Imaging Membraan Potentiële twee soorten genetisch gecodeerde Fluorescent Voltage Sensors
February 4th, 2016
Een methode voor het afbeelden van veranderingen in membraanpotentiaal met behulp van genetisch gecodeerde spanningsindicatoren wordt beschreven.
Het algemene doel van deze procedure is om de veranderingen in het membraanpotentieel optisch te rapporteren met een genetisch gecodeerde spanningsindicator. Deze methode zal de sterke en zwakke punten van beeldvorming beschrijven met verschillende genetisch gecodeerde fluorescente spanningsprobes. Bijvoorbeeld, FRET-gebaseerde probes bieden het voordeel van ratiometrische beeldvorming, maar zullen een lager signaal geven.
Het grote voordeel van deze techniek is dat we de neurale activiteit in real time kunnen visualiseren. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de signaal-ruisverhouding niet erg groot is en er verschillende bron van ruis en meerdere stappen zijn die fout kunnen gaan. Nieuwe gebruikers raken vaak in de war en interferentie wordt aangezien voor de echte signalen.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal om de geldigheid van de gebruikte probes te bepalen en wat het daadwerkelijk aangeeft. Voor de opstelling wordt een beeldsplitter geïnstalleerd tussen de langzame en snelle CCD-camera's voor de beeldvorming van FRET-gebaseerde GEVI. Plaats voor het experiment een filtercube met een dichroïsche spiegel en twee emissiefilters in de beeldsplitter.
Verwijder deze tweede filtercube bij het beeldvormen van een GEVI met een enkele fluorescente eiwit. Om het experiment te beginnen, lokaliseer een gezonde HEK293-cel die sterke, gelokaliseerde membraanfluorescentie vertoont in vergelijking met de interne fluorescentie en vermijd het patchen van cirkelvormige cellen omdat ze ofwel aan het delen zijn of aan het sterven. Breng vervolgens een testpuls aan om de huidige respons te controleren.
Daarna laat de patchklempipet langzaam zakken tot net boven het oppervlak van de cel. Laat de pipet vervolgens langzaam zakken totdat deze de celmembraan zachtjes raakt. De membraanweerstand zou moeten toenemen tot één tot twee megaohm.
Stel daarna een giga-ohm-seal vast door voorzichtig negatieve druk toe te passen via de pipet. Zodra een giga-ohm-seal is bereikt, stel het pipetpotentiaal in op een gewenst houdpotentiaal. Focus vervolgens de hogesnelheids CCD-camera op de cellichaam.
Voor de FRET-gebaseerde GEVI-opname, pas de grootte van de verdeelde beelden aan om een gelijkmatig verdeelde weergave te verkrijgen voor elke emissiegolflengte met behulp van de knoppen op de beeldsplitter. Scheur vervolgens de celmembraan door negatieve druk toe te passen om de hele celconfiguratie te vormen. Open nu de beeldvormingssoftware.
Klik vervolgens op 'Acquieren SciMeasure cameramenu' om de CCD-acquierpagina te openen. Maak vervolgens een nieuw databestand om de opname op te slaan. Klik op analoog uitgang en lees vervolgens een ASCII om een pulsprotocolbestand te openen om de beeldvorming uit te voeren.
Klik vervolgens op 'Gemiddelde interne herhalingen' om het aantal proeven te gemiddeld. Sluit vervolgens de analoog uitgangpagina. Stel de specifieke acquisitieparameters in op de CCD-acquierpagina.
Voer vervolgens de specifieke waarden in voor het aantal frames voor acquisitie en het aantal proeven. Klik vervolgens op de knop 'Gegevens verzamelen optica plus BNC' om de opname te starten. Terwijl de spanningsbeeldvorming plaatsvindt, bewaak de oscilloscoop om een stabiele hele-celconfiguratie gedurende de opname te garanderen.
Om de fractionele fluorescentie verandering te berekenen, klik op 'Bestand' en lees vervolgens het databestand om een databestand te openen dat in de vorige stap is opgenomen. De celbeeld in zijn rustende lichtintensiteit zou aan de rechterkant te zien zijn. Klik vervolgens op 'Toon BNC's' om de huidige eindspanningswaarden weer te geven.
Verander de paginamodus van RLI-frame naar framesubtraksie om de framesubtraksiefunctie te gebruiken om de pixels met responsieve optische signalen te identificeren. Selecteer vervolgens twee tijdstippen voor subtraksie en identificeer het celgebied dat signalen vertoont als reactie op de verandering van het membraanpotentieel. Bepaal vervolgens de pixels die moeten worden geanalyseerd door elke pixel te slepen of erop te klikken.
De grafische weergave van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de geselecteerde pixels zou aan de linkerkant van het softwarevenster moeten verschijnen. Deel de afgetrokken pixels met rustende lichtintensiteit door op de knop 'Delen door RLI's' te klikken om de fractionele fluorescentie veranderingswaarden te verkrijgen. Om de gegevens te exporteren, verwijder de huidige eindspanningsgrafieken door 'Toon BNC's' menu uit te schakelen.
Ga naar 'Uitvoer', sla sporen op zoals weergegeven ASCII om de fluorescentie-trace in een ASCII-bestandsformaat voor de curvefitting-analyse te exporteren. Teken in deze procedure de fluorescentie verandering versus spanningsgrafiek door de fractionele fluorescentie veranderingen in reactie op de spanning in een data-analyseprogramma te plotten. Pas vervolgens de curve aan een Boltzmann-functie aan om de spanningsbereik van het optische signaal te bepalen door te klikken op 'Analyse', 'Fitting', 'Sigmoidale fit' en vervolgens het dialoogvenster te openen.
Plot de genormaliseerde fractionele fluorescentie veranderingen in reactie op de spanning opnieuw door het data-analyseprogramma te gebruiken. Om de snelheid van het optische antwoord te berekenen, open het ASCII-bestand en plot de fractionele fluorescentie veranderingstrace versus tijd. Klik vervolgens op 'Gegevensselectie' in de data-analysesoftware en selecteer een tijdstip dat overeenkomt met het begin van een gestreepte spanningspuls en een tweede tijdstip waarop het optische signaal de stationaire toestand heeft bereikt.
Pas dit bereik aan op zowel een enkele als dubbele exponentiële afnamefunctie door te klikken op 'Analyse', 'Fitting', 'Exponentiële fit' en vervolgens het dialoogvenster te openen en rapporteer de betere pasvorm. Deze figuur toont de fluorescentie verandering van een HEK-cel die een enkele FP-gebaseerde GEVI Bongwoori tot expressie brengt. Dit is een typische fluorescentie verandering als reactie op de gestreepte spanningspulsen.
Hier is een HEK293-cel afgebeeld met een hogesnelheids CCD-camera. Deze afbeelding toont de rustende lichtintensiteit van een cel die Bongwoori tot expressie brengt. En dit is een framesubtraksie-afbeelding die de pixels aange
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het afbeelden van veranderingen in membraanpotentiaal met behulp van genetisch gecodeerde spanningindicatoren. De techniek maakt real-time visualisatie van neurale activiteit mogelijk, hoewel deze voor nieuwe gebruikers uitdagingen oplevert vanwege ruis en signalinterpretatieproblemen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Elektrofysiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Genetisch gecodeerde spanningindicatoren worden gebruikt om veranderingen in membraanpotentiaal te monitoren.
- Verschillende fluorescente sondes hebben verschillende sterke en zwakke punten.
- FRET-gebaseerde sondes maken ratiometrische beeldvorming mogelijk, maar kunnen lagere signalen produceren.
- Het begrijpen van de signaal-ruisverhouding is cruciaal voor een nauwkeurige interpretatie.
Doel van de studie
- Om membraanpotentiaalveranderingen optisch te rapporteren.
- Om de effectiviteit van verschillende genetisch gecodeerde fluorescente sondes te evalueren.
- Om inzichten te bieden in real-time visualisatie van neurale activiteit.
Gebruikte methoden
- Gebruik van genetisch gecodeerde spanningindicatoren.
- Vergelijking van verschillende beeldvormingstechnieken.
- Analyse van signaal-ruisverhoudingen.
- Evaluatie van uitdagingen voor gebruikers bij het interpreteren van signalen.
Belangrijkste resultaten
- Real-time visualisatie van neurale activiteit is haalbaar.
- FRET-gebaseerde sondes bieden voordelen ondanks lagere signalen.
- Nieuwe gebruikers hebben moeilijkheden vanwege ruisinterferentie.
- Juiste training is essentieel om echte signalen te onderscheiden van ruis.
Conclusies
- Genetisch gecodeerde spanningindicatoren zijn waardevol voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Het begrijpen van de beperkingen van verschillende sondes is cruciaal.
- Training en ervaring kunnen de signalinterpretatie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Imaging membrane potential with genetically encoded voltage indicators (GEVIs) enables real-time visualization of cellular electrophysiology, supporting early-stage target validation in neuroscience drug discovery. The method provides quantitative, dynamic readouts of neuronal activity, aiding mechanistic de-risking by linking compound effects to functional membrane potential changes. This capability improves predictive confidence in lead identification by offering direct, optical reporting of target engagement in live cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by optically reporting membrane potential dynamics in response to pharmacological modulation.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct, real-time measurement of voltage changes in live cells expressing GEVIs.
- Predictive Value: Enhances confidence in target engagement by providing ratiometric or intensity-based fluorescence readouts correlated to voltage shifts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated cellular systems (e.g., HEK293) for downstream compound screening via stable GEVI expression and whole-cell patch clamp integration.
- Quantitative Output: Enables ratiometric imaging with FRET-based GEVIs, improving signal reliability and reducing artifacts from expression variability or photobleaching.
- Scalability: Compatible with high-speed CCD acquisition and automated pulse protocols, supporting repeated trials and dose-response analysis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to neuronal models (e.g., hippocampal primary neurons) to assess compound effects in disease-relevant electrophysiological contexts.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo potential by establishing single-cell imaging competence as a prerequisite for complex tissue studies.
- Mechanistic De-risking: Allows discrimination of compound-specific voltage effects from nonspecific noise through frame subtraction and baseline normalization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target interrogation to lead optimization, where functional voltage readouts inform compound selection prior to preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by correlating optical signals with voltage-clamp stimuli to validate probe response and cellular health.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible measurements through standardized whole-cell configuration and baseline fluorescence normalization.
- Analytics: Provides fractional fluorescence change and kinetic analysis (exponential fitting) to quantify signal amplitude and response speed.
- Translational Research: Enables progression from single-cell HEK293 models to primary neurons, supporting assessment of translational relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for ion channel modulation studies across multiple target classes and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, real-time optical reporting of membrane potential changes as a functional biomarker of neuronal activity.
- Operational Value: Promotes standardization via defined patch clamp protocols, image splitter calibration, and standardized analysis steps (frame subtraction, RLI normalization).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of off-target electrophysiological effects, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying compound-induced voltage shifts with defined thresholds for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology (whole-cell patch clamp), fluorescence microscopy, and GEVI handling.
- Dependent on high-speed CCD cameras, image splitters, and filter cubes for dual-wavelength FRET detection.
- Necessitates cross-team standardization between imaging and electrophysiology teams for consistent data acquisition.
- Adaptation considerations include GEVI type (single FP vs. FRET-based), expression levels, and cell line suitability (e.g., avoiding dividing/dying HEK293 cells).
- Practical limitations include low signal-to-noise ratio, susceptibility to overexpression artifacts, and user-dependent interpretation of optical signals versus noise.
