Name: Imaging Membraan Potentiële twee soorten genetisch gecodeerde Fluorescent Voltage Sensors (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Leer membraanpotentiaalbeeldvorming met genetisch gecodeerde fluorescentiesensoren voor neurofysiologisch onderzoek. Deze methode maakt real-time visualisatie van neurale activiteit mogelijk met FRET-gebaseerde probes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het World Class Institute (WCI) programma van de National Research Foundation of Korea, gefinancierd door het Ministry of Education, Science, and Technology of Korea Grant WCI 2009-003 en het Korea Institute of Science and Technology Institutionele Programma Project 2E24210. Sungmoo Lee werd ondersteund door het Global Ph.D. Fellowship programma (NRF-2013H1A2A1033344) van de National Research Foundation (NRF) onder het Ministry of Education (MOE, Korea).

<ol><li>Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+impulses+in+individual+neurones+of+an+invertebrate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system.</a> Nature. 246, 508-509 (1973).</li>
<li>Cohen, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+axon+fluorescence+during+activity%3A+molecular+probes+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membrane+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential.</a> J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).</li>
<li>Tasaki, I., Warashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-membrane+interaction+and+its+changes+during+nerve+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation.</a> Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).</li>
<li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSDI%3A+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).</li>
<li>Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+action+potentials+and+subthreshold+electrical+events+imaged+in+neurons+with+a+fluorescent+protein+voltage+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe.</a> Neuron. 75, 779-785 (2012).</li>
<li>Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154, 904-913 (2013).</li>
<li>St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+optical+reporting+of+neuronal+electrical+activity+with+an+ultrafast+fluorescent+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor.</a> Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).</li>
<li>Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+mutagenesis+of+the+voltage-sensing+domain+enables+the+optical+resolution+of+action+potentials+firing+at+60+Hz+by+a+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential.</a> J Neurosci. 35, 372-385 (2015).</li>
<li>Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+length+and+fusion+site+composition+improve+the+optical+signal+of+genetically+encoded+fluorescent+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophoton%22%5BJournal%5D)">Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors.</a> Neurophoton. 2, 021012(2015).</li>
<li>Dimitrov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+characterization+of+an+enhanced+fluorescent+protein+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor.</a> PLoS One. 2, e440(2007).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).</li>
<li>Sung, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+fast+fluorescent+protein+voltage+sensors+by+optimizing+FRET+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions.</a> PLoS One. 10, e0141585(2015).</li>
<li>Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+action+potentials+in+mammalian+neurons+using+a+microbial+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin.</a> Nat Methods. 9, 90-95 (2012).</li>
<li>Flytzanis, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaerhodopsin+variants+with+enhanced+voltage-sensitive+fluorescence+in+mammalian+and+Caenorhabditis+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons.</a> Nat Commun. 5, 4894(2014).</li>
<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nat Methods. 11, 825-833 (2014).</li>
<li>Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+spiking+in+brain+tissue+using+FRET-opsin+protein+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors.</a> Nat Commun. 5, 3674(2014).</li>
<li>Zou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+fast+multicoloured+voltage+reporters+via+electrochromic+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET.</a> Nat Commun. 5, 4625(2014).</li>
<li>Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+approach+to+measuring+electrical+activity+in+genetically+specified+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons.</a> Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).</li>
<li>Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+voltage+sensor+imaging+of+electrical+activity+from+neurons+in+hippocampal+slices+from+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice.</a> J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).</li>
<li>Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+voltage+sensor+imaging+of+eGFP-F+expressing+neurons+in+chicken+midbrain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices.</a> J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).</li>
<li>Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaters%2C+JC+%22Methods+in+Cell+Biology+Volume+81%22">Methods in Cell Biology Volume 81</a>. Sluder, G., Wolf, D. E. , Academic Press. 115-140 (2007).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).</li>
<li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Ca2%2B-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).</li>
<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+clamping%3A+an+introductory+guide+to+patch+clamp+electrophysiology%22">Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).</li>
<li>Osorio, N., Delmas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+from+enteric+neurons+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording from enteric neurons in situ.</a> Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).</li>
<li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The mammalian unfolded protein response.</a> Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).</li>
<li>Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+shot+noise+limits+on+optical+detection+of+neuronal+spikes+and+estimation+of+spike+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing.</a> Biophys J. 104, 51-62 (2013).</li>
<li>Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+genetically+encodable+fluorescent+voltage+sensor+exploiting+fast+Ci-VSP+voltage-sensing+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements.</a> PLoS One. 3, e2514(2008).</li>
<li>Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+voltage+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging voltage in neurons.</a> Neuron. 69, 9-21 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het zenuwstelsel gebruikt spanning op verschillende manieren remming veroorzaakt een lichte hyperpolarisatie, synaptische ingang veroorzaakt een lichte depolarisatie en een actiepotentiaal leidt tot een relatief grote spanningsverandering. Het vermogen om veranderingen in membraanpotentiaal meten door GEVIs biedt het veelbelovend potentieel gelijktijdig analyseren van verschillende componenten van neuronale circuits. In dit rapport tonen we een fundamentele methode voor het afbeelden veranderingen in de membraanpotentia...

Het hoofddoel van dit artikel is het optische beeldvorming van veranderingen in membraanpotentialen in vitro gebruik van genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen demonstreren. Imaging veranderingen in membraanpotentiaal biedt de spannende mogelijkheid bestuderen van de activiteit van neuronale circuits. Wanneer veranderingen in membraanpotentiaal resulteren in een verandering fluorescentie-intensiteit, elke pixel van de camera wordt een surrogaat elektrode waarmee nonintrusive metingen van neuronale activiteit. Al meer dan veertig jaar, hebben organische voltage-gevoelige kleurstoffen die bruikbaar zijn voor het observeren van de veranderingen in de membraanpotentiaal 1-4 geweest. Echter, deze kleurstoffen gebrek cellulaire specificiteit. Bovendien zijn sommige celtypen moeilijk te bevlekken. Genetisch gecodeerde spanningsindicatoren (GEVIs) deze beperkingen te ondervangen doordat de cellen specifiek te bestuderen drukken de fluorescerende spanningsgevoelige probe. Er zijn drie klassen van GEVIs. De eerste klasse van GEVI maakt gebruik van de voltage-sensing domein van de spanning sensing fosfatase met ofwel een enkel fluorescerend eiwit (FP) 5-9 of een Förster resonance energy transfer (FRET) paar 10-12. De tweede klasse van sensoren maakt gebruik van microbiële rhodopsine als een fluorescerende indicator rechtstreeks 13-15 of via elektrochrome FRET 16,17. De derde klasse gebruikt twee componenten, de genetische component een membraan verankerd FP en een tweede component een membraan gebonden kleurstof 18-20 quenching. Terwijl de tweede en derde klassen zijn bruikbaar voor in vitro experimenten en slice 19,20, alleen de eerste klasse van sensoren zijn bruikbaar voor in vivo analyses 6. In dit verslag wij de beeldvorming van membraanpotentiaal tonen met de eerste klasse van GEVIs (figuur 1) in vitro. Dit eersteklas spanningssensoren is het makkelijkst om de overgang in vivo beeldvorming. Sinds GEVIs utilizing een spanningsgestuurde sensing domein gefuseerd aan een FP zijn ongeveer 50 maal helderder dan de rhodopsine klasse van sensoren, kunnen worden afgebeeld met behulp booglamp verlichting plaats van dat een zeer krachtige laser. Een ander gevolg van het verschil in helderheid dat de eerste klasse van GEVIs gemakkelijk de auto-fluorescentie van de hersenen kan overschrijden. De rhodopsine gebaseerde probes kan niet. De derde klasse van sensor even helder als de eerste klasse, maar vereist de toevoeging van een chemisch quencher die moeilijk toe te dienen in vivo. Wij demonstreren daarom het verkrijgen van een probe met één FP (Bongwoori) 8 en een probe bestaande uit een FRET paar (Nabi 2) 12. De FRET construeert in dit rapport zijn vlinder versies van VSFP-CR (voltage-gevoelige fluorescerende eiwitten - Clover-mRuby2) 11, bestaande uit een groen fluorescerend donor, Clover, en een rode fluorescerende acceptor, mRuby2, genaamd Nabi 2,242 en 2,244 Nabi <sup&gt; 12. In de inleiding van dit soort opnamen moeten onderzoekers een beter begrip van het type informatie GEVIs kan verschaffen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53566/53566fig1.jpg" /> Figuur 1. Twee soorten genetisch gecodeerde Voltage Indicators (GEVIs) Bedrukte in dit rapport (A) Een mono FP gebaseerd GEVI met een trans-membraan-voltage sensing domein en een fluorescerend eiwit. (B) A FRET gebaseerd GEVI bestaat uit een trans-membraan-voltage sensing domein, een FRET donor en acceptor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53566/53566fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>60X objective lens (numerical aperture = 1.35)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>Excitation filter</td><td>Semrock</td><td>&nbsp;FF02-472/30</td><td>Voor spanningsbeeldvorming van super ecliptic pHluorin in Bongwoori</td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emission filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-497/LP</td><td></td></tr><tr><td>75W Xenon arc lamp</td><td>CAIRN</td><td>OptoSource Illuminator</td><td>LED's en lasers zijn ook effectieve lichtbronnen</td></tr><tr><td>Slow speed CCD camera</td><td>Hitachi</td><td>KP-D20BU</td><td></td></tr><tr><td>Dual port camera adaptor</td><td>Olympus</td><td>U-DPCAD</td><td></td></tr><tr><td>High speed CCD camera</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>Image splitter</td><td>CAIRN</td><td>Optosplit 2</td><td></td></tr><tr><td>Excitation filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/23-25</td><td>Voor spanningsbeeldvorming van FRET paar gebaseerde GEVI bestaande uit Clover en mRuby2)</td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emission filter</td><td>Chroma</td><td>ET520/40</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25X36</td><td></td></tr><tr><td>Emission filter</td><td>Chroma</td><td>ET645/75</td><td></td></tr><tr><td>Vibration isolation system</td><td>Kinetic systems</td><td>250BM-IC, 5702E-3036-31</td><td></td></tr><tr><td>Patching chamber</td><td>Warner instruments</td><td>RC-26G, 64-0235</td><td></td></tr><tr><td>#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-20</td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>Warner instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip</td><td>Ted Pella</td><td>260366</td><td></td></tr><tr><td>Lipofection agent</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Calcium phosphate reagent</td><td>Clontech - Takara</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB amplifier</td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel data acquisition software</td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td><td></td></tr><tr><td>Image acquisition and analysis software</td><td>RedShirtImaging</td><td>Neuroplex</td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet application software</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel 2010</td><td></td></tr><tr><td>Data analysis software</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 8.6.0</td><td></td></tr><tr><td>Demagnifier</td><td>Qioptiq LINOS</td><td>Optem standaard camera koppeling 0.38x SC38 J-klem</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R confocal microscope</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging membraan potentiële twee soorten genetisch gecodeerde fluorescent voltage sensors

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetisch gecodeerde spanningsindicatoren (GEVI's) zijn verbeterd tot het punt dat ze beginnen te worden gebruikt voor in vivo opnames. Hoewel het uiteindelijke doel is om neuronale activiteit in vivo te beeldhouwen, moet men in staat zijn om de activiteit van een enkele cel te beeldhouwen om succesvolle in vivo voorbereidingen te garanderen. Deze procedure zal beschrijven hoe het membraanpotentieel in een enkele cel kan worden gevisualiseerd om een basis te bieden voor uiteindelijke in vivo visualisatie. Hier beschrijven we methoden voor het beeldhouwen van GEVI's bestaande uit een spanningsgevoelig domein gefuseerd met een enkel fluorescerend eiwit (FP) of twee fluorescerende eiwitten die in staat zijn tot Förster resonantie energieoverdracht (FRET) in vitro. Het gebruik van een beeldsplitser maakt het mogelijk om beelden gecreëerd door twee verschillende golflengten gelijktijdig op dezelfde beeldsensor (CCD) camera te projecteren. De beeldsplitser plaatst een tweede filterkubus in de lichtbaan. Deze tweede filterkubus bestaat uit een dichroïsche spiegel en twee emissiefilters om de donor en acceptor fluorescente golflengten te scheiden, afhankelijk van de FP's van de GEVI. Deze opstelling maakt het mogelijk om zowel de acceptor als de donor fluorescente partners gelijktijdig op te nemen terwijl het membraanpotentieel wordt gemanipuleerd via een whole-cell patch clamp configuratie. Bij gebruik van een GEVI bestaande uit een enkel FP, kan de tweede filterkubus worden verwijderd waardoor de spiegels in de beeldsplitser een enkel beeld op de CCD-camera kunnen projecteren.

Transient getransfecteerde cellen kunnen aanzienlijke verschillen in fluorescentie-intensiteit en de mate van plasmamembraan expressie vertonen. Zelfs op dezelfde dekglaasje sommige cellen variërende niveaus van interne fluorescentie hebben. Dit komt waarschijnlijk door de hoeveelheid transfectie agens opgenomen door de cel. Af te veel expressie veroorzaakt de cel ongevouwen eiwit die resulteert in apoptose 27 ervaren (helder, ronde cellen met hoge inwendige fluorescentie). De...

Een methode voor het afbeelden van veranderingen in membraanpotentiaal met behulp van genetisch gecodeerde spanningsindicatoren wordt beschreven.

Imaging Membraan Potentiële twee soorten genetisch gecodeerde Fluorescent Voltage Sensors

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in het membraanpotentiaal optisch te rapporteren met een genetisch gecodeerde spanningsindicator. Deze methode beschrijft de sterke en zwakke punten van beeldvorming met verschillende genetisch gecodeerde fluorescente spanningsprobes. FRET-gebaseerde probes bieden bijvoorbeeld het voordeel van ratiometrische beeldvorming, maar geven een lager signaal.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de neurale activiteit in real-time kunnen visualiseren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de signaal-ruisverhouding niet erg groot is en er verschillende ruisbronnen zijn en meerdere stappen die fout kunnen gaan. Nieuwe gebruikers raken vaak in de war en interpreteren interferentie als echte signalen.Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal om de validiteit van de gebruikte probes en wat deze daadwerkelijk aangeven vast te stellen. Voor de opstelling wordt een image splitter geïnstalleerd tussen de langzame en snelle CCD-camera's voor de beeldvorming van FRET-gebaseerde GEVI. Plaats vóór het experiment een filterkubus met een dichroïsche spiegel en twee emissiefilters in de image splitter.Verwijder deze tweede filterkubus bij het afbeelden van een GEVI met een enkel fluorescent eiwit. Om het experiment te starten, zoek een gezonde HEK293-cel die een sterke, gelokaliseerde membraanfluorescentie vertoont in vergelijking met de interne fluorescentie en vermijd het patchen van ronde cellen, aangezien deze zich ofwel delen of afsterven. Breng vervolgens een testpuls toe om de stroomrespons te controleren.Breng vervolgens de patchclamp-pipet naar een positie direct boven het celoppervlak. Laat de pipet daarna langzaam zakken tot deze het celmembraan zachtjes raakt. De membraanweerstand moet toenemen tot één à twee megaohm.Stel daarna een gigaohm-afdichting vast door voorzichtig negatieve druk via de pipet toe te passen. Zodra een gigaohm-afdichting is bereikt, wordt het pipetpotentiaal ingesteld op een gewenst rustpotentiaal. Richt vervolgens de hoge-snelheids CCD-camera op het cellichaam.Pas voor de FRET-gebaseerde GEVI-registratie de grootte van de gesplitste beelden aan met de knoppen op de beeldsplitter, zodat er een gelijkmatig verdeeld beeld ontstaat voor elke emissiegolflengte. Ruptureer vervolgens het celmembraan door negatieve druk toe te passen om de whole cell configuratie te vormen. Open nu de imaging-software.Klik vervolgens in het menu van de SciMeasure-camera op acquire om de CCD-acquisitiepagina te openen. Maak daarna een nieuw gegevensbestand aan om de opname op te slaan. Klik op analog output en vervolgens op read an ASCII om een pulsprotocolbestand te openen voor het uitvoeren van de beeldvorming.Klik vervolgens op 'average the internal repetitions' om het aantal pogingen te middelen. Sluit daarna de pagina voor de analoge output. Stel de specifieke acquisitieparameters in op de pagina 'CCD acquire'.Voer daarna de specifieke waarden in voor het aantal frames voor acquisitie en het aantal trials. Klik vervolgens op de knop 'take data optics plus BNC' om de opname te starten. Controleer tijdens de voltage imaging de oscilloscoop om er zeker van te zijn dat de whole-cell configuratie gedurende de hele opname stabiel blijft.Om de fractionele fluorescentieverandering te berekenen, klikt u op file en vervolgens op read data file om een gegevensbestand te openen dat in de vorige stap is opgenomen. De celafbeelding in de rustlichtintensiteit moet aan de rechterkant zichtbaar zijn. Klik daarna op show BNC's om de huidige eindspanningswaarden weer te geven.Wijzig de paginamodus van RLI-frame naar frame-subtractie om de frame-subtractiefunctie te gebruiken voor het identificeren van de pixels met responsieve optische signalen. Selecteer vervolgens twee tijdspunten voor subtractie en identificeer het celgebied dat signalen vertoont als reactie op de verandering in membraanpotentiaal. Wijs daarna de pixels aan die geanalyseerd moeten worden door elke pixel te verslepen of erop te klikken.De grafische weergave van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de geselecteerde pixels moet aan de linkerkant van het softwarevenster verschijnen. Deel de afgetrokken pixels met de rustlichtintensiteit door op de knop 'divide by RLI's' te klikken om de fractionele fluorescentieveranderingswaarden te verkrijgen. Om de gegevens te exporteren, verwijdert u de huidige eindspanningsgrafieken door het menu 'show BNC's' uit te vinken.Ga naar output en sla de traces op als 'displayed ASCII' om de fluorescentietrace te exporteren in een ASCII-bestandsformaat voor de curve-fitting analyse. Teken in deze procedure de grafiek van de fluorescentieverandering versus het voltage door de fractionele fluorescentieveranderingen in reactie op het voltage uit te zetten in een data-analyseprogramma. Pas vervolgens de curve aan een Boltzmann-functie aan om het voltagebereik van het optische signaal te bepalen door te klikken op analysis, fitting, sigmoidal fit en vervolgens open dialog.Zet de genormaliseerde fractionele fluorescentieveranderingen als reactie op het voltage opnieuw uit met behulp van het programma voor data-analyse. Om de snelheid van de optische respons te berekenen, opent u het ASCII-bestand en plot u het spoor van de fractionele fluorescentieverandering tegenover de tijd. Klik vervolgens op de dataselector in de software voor data-analyse en selecteer één tijdstip dat overeenkomt met het begin van een stapsgewijze voltagepuls en een tweede tijdstip waarop het optische signaal de stationaire toestand heeft bereikt.Pas dit bereik aan zowel een enkelvoudige als een dubbele exponentiële vervalfunctie door op analyse, fitting, exponentiële fit te klikken, vervolgens het dialoogvenster te openen en de beste fit te rapporteren. Deze figuur toont de fluorescentieverandering van een HEK-cel die een enkelvoudige FP-gebaseerde GEVI Bongwoori tot expressie brengt. Dit is een typische fluorescentieverandering als reactie op de stapsgewijze spanningspulsen.Hier is een HEK293-cel gefotografeerd met een high-speed CCD-camera. Deze afbeelding toont de rustlichtintensiteit van een cel die Bongwoori tot expressie brengt. En dit is een frame-subtractiebeeld waarin de pixels worden aangegeven waar een verandering in fluorescentie is waargenomen.Hier wordt de optische registratie getoond van de geïnduceerde actiepotentialen van primaire hippocampale neuronen van muizen die Bongwoori tot expressie brengen. De actiepotentialen werden opgewekt in de whole-cell currents clamp-modus. Het spoor van de fractionele fluorescentieverandering is geselecteerd uit de pixels die gecorreleerd zijn aan het soma.In deze figuur is de fluorescentieverandering van een HEK-cel die FRET-gebaseerde GEVI tot expressie brengt, te zien als reactie op getrapte spanningspulsen bij twee golflengten. Opgenomen op één kilohertz met een high-speed CCD-camera. Tijdens deze procedure is het belangrijk om variabele fluorescentieniveaus te testen, aangezien overexpressie van fluorescentie de gezondheid van de cel kan beïnvloeden.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals slicer-coderingen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de neuronale activiteit van diverse circuits. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe membraanpotentiaal kan worden geïmageerd met behulp van verschillende typen probes.

imaging-membrane-potential-with-two-types-genetically-encoded

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Extern elektrisch veld induceert een spanning op het membraan van een cel, de zogenoemde geïnduceerde membraan spanning (ΔΦ). Door het gebruik van de potentiometrische kleurstof di-8-ANEPPS, is het mogelijk om de ΔΦ niet-invasief te meten. Deze video toont het protocol voor het meten van ΔΦ met behulp van di-8-ANEPPS.

Het meten van de Induced Membraan Voltage met Di-8-ANEPPS

Een beeldvormende techniek voor de monitoring van membraanpotentiaal verandert met sub-micrometer ruimtelijke en minder dan een milliseconde tijdsresolutie wordt beschreven. De techniek is gebaseerd op laser-excitatie van voltage-sensitieve kleurstoffen, maakt metingen van signalen in de axonen en axon collateralen, terminal dendritische takken, en individuele dendritische spines.

Voltage-gevoelige kleurstof Opnemen van axonen, dendrieten en dendritische spines van individuele neuronen in Brain Slices

De hier beschreven protocollen maken de studie van de elektrische eigenschappen van prikkelbare cellen mogelijk in de meest niet-invasieve fysiologische omstandigheden door het gebruik van zebravis-embryo's in een in vivo systeem, samen met een op fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde, genetisch gecodeerde spanningsindicator (GEVI) die selectief wordt tot expressie gebracht in het celtype van belang.

Biosensing Motor Neuron Membraan Potentieel in Live Zebrafish Embryo&#39;s

Hier presenteren we een methode om optisch beeld actie potentieel, specifiek in ventriculaire-achtige geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige cardiomyocytes. De methode is gebaseerd op de promotor-gedreven uitdrukking van een spanning-gevoelige fluorescent proteïne.

Subtype-specifieke optische actiepotentiaal opnamen in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ventriculaire Cardiomyocytes

Hier presenteren we een protocol bij afbeelding calcium signalering bij populaties van individuele celtypes op de lymfkliertest motorische eindplaat.

Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis

We presenteren de methodologie voor het isoleren van Murine myocyten en het verkrijgen van spannings-of calcium sporen tegelijk met sarcomere inkorten van sporen met fluorescentie fotometrie met gelijktijdige metingen van digitale cellen geometrie.

Optische beeldvorming van geïsoleerde Murine ventriculaire Myocyten

Hier beschrijven we optische acquisitie en karakterisering van actiepotentiaalen van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten met behulp van een snel modulair fotometriesysteem.

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Dit protocol beschrijft een methode voor de studie van elektrogene membraaneiwitten door het meten van veranderingen in membraanpotentiaal. Deze test biedt een platform voor de functionele uitlezing van meerdere ionkanalen endogeen uitgedrukt in epitheelcellijnen.

Een op fluorescentie gebaseerde test van membraanpotentiaal voor functionele studie met hoge doorvoer van twee endogene ionkanalen in twee epitheelcellijnen

Voor het bestuderen van reacties van exciteerbare cellen in vitro, beschrijft het protocol optische monitoring van veranderingen in het genereren van actiepotentiaal als gevolg van elektroporatie op een eenvoudig exciteerbaar celmodel van genetisch gemanipuleerde tet-on spiking HEK-cellen, evenals veranderingen in transmembraanspanning met geautomatiseerde extractie van relevante parameters.

Monitoring van door elektroporatie geïnduceerde veranderingen in het genereren van actiepotentieel in genetisch gemanipuleerde Tet-On Spiking HEK-cellen

Leer membraanpotentiaalbeeldvorming met genetisch gecodeerde fluorescentiesensoren voor neurofysiologisch onderzoek. Deze methode maakt real-time visualisatie van neurale activiteit mogelijk met FRET-gebaseerde probes.

Imaging Membraan Potentiële twee soorten genetisch gecodeerde Fluorescent Voltage Sensors

Meer video's verkennen