Imaging Membraan Potentiële twee soorten genetisch gecodeerde Fluorescent Voltage Sensors
4 februari 2016
Een methode voor het afbeelden van veranderingen in membraanpotentiaal met behulp van genetisch gecodeerde spanningsindicatoren wordt beschreven.
Het algemene doel van deze procedure is om de veranderingen in het membraanpotentieel optisch te rapporteren met een genetisch gecodeerde spanningsindicator. Deze methode zal de sterke en zwakke punten van beeldvorming beschrijven met verschillende genetisch gecodeerde fluorescente spanningsprobes. Bijvoorbeeld, FRET-gebaseerde probes bieden het voordeel van ratiometrische beeldvorming, maar zullen een lager signaal geven.
Het grote voordeel van deze techniek is dat we de neurale activiteit in real time kunnen visualiseren. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de signaal-ruisverhouding niet erg groot is en er verschillende bron van ruis en meerdere stappen zijn die fout kunnen gaan. Nieuwe gebruikers raken vaak in de war en interferentie wordt aangezien voor de echte signalen.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal om de geldigheid van de gebruikte probes te bepalen en wat het daadwerkelijk aangeeft. Voor de opstelling wordt een beeldsplitter geïnstalleerd tussen de langzame en snelle CCD-camera's voor de beeldvorming van FRET-gebaseerde GEVI. Plaats voor het experiment een filtercube met een dichroïsche spiegel en twee emissiefilters in de beeldsplitter.
Verwijder deze tweede filtercube bij het beeldvormen van een GEVI met een enkele fluorescente eiwit. Om het experiment te beginnen, lokaliseer een gezonde HEK293-cel die sterke, gelokaliseerde membraanfluorescentie vertoont in vergelijking met de interne fluorescentie en vermijd het patchen van cirkelvormige cellen omdat ze ofwel aan het delen zijn of aan het sterven. Breng vervolgens een testpuls aan om de huidige respons te controleren.
Daarna laat de patchklempipet langzaam zakken tot net boven het oppervlak van de cel. Laat de pipet vervolgens langzaam zakken totdat deze de celmembraan zachtjes raakt. De membraanweerstand zou moeten toenemen tot één tot twee megaohm.
Stel daarna een giga-ohm-seal vast door voorzichtig negatieve druk toe te passen via de pipet. Zodra een giga-ohm-seal is bereikt, stel het pipetpotentiaal in op een gewenst houdpotentiaal. Focus vervolgens de hogesnelheids CCD-camera op de cellichaam.
Voor de FRET-gebaseerde GEVI-opname, pas de grootte van de verdeelde beelden aan om een gelijkmatig verdeelde weergave te verkrijgen voor elke emissiegolflengte met behulp van de knoppen op de beeldsplitter. Scheur vervolgens de celmembraan door negatieve druk toe te passen om de hele celconfiguratie te vormen. Open nu de beeldvormingssoftware.
Klik vervolgens op 'Acquieren SciMeasure cameramenu' om de CCD-acquierpagina te openen. Maak vervolgens een nieuw databestand om de opname op te slaan. Klik op analoog uitgang en lees vervolgens een ASCII om een pulsprotocolbestand te openen om de beeldvorming uit te voeren.
Klik vervolgens op 'Gemiddelde interne herhalingen' om het aantal proeven te gemiddeld. Sluit vervolgens de analoog uitgangpagina. Stel de specifieke acquisitieparameters in op de CCD-acquierpagina.
Voer vervolgens de specifieke waarden in voor het aantal frames voor acquisitie en het aantal proeven. Klik vervolgens op de knop 'Gegevens verzamelen optica plus BNC' om de opname te starten. Terwijl de spanningsbeeldvorming plaatsvindt, bewaak de oscilloscoop om een stabiele hele-celconfiguratie gedurende de opname te garanderen.
Om de fractionele fluorescentie verandering te berekenen, klik op 'Bestand' en lees vervolgens het databestand om een databestand te openen dat in de vorige stap is opgenomen. De celbeeld in zijn rustende lichtintensiteit zou aan de rechterkant te zien zijn. Klik vervolgens op 'Toon BNC's' om de huidige eindspanningswaarden weer te geven.
Verander de paginamodus van RLI-frame naar framesubtraksie om de framesubtraksiefunctie te gebruiken om de pixels met responsieve optische signalen te identificeren. Selecteer vervolgens twee tijdstippen voor subtraksie en identificeer het celgebied dat signalen vertoont als reactie op de verandering van het membraanpotentieel. Bepaal vervolgens de pixels die moeten worden geanalyseerd door elke pixel te slepen of erop te klikken.
De grafische weergave van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de geselecteerde pixels zou aan de linkerkant van het softwarevenster moeten verschijnen. Deel de afgetrokken pixels met rustende lichtintensiteit door op de knop 'Delen door RLI's' te klikken om de fractionele fluorescentie veranderingswaarden te verkrijgen. Om de gegevens te exporteren, verwijder de huidige eindspanningsgrafieken door 'Toon BNC's' menu uit te schakelen.
Ga naar 'Uitvoer', sla sporen op zoals weergegeven ASCII om de fluorescentie-trace in een ASCII-bestandsformaat voor de curvefitting-analyse te exporteren. Teken in deze procedure de fluorescentie verandering versus spanningsgrafiek door de fractionele fluorescentie veranderingen in reactie op de spanning in een data-analyseprogramma te plotten. Pas vervolgens de curve aan een Boltzmann-functie aan om de spanningsbereik van het optische signaal te bepalen door te klikken op 'Analyse', 'Fitting', 'Sigmoidale fit' en vervolgens het dialoogvenster te openen.
Plot de genormaliseerde fractionele fluorescentie veranderingen in reactie op de spanning opnieuw door het data-analyseprogramma te gebruiken. Om de snelheid van het optische antwoord te berekenen, open het ASCII-bestand en plot de fractionele fluorescentie veranderingstrace versus tijd. Klik vervolgens op 'Gegevensselectie' in de data-analysesoftware en selecteer een tijdstip dat overeenkomt met het begin van een gestreepte spanningspuls en een tweede tijdstip waarop het optische signaal de stationaire toestand heeft bereikt.
Pas dit bereik aan op zowel een enkele als dubbele exponentiële afnamefunctie door te klikken op 'Analyse', 'Fitting', 'Exponentiële fit' en vervolgens het dialoogvenster te openen en rapporteer de betere pasvorm. Deze figuur toont de fluorescentie verandering van een HEK-cel die een enkele FP-gebaseerde GEVI Bongwoori tot expressie brengt. Dit is een typische fluorescentie verandering als reactie op de gestreepte spanningspulsen.
Hier is een HEK293-cel afgebeeld met een hogesnelheids CCD-camera. Deze afbeelding toont de rustende lichtintensiteit van een cel die Bongwoori tot expressie brengt. En dit is een framesubtraksie-afbeelding die de pixels aange
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het in beeld brengen van veranderingen in membraanpotentiaal met behulp van genetisch gecodeerde spanningsindicatoren. De techniek maakt real-time visualisatie van neurale activiteit mogelijk, hoewel het voor nieuwe gebruikers uitdagingen biedt vanwege ruis en problemen bij de signaalinterpretatie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Beeldingstechnieken
Achtergrond
- Genetisch gecodeerde spanningsindicatoren worden gebruikt om veranderingen in het membraanpotentiaal te monitoren.
- Verschillende fluorescente probes hebben uiteenlopende sterke en zwakke punten.
- FRET-gebaseerde probes maken ratiometrische beeldvorming mogelijk, maar kunnen lagere signalen produceren.
- Het begrijpen van de signaal-ruisverhouding is cruciaal voor een accurate interpretatie.
Doel van de studie
- Om veranderingen in het membraanpotentiaal optisch te rapporteren.
- Om de effectiviteit van diverse genetisch gecodeerde fluorescente probes te evalueren.
- Om inzichten te verschaffen in de real-time visualisatie van neurale activiteit.
Gebruikte methoden
- Gebruik van genetisch gecodeerde spanningsindicatoren.
- Vergelijking van verschillende beeldvormingstechnieken.
- Analyse van signaal-ruisverhoudingen.
- Evaluatie van uitdagingen voor de gebruiker bij het interpreteren van signalen.
Belangrijkste resultaten
- Real-time visualisatie van neurale activiteit is mogelijk.
- FRET-gebaseerde probes bieden voordelen ondanks lagere signalen.
- Nieuwe gebruikers ondervinden moeilijkheden door ruisinterferentie.
- Een adequate training is essentieel om echte signalen van ruis te onderscheiden.
Conclusies
- Genetisch gecodeerde spanningsindicatoren zijn waardevol voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Kennis van de beperkingen van verschillende probes is essentieel.
- Training en ervaring kunnen de signaalinterpretatie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het beelden van het membraanpotentiaal met genetisch gecodeerde spanningsindicatoren (GEVIs) maakt real-time visualisatie van de cellulaire elektrofysiologie mogelijk, wat vroege fase validatie van targets bij drug discovery in de neurowetenschappen ondersteunt. De methode biedt kwantitatieve, dynamische read-outs van neuronale activiteit, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie door de effecten van verbindingen te koppelen aan functionele veranderingen in het membraanpotentiaal. Deze capaciteit verbetert het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen door directe, optische rapportage van target-engagement in levende cellen te bieden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Target-validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door optisch melding te maken van membraanpotentiaaldynamiek als reactie op farmacologische modulatie.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele target-validatie via directe real-time meting van spanningsveranderingen in levende cellen die GEVIs tot expressie brengen.
- Predictieve waarde: Verhoogt het vertrouwen in target-engagement door ratiometrische of op intensiteit gebaseerde fluorescentie-uitlezingen te leveren die gecorreleerd zijn aan spanningsverschuivingen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarstaan van de assay: Faciliteert de voorbereiding van gevalideerde cellulaire systemen (bijv. HEK293) voor downstream compound-screening via stabiele GEVI-expressie en integratie van whole-cell patch clamp.
- Kwantitatieve output: Maakt ratiometrische beeldvorming met FRET-gebaseerde GEVIs mogelijk, waardoor de betrouwbaarheid van het signaal wordt verbeterd en artefacten door expressievariabiliteit of fotobleken worden verminderd.
- Schaalbaarheid: Compatibel met high-speed CCD-acquisitie en geautomatiseerde pulsprotocollen, wat herhaalde trials en dosis-responsanalyses ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Toepasbaar op neuronale modellen (bijv. primaire neuronen uit de hippocampus) om de effecten van verbindingen te beoordelen in elektrofysiologisch relevante contexten van ziekten.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug van in vitro bevindingen naar in vivo potentieel door competentie in single-cell imaging vast te stellen als voorwaarde voor complexe weefselstudies.
- Mechanische risicovermindering: Maakt onderscheid mogelijk tussen verbinding-specifieke spanningsstroomeffecten en aspecifieke ruis door middel van frame-subtractie en baseline-normalisatie.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van vroege target-interrogatie tot lead-optimalisatie, waarbij functionele voltage-readouts de selectie van verbindingen informeren voorafgaand aan preklinische werkzaamheidstesten.
- Discovery-biologie: Ondersteunt hypothesetesten door optische signalen te correleren met voltage-clamp stimuli om de respons van de probe en de cellulaire gezondheid te valideren.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare metingen via een gestandaardiseerde whole-cell configuratie en normalisatie van de basisfluorescentie.
- Analytica: Biedt fractionele fluorescentieveranderingen en kinetische analyse (exponentiële fitting) om de signalamplitude en responssnelheid te kwantificeren.
- Translationeel onderzoek: Maakt de overgang mogelijk van single-cell HEK293-modellen naar primaire neuronen, wat de beoordeling van de translationele relevantie ondersteunt.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een herbruikbaar imaging-platform voor studies naar ionkanaalmodulatie over meerdere doelwitklassen en screeningscampagnes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door directe, real-time optische rapportage van veranderingen in het membraanpotentiaal te bieden als functionele biomarker voor neuronale activiteit.
- Operationele waarde: Bevordert standaardisatie via gedefinieerde patchclamp-protocollen, kalibratie van de image splitter en gestandaardiseerde analysestappen (frame-subtractie, RLI-normalisatie).
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege detectie van off-target elektrofysiologische effecten mogelijk te maken, waardoor het risico op uitval in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering door verbinding-geïnduceerde spanningsverschuivingen te kwantificeren met gedefinieerde drempelwaarden voor verdere ontwikkeling.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie (whole-cell patch clamp), fluorescentiemicroscopie en de omgang met GEVI's.
- Afhankelijk van hoge-snelheid CCD-camera's, image splitters en filterkubussen voor dual-wavelength FRET-detectie.
- Maakt standaardisatie tussen imaging- en elektrofysiologieteams noodzakelijk voor een consistente data-acquisitie.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten het type GEVI (single FP vs. FRET-gebaseerd), expressieniveaus en de geschiktheid van de cellijn (bijv. het vermijden van delende/stervende HEK293-cellen).
- Praktische beperkingen zijn onder meer een lage signaal-ruisverhouding, gevoeligheid voor artefacten door overexpressie en gebruiker-afhankelijke interpretatie van optische signalen versus ruis.
