%22%5BJournal%5D)">Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field.</a> J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transduction+of+fibroblasts+and+mesenchymal+stem+cells+by+tyrosine-mutant+AAV2+vectors+for+their+potential+use+in+cellular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy.</a> Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).</li>
<li>Patel, M., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+reprogramming+somatic+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).</li>
<li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis%3A+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+luman+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation.</a> Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li>
<li>Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+heterogeneity+in+the+cancer+wound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Fibroblast heterogeneity in the cancer wound.</a> J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).</li>
<li>Guo, S., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting wound healing.</a> J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).</li>
<li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte-fibroblast+interactions+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing.</a> J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).</li>
<li>Shen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-derived+cytosolic+DNA+mediates+type+I+interferon-dependent+rejection+of+B+cell+lymphoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells.</a> Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).</li>
<li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Baglole, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+phenotypic+characterization+of+lung+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts.</a> Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).</li>
<li>Alt, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+share+mesenchymal+phenotypes+with+stem+cells%2C+but+lack+their+differentiation+and+colony-forming+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential.</a> Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+culture+of+cells+from+mouse+tail+biopsies%3A+brief+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication.</a> J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).</li>
<li>Moore, C. B., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+ear+fibroblast+derivation+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary ear fibroblast derivation from mice.</a> Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+pluripotent+stem+cells+from+NOD+mouse+tail-tip+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts.</a> Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict van financiële aard.

Hier geven we een eenvoudige, goedkope en snelle testprocedure primaire fibroblast kweken van oren en staarten van muizen vastgesteld. De extractie moet resulteren in hechtende en snel delende fibroblasten binnen 3 dagen na isolatie van het weefsel. Een belangrijke beperking van primaire cellen veroudering, een permanente groeistop 15. Met behulp van het protocol kan fibroblast kweken worden doorgekweekt gedurende 5 tot 6 keer vóór fibroblasten worden senescente, aangegeven door de afvlakking van de cellen in...

Primaire cellen zijn afkomstig van levende weefsels en gekweekt onder in vitro omstandigheden. Algemeen wordt aangenomen dat primaire cellen meer lijken op de fysiologische toestand en de genetische achtergrond van het weefsel waaruit ze afkomstig zijn dan geïmmortaliseerde of tumorcellijnen 1. Om die reden, primaire cellen vormen een bruikbaar model voor het bestuderen van biologische vraagstukken 2,3. Anders dan gevestigde cellijnen die oneindig groeien primaire cellen uiteindelijk ondergaan senescentie in kweek en moeten vaak hersteld. Algemeen gebruikte primaire cellen omvatten fibroblasten, epitheelcellen, endotheelcellen, T-cellen, B-cellen, beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM) en beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDC). Fibroblasten worden vaak gebruikt als primaire celcultuur model. Ze bieden belangrijke voordelen ten opzichte van andere primaire cellen. Celculturen worden gemakkelijk vastgesteld, gemakkelijk onderhouden en vereisen geen Purificatie van de cellen voorafgaand aan de cultuur. Ze hebben een snelle initiële proliferatie en geen vereiste voor specialistische middelgrote of activering protocollen. Fibroblasten kunnen efficiënt worden getransfecteerd met behulp van biologische, chemische en fysische protocollen 4,5. Er is een mogelijkheid om de oren slaan voor maximaal 10 dagen bij kamertemperatuur voorafgaand aan vaststelling van celculturen. Fibroblastculturen bevorderlijk zijn voor visualisatie van cytoplasmatische processen en geschikt voor het herprogrammeren in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen 6. Fibroblasten zijn belangrijke cellen van het bindweefsel dat collageen eiwitten en extracellulaire matrix 7 uitscheiden. Zij bieden de structureel kader in vele weefsels 8 en spelen een essentiële rol in de wondgenezing en weefselherstel 9,10. Hier beschrijven we een eenvoudige en snelle (&lt;4 uur) protocol om fibroblast culturen uit oren en staarten van muizen 11 vast te stellen. Het protocol vereist minimale muiservaring om de weefsels te oogsten (in tegenstelling tot andere protocols 12,13) ​​en kan worden gebruikt om kweken van oren opgeslagen in medium bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen vast.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Asparagine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4159</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck Millipore</td><td>107017</td><td>Absolute for analysis</td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088866001</td><td>From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile</td></tr><tr><td>Pronase protease</td><td>Merck Millipore</td><td>53702</td><td>From Streptomyces griseus&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris buffer (pH 8)</td><td>1st BASE</td><td>1415</td><td>Ultra pure grade</td></tr><tr><td>0.5M EDTA (pH 8)</td><td>1st BASE</td><td>BUF-1053</td><td>Biotechnology grade</td></tr><tr><td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>1st BASE</td><td>BUF-2040-10X4L</td><td>Ultra pure grade</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2492-20ml</td><td>250 &mu;g/ml in deionized water, sterile-filtered</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Aesculap</td><td>AE-BD312R</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu;M syringe filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;M cell strainer</td><td>SPL</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Syringe plunger</td><td>Terumo</td><td>SS+10L</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial tube</td><td>NUNC</td><td>368362</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml microcentrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 cm cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td>Cell culture treated dish&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml conical bottom tube</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical bottom tube</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>GFL</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Incubation shaker</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>Certomat-BS1</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 25 light microscope</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

genererende primaire fibroblastculturen van mouse oor en de staart tissues

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Primaire cellen zijn direct afgeleid uit weefsel en men denkt dat meer representatief voor de fysiologische toestand van cellen in vivo dan gevestigde cellijnen. Echter, primaire celculturen hebben meestal een beperkte levensduur en moeten worden vaak hersteld. Fibroblasten zijn een gemakkelijk toegankelijke bron van primaire cellen. Hier bespreken we een eenvoudige en snelle testprocedure primaire fibroblast kweken van oren en staarten van muizen vastgesteld. Het protocol kan worden gebruikt om primaire fibroblast kweken vaststellen van oren opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen. Wanneer het protocol nauwkeurig gevolgd, verontreinigingen waarschijnlijk optreden, ondanks het gebruik van niet-steriele opgeslagen voor langere tijd in sommige gevallen. Fibroblasten vermenigvuldigen zich snel in de cultuur en kan worden uitgebreid tot aanzienlijke aantallen voor het ondergaan van replicatieve veroudering.

Extractie van fibroblasten uit weefsel resulteert in een significante hoeveelheid weefsel resten (figuur 1). In tegenstelling tot weefselafval, fibroblasten zich aan weefselkweek kunststof oppervlakken tussen dag 1 en 3 van de cultuur. Het medium fibroblast cultures kunnen veilig worden veranderd op dag 3 van de cultuur, die aanzienlijk de niveaus van vuil in de kweek (figuur 2) moet verminderen. Fibroblasten tonen een langwerpige morfologie en een duidelijk zichtbare cytoplasma <strong...

We beschrijven een eenvoudige en snelle experimentele procedure voor het genereren van primaire fibroblasten uit de oren en staarten van muizen. De werkwijze vereist geen speciale dierendressuur en kan worden gebruikt voor het genereren van fibroblast cultures van oren opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen.

Genererende Primaire fibroblastculturen van Mouse Oor en de Staart Tissues

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Het algemene doel van dit protocol is het vaststellen van primaire fibroblastculturen uit de oren en de staart van muizen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de celbiologie, zoals het verschil tussen gezonde cellen en kankercellen. Het belangrijkste voordeel van deze studie is dat we fibroblasten kunnen genereren uit oren die tot 10 dagen vóór de isolatie van de cellen in medium bij kamertemperatuur zijn bewaard.Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de biologie van muizen, kan deze ook worden toegepast op andere zoogdieren, zoals ratten en konijnen. Vul vóór het verzamelen van de weefsels cultuurplaten van 10 centimeter met 10 milliliters compleet medium. Gebruik vervolgens, nadat de muis is geëuthanaseerd, gesteriliseerde instrumenten om de weefselmonsters te verzamelen.Verzamel oorweefsel met een straal van ongeveer één centimeter en verzamel ongeveer vijf centimeter staartweefsel. Breng de weefsels over naar een conische buis met 40 milliliters 70% ethanol. Laat ze vijf minuten weken en laat ze vervolgens vijf minuten aan de lucht drogen in een open kweekschaal van 10 centimeter in een steriele werkkap.Nadat de weefsels zijn opgedroogd, worden ze overgebracht naar de plaat met medium. Knip vervolgens het haar van alle weefsels af met een schaar en snijd de weefsels daarna in stukjes kleiner dan drie millimeter. Breng het gesneden weefsel over naar cryotubes en vul de buisjes vervolgens aan tot de markering van 1,8 milliliter met de collagenase D pronase-oplossing.Incubeer de weefsels nu bij 37 °C, met schudden op 200 rpm gedurende 90 minuten. Vul in de zuurkast een schaaltje met 10 mL compleet medium. Plaats een cellzeef van 70 micron op het schaaltje en breng na de incubatie het verteerde weefsel over in de zeef.Maal nu de weefsels in de zeef met een stamper. Doe dit gedurende ten minste vijf minuten. Schud de zeef af en toe in het medium om gedissocieerde cellen uit te spoelen.Het is belangrijk dat de digereren oor- en staartweefsels goed worden fijngeperst om een groot aantal cellen te verkrijgen. Zorg er daarnaast voor dat de celzeef wordt geschud na het vermalen van de weefsels. Dit spoelt extra cellen uit de zeef.Verzamel vervolgens de celsuspensie in een conische koker van 15 milliliter. Spoel daarna de zeef af met 10 milliliter medium en voeg de spoeloplossing toe aan de verzamelde vloeistof. Was nu de cellen.Centrifugeer eerst de cellen in een gekoelde centrifuge. Verwijder vervolgens het supernatant. Suspendeer de cellen tot slot in 10 milliliters compleet medium.Herhaal de wasbeurt nogmaals en voltooi de procedure door de cellen in volledig medium te plaatsen, klaar voor cultivatie. Om de cellen te cultiveren, brengt u eerst de cel-suspensies over naar 10 milliliter cultuurschaaltjes. Voeg vervolgens 10 microliters amphotericine B-oplossing toe aan elke cultuur.Incubeer de cellen nu gedurende drie dagen. Vervang op de derde dag het medium door vers compleet medium met amphotericine B. Kort daarna zullen de culturen een confluentie van 70% bereiken. Verwijder op dit punt het medium en spoel de cultuur af met vijf milliliter 1X PBS.Vervang vervolgens de PBS door twee milliliter 1X trypsine EDTA-oplossing en incubeer de cellen gedurende vijf minuten. Tik na deze korte incubatie voorzichtig tegen de schalen en voeg zes milliliter vers compleet medium toe aan elke schaal. Pipetteer nu de vrijgekomen cellen uit de schaal over in twee conische buizen van 15 milliliter.Centrifugeer de buizen vervolgens vijf minuten bij 450 Gs in een gekoelde centrifuge. Resuspendeer de pellets in vijf milliliter compleet medium en meet de celdichtheid van de suspensies. Zaai de cellen nu uit in 10 centimeter schalen met 200.000 cellen per schaal.Incubeer deze cellen gedurende drie tot vier dagen tot ze een confluentie van 70% bereiken, en herhaal vervolgens het proces van het oogsten en opnieuw uitplaten van de cellen bij een specifieke dichtheid. Op deze manier kunnen ze tot 25 dagen worden gekweekt. Drie dagen na de celisolatie was er aanzienlijk debris in de cultuur aanwezig voordat het medium werd vervangen.Het celresidu is gemarkeerd met witte pijlen. De schaalbalk staat voor 100 microns. Nieuw medium verminderde het celresidu aanzienlijk.Drie dagen oude culturen, voortgekomen uit weefsel dat 10 dagen bij kamertemperatuur was bewaard, toonden aan dat de fibroblasten redelijk robuust zijn. Vanuit dergelijk weefsel werd na vijf tot zes dagen een fibroblast-confluentie van 70 tot 80% bereikt. De cellen werden gelabeld met vimentine, een marker voor fibroblasten, weergegeven in het rood.DAPI werd gebruikt om de kernen te labelen, welke in blauw zichtbaar zijn. De schaalbalk is 10 microns. De uniforme kleuring suggereert dat de fibroblastencultuur puur is.Het beschreven protocol leidde routinematig tot dit resultaat. Na het bekijken van deze video zou u dit eindresultaat moeten hebben bereikt over hoe u snel en betrouwbaar primaire fibroblastculturen kunt opzetten. Tijdens deze procedure moet extra aandacht worden besteed aan de extractie van fibroblasten uit de weefsels, aangezien onvoldoende vermalen van het weefsel zal leiden tot lagere celgetallen.

generating-primary-fibroblast-cultures-from-mouse-ear-and-tail-tissues

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit artikel beschrijft een protocol voor de isolatie en het onderhoud van de primaire fibroblast culturen van de huid en longweefsel van wilde knaagdieren.

Tot vaststelling van primaire Adult Fibroblast Culturen van knaagdieren

De kwaliteit van muizen embryonische fibroblasten (MEF) wordt bepaald door de juiste spanning van muis zoals CF-1. Pluripotentie-ondersteunende MEFs en geconditioneerde media (CM), verkregen van deze moeten bevatten optimale concentraties van Activin A, Gremlin en Tgfβ1 nodig is voor de Activin / Nodal en FGF wegen naar co-operatief te behouden zelfvernieuwing en pluripotentie.

Voorbereiding van muis embryonale Fibroblast cellen die geschikt zijn voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) lijnen produceert lijnen van verschillende ontwikkelingspotentieel, zelfs als ze passeren standaard tests voor pluripotentie. Hier beschrijven we een protocol muizen volledig zijn verkregen uit iPSCs die de iPSC lijnen gedefinieerd als hebbende full pluripotentie...

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

This video describes the rapid method to isolate and culture the melanocytes and fibroblast simultaneously from the postnatal mouse pup’s skin. These cells can be maintained and manipulated in vitro to study skin cell biology, wound healing, and melanoma.

Rapid Culturing of Primary Murine Melanocytes and Fibroblasts: Isolating Melanocytes and Fibroblasts from Whole Murine Skin Sample

Hier presenteren we een protocol om tissue engineered vaartuig enten die functioneel zijn voor het enten in muizen door dubbel zaaien gedeeltelijk geïnduceerde pluripotente stamcellen genereren (PiPSC) - afgeleide gladde spiercellen en PiPSC - afgeleide endotheelcellen op een gedecellulariseerde schip steiger bioreactor.

Generatie en enten van-Weefselmanipulatieproducten Schepen in een muismodel

We beschrijven hier een protocol voor de generatie van iCM's met behulp van retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Tbx5 en Mef2c in een polycistronisch construct. Dit protocol levert een relatief homogene populatie van geherprogrammeerde cellen met verbeterde efficiëntie en kwaliteit en is waardevol voor toekomstige studies van iCM-reprogrammering.

Verbeterde Generatie van geïnduceerde Cardiomyocytes Met behulp van een polycistronisch Construct uitdrukken optimale verhouding van GATA4, MEF2C en Tbx5

Fibroblastgedrag ligt ten grondslag aan een spectrum van klinische entiteiten, maar ze blijven slecht gekarakteriseerd, grotendeels vanwege hun inherente heterogeniteit. Traditioneel fibroblastenonderzoek is afhankelijk van in vitro manipulatie, waardoor in vivo fibroblastgedrag wordt gemaskeerd. We beschrijven een FACS-gebaseerd protocol voor de isolatie van muishuidfisbroblasten dat geen celcultuur vereist.

Muizen Dermaal Fibroblast Isolation door FACS

Hier presenteren wij ons protocol voor produceren geïnduceerde erythroid progenitoren (iEPs) van volwassen fibroblasten muis met behulp van transcriptie factor-gedreven directe bloedlijn herprogrammering (DLR).

Directe bloedlijn herprogrammering van volwassen muis Fibroblast te Erythroid voorlopercellen

Dit protocol schetst een snelle methode voor het gelijktijdig genereren van melanocyt en fibroblast culturen uit de huid van 0-4 dag oude muizen. Deze primaire culturen kunnen in vitro worden gehandhaafd en gemanipuleerd om een verscheidenheid aan fysiologisch relevante processen te bestuderen, waaronder huidcelbiologie, pigmentatie, wondgenezing en melanoom.

Snelle aanmaak van primaire Murine melanocyten en fibroblast-culturen

We presenteren een protocol om primaire volwassen fibroblasten op een eenvoudige, snelle en betrouwbare manier te isoleren, die door beginners kunnen worden perforeerbaar (bijv. studenten). De procedure combineert enzymatische weefsel spijsvertering en mechanische opwinding met ultrasone golven om primaire fibroblasten te verkrijgen. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke experimentele eisen (bijv. menselijk weefsel).

Ultrasoon-verhoogde primaire volwassen fibroblast-isolatie

Hier wordt een protocol gepresenteerd om gemanipuleerde bindweefsels te genereren voor een parallelle kweek van 48 weefsels in een multi-well plaat met dubbele polen, geschikt voor mechanistische studies, ziektemodellering en screeningstoepassingen. Het protocol is compatibel met fibroblasten van verschillende organen en soorten en wordt hier geïllustreerd met menselijke primaire cardiale fibroblasten.

Fibroblast afgeleide human engineered bindweefsel voor screeningstoepassingen

Leer primaire fibroblastculturen genereren uit muizenoren en -staarten voor celbiologisch onderzoek. Deze methode maakt gebruik van weefsels tot 10 dagen bewaard bij kamertemperatuur.

Genererende Primaire fibroblastculturen van Mouse Oor en de Staart Tissues

Meer video's verkennen