Name: Inductie van een iso-elektrisch Brain staat om de impact van endogene synaptische activiteit op neuronale Exciteerbaarheid Onderzoek In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Leer hoe je een iso-elektrische hersentoestand induceert om neuronale exciteerbaarheid in vivo te onderzoeken zonder synaptische input. Deze methode isoleert intrinsieke neuronale eigenschappen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Fondation de France, het Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, de Pierre &amp; Marie Curie University en het programma &#39;Investissements d&#39;avenir&#39; ANR-10-IAIHU-06.

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Unie zijn uitgevoerd (Richtlijn 2010/63 / EU) en door de Charles Darwin Ethische Commissie Dierproeven goedgekeurd. We beschrijven hier de procedure we routinematig gebruikt in ons laboratorium, maar de meeste stappen kunnen worden aangepast aan de specifieke behoeften ieders passen. 1. Chirurgische Voorbereiding Opmerking: Alle incisie en drukpunten moeten herhaaldelijk worden geïnfiltreerd met plaatselijke verdoving (lidocaïne of bupivacaïne). De huidige werkwijze terminal, wanneer een aseptische bereiding vereist verscheidene wijzigingen moeten worden uitgevoerd. <ol><li> Verdoven een rat met natriumpentobarbital (40 mg / kg) en ketamine (50 mg / kg) in twee plaatselijk gescheiden intraperitoneale (IP) injectie. </li><li> Laat het dier gaan onder algemene verdoving en herhaaldelijk controleren of een chirurgische vlak van anesthesie is bereikt (geen reactie tot teen knijpen). Plaats de rat op een feedback verwarming deken en plaats een rectale sonde naar de kern temperatuur rond 37 ° C te houden. </li><li> Plaats een katheter in de buikholte latere injectie van anesthetica vergemakkelijken en om te voorkomen dat het perforeren van organen door herhaalde naald puncties 30. <ol><li> Clip het haar over een klein (~ 2-3 mm) gebied boven een gebied gelegen binnen de maag onderste rechts of links kwadrant. Opmerking: Ontharingscrème kunnen ook worden gebruikt. </li><li> Maak een 2-3 mm incisie op de huid met scherpe schaar of een scalpel. Middels stompe dissectie Verwijder vet en spieren lagen totdat de buikholte waargenomen. </li><li> Plaats ongeveer 1-2 cm van een kleine katheter in de holte en sluit de wond met chirurgische lijm. (Bijv., 2 Franse - overeenkomend met 0,043 mm binnendiameter): Opmerking De diameter en de totale lengte van de katheter zo klein mogelijk zijn om het dode volume te verminderen. Polyurethaan buizen zijn het meest geschikt. </li><li> Maak een lus en hechtdraad tHij katheter aan de huid om het vast te zetten. </li></ol></li><li> Installeer een tracheatube de ventilatie te controleren tijdens kunstmatige beademing. <ol><li> Zoals voor de vorige stap, voor te bereiden op het gebied van belang (1 - 2 cm over de luchtpijp recht boven de manubrium), verwijder het haar en incise de huid. </li><li> Blunt ontleden de eerste lagen van vet en spieren, verplaats de speekselklier opzij en bloot de luchtpijp door voorzichtig het ontleden van de laatste laag van de spieren. </li><li> Verwijder voorzichtig de weefsels over de luchtpijp en schuif een draad eronder met behulp van kleine tang. Maak knoop van een chirurg met de draad, maar doen nog niet strak is. </li><li> Incise de luchtpijp dwars tussen twee kraakbeen ringen. Swab bloed in de luchtpijp indien aanwezig. </li><li> Plaats een tracheatube met de juiste diameter en draai knoop de draad aan de buis stabiel te beveiligen. Voor meer stabiliteit de draad verder op een hoger punt van de endotracheale tube kan worden bevestigd. </li><li> Suture de wond dicht of gebruik chirurgische nietjes. Vermijd chirurgische lijm hier als de tracheatube bedoeld is om te worden hergebruikt. </li></ol></li><li> Installeer het dier in een stereotaxische frame en zorgvuldig toezicht houden op de volgende fysiologische variabelen: ECoG, SpO 2, EtCO 2, hartslag (via een elektrocardiogram, ECG) en de interne temperatuur. Monitor en pas deze variabelen om een ​​goede diepte van de anesthesie en fysiologische toestand te houden. Specifiek vullen anesthesie met een kleine dosis (10 mg / kg) van natriumpentobarbital indien nodig. </li><li> Solliciteer oogzalf aan beide ogen om uitdroging te voorkomen. Clip het haar over de hoofdhuid, maken een longitudinale incisie (~ 2 cm) en resect het bindweefsel bovenop de schedel met behulp van een scalpel of een curette. </li><li> Maak een kleine (~ 1,5 mm diameter) craniotomy over de regio van belang met een tandheelkundige boor. Opmerking: Hier wordt het gebied loop van de primaire somatosensorische cortex gerichte (7-8 mm juist voor de interaurale lijn, 4,5- 5,5 mm lateraal van de middellijn 31). Spoel herhaaldelijk om warmte af te voeren. </li><li> Gebruik extra fijne tang om voorzichtig te maken een klein gaatje in de dura. Reserveer een regio mm ~ 0.5 binnen de craniale trepanatie de ECoG elektrode (zie volgende stap). Te houden permanent de cortex vochtig met 0,9% NaCl-oplossing (of kunstmatige cerebrospinale vloeistof). </li><li> Plaats een lage impedantie (~ 60 kQ) zilverelektrode (de ECoG elektrode) op de dura, het vermijden van de corticale gebied niet onder de hersenvliezen en plaats de referentie-elektrode op een hoofdhuid spier aan de andere kant van de weg. </li><li> In deze fase (30 min na de laatste injectie natriumpentobarbital), handhaven de anesthesie door herhaalde injecties van natrium pentobarbital (10-15 mg / kg / h) of fentanyl (3-6 ug / kg / h) via het IP katheter. De eerste zal resulteren in een trage oscillerende slaapachtige, ECoG patroon terwijl de laatste resulteert in een gedesynchroniseerd, wakker-achtige, corticale profiel. </li><li> Pas de kunstmatige ventilatiegegevens systeem zodat de ademhalingsfrequentie en volume zijn vergelijkbaar met die van spontane ademhaling van de rat (normale bereik 70-115 adem / min 32). Sluit vervolgens de mechanische ventilatie om de tracheatube en toezien op het correcte borstkas inflatie (aan beide zijden). Zo niet, wordt de plaats van de ventilatie slangen in de tracheale as. Eventueel zuigen de afscheiding in de trachea met een katheter verbonden met een injectiespuit of een vacuümpomp. </li><li> Als alle fysiologische variabelen 32-35 en ECoG 29,36 afspiegeling stabiele chirurgische vlak van anesthesie, doe een intramusculaire injectie van gallamine triethiodide in elk been de rat, 40 mg verlammen / kg voor de eerste injectie en daarna 20 mg / kg , elke 2 uur 19,29,36,50. </li></ol> 2. Intracellulaire Recordings <ol><li> Trek een glazen micropipet (scherpe micro-elektrode) met een ~ 0,2 um tip, zoals de weerstand varieert between 50 en 80 MQ eenmaal gevuld met 2 M kaliumacetaat (KAc). </li><li> Plaats de pipet in een speciale houder met een zilver / zilver-chloride (Ag / AgCl) draad op de pipet oplossing voor een intracellulaire versterker (via een hoofd stage). De houder moet een micromanipulator worden bevestigd. Plaats een Ag / AgCl referentie-elektrode op de nekspieren van de rat. </li><li> Langzaam steek de pipet in de hersenen tot aan het gebied van belang en controleer de weerstand door het bewaken van de spanning in reactie op de huidige stappen. Gebruik de buzz (of zap) knop van de versterker naar de pipet te wissen als dat nodig is. </li><li> Gebruik wattenstaafjes of synthetisch absorptie driehoeken aan de craniotomie (zorg dat de ECoG of intracellulaire elektroden niet aan te raken) alvorens te bedekken met silicone-elastomeer of 4% agarose de hersenen bewegingen verminderen drogen. </li><li> Laat de pipet in 1-2 micrometer stappen totdat de weerstand toeneemt bij het naderen van een cel. Maak dan gebruik van de buzz-functie van de versterker te PenetraTÉ in het neuron. </li></ol> 3. Laten de Iso-elektrische staat <ol><li> Voer de betreffende experimentele protocol (bijv afvuren responsen op intracellulair geïnjecteerde stromen, stroom-voltage relaties, sensorische stimuli reacties) in dit stadium tegelijkertijd bewaken van de neuron membraanpotentiaal, de ECoG en fysiologische variabelen. </li><li> Controleer of de intracellulaire elektrode stabiel in de cel door analyse van de stabiliteit van zowel de membraanpotentiaal en de actiepotentiaal van woningen opnamesessie. Zo niet, ga niet naar de volgende stap en wacht tot de opname stabiel wordt weer of zoek een andere neuron. </li><li> Injecteer hoog maar infra-dodelijke dosis natriumpentobarbital via de IP lijn (~ 90 mg / kg, kan zo laag als 35 mg / kg van pentobarbital begintoestand als tot 155 mg / kg van het fentanyl initiële conditie). Opmerking: Binnen 15 - 20 min de intracellulaire en ECoG waveforms moeten vertragen met slecht functionerende elektrische stiltes tot kortstondig bereikt de zogenaamde &quot;burst-suppressie&quot; Het profiel van 37,38, die geleidelijk instort tot een volledige iso-elektrische toestand. Verwacht wordt dat de hartslag vertraagt ​​significant (van ~ 10-20%) maar de SpO 2 en EtCO 2 moet betrekkelijk stabiel blijft. </li><li> Als het isoelektrische toestand niet wordt bereikt, injecteert een kleine hoeveelheid natrium pentobarbital (~ 10% van de dosis stap 3,1). Wacht 15 minuten voor het toevoegen van meer verdovingsmiddel wanneer het iso-elektrische toestand nog niet bereikt. </li><li> Herhaal de experimentele protocol om de impact van het netwerk dynamiek op integratieve eigenschappen van de opgenomen neuron te vergelijken. Noot: Na beëindiging van anesthesie injecties, moet de elektrische hersenactiviteit herstellen volledig binnen 3 tot 4 uur. </li><li> Na afloop van het experiment, injecteer een dodelijke dosis van natriumpentobarbital (200 mg / kg, IP) aan de rat euthanize. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We beschrijven hier een nieuwe methode te onderdrukken in vivo spontane cerebrale elektrische activiteit op zowel het netwerk en cellulaire niveau. Deze procedure leidt tot een extreem hersentoestand zogenaamde coma isoëlektrische 41. Vanuit een klinisch oogpunt, een dergelijke electrocerebral inactiviteit is de meest ernstige afwijking die kan worden gezien op het EEG. Het wordt meestal geassocieerd met een onomkeerbare coma, met alle patiënten ofwel sterven of voortzetten in een persisterende veget...

Bij gebrek aan omgevingsstimuli of gedragstaken, de &quot;rust&quot; brain genereert een continue stroom van elektrische activiteit die kan worden opgenomen van de hoofdhuid, zoals elektro-encefalogram (EEG) golven. De intracellulaire correlaat van deze endogene hersenactiviteit wordt gekenmerkt door achtergrond membraan spanningsvariaties (ook bekend als &quot;synaptische ruis&quot;), die bestaan ​​uit een combinatie van prikkelende en remmende synaptische potentialen die de voortdurende activiteit van afferente netwerken 1,2 weerspiegelen. Deze spontane activiteit varieert in frequentie en amplitude van de verschillende toestanden van waakzaamheid. Ophelderen van de effecten van netwerkactiviteit op de prikkelbaarheid en gevoeligheid van enkele neuronen is een van de grootste uitdagingen van neurosciences 3,4. Veel experimentele en computationele studies hebben de functionele gevolgen van de lopende synaptische activiteit op de integratieve propertie verkends van neuronen. De rol van de verschillende neuronale parameters beïnvloed door de achtergrond ruis synaptische ongrijpbaar. Zo is het gemiddelde niveau van membraandepolarisatie gevonden positief of negatief 5,6 7-9 gecorreleerd met het vermogen van sensorische inputs actiepotentialen activeren. Bovendien, terwijl sommige onderzoeken suggereren dat de schommelingen van het membraan potentieel, als gevolg van een continu variërende stroom van afferente synaptische inputs, sterk van invloed op het reactievermogen van enkele neuronen door het moduleren van de winst van hun input-output relatie 3,10-13, anderen geven aan dat veranderingen in membraan ingang geleiding gemedieerd door remming rangeren volstaan ​​om de neuronale versterking ongeacht de omvang van membraan schommelingen 14,15 moduleren. Tot slot, de recente studies uitgevoerd op wakkere dieren benadrukt hoe de verwerking van sensorische informatie in één neuron kritisch hangt af van de staat van waakzaamheid eennd de huidige gedrags vraag naar 16,17. Een eenvoudige strategie om de functionele rol van een bepaald proces in een sterk onderling verbonden kunnen verduidelijken is om te bepalen hoe de afwezigheid bijzonder de werking van het systeem verandert. Deze werkwijze wordt veelvuldig gebruikt in neurologieonderzoek, bijvoorbeeld met experimentele laesies of inactivering van verschillende hersengebieden 18-21 of farmacologische blokkade van specifieke ionkanalen 22,23. Met name, is het in vivo toegepast onthullen hoe functionele connectiviteit en het netwerk dynamiek invloed op één cel berekening 24-27. Tot dusver lokale manipulaties bedoeld om het afvuren van neuronen blokkeren en / of verstoren de basische biofysische eigenschappen kunnen gedeeltelijk doeltreffend zijn en zijn beperkt tot relatief kleine hersenvolumes 28. Om deze beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we een nieuwe in vivo experimentele aanpak inde rat de elektrofysiologische eigenschappen van afzonderlijke neuronen die in een bepaalde hersentoestand, dwz ingebed in een bepaald netwerk dynamisch, met die verkregen na volledige onderdrukking van de gehele hersenen synaptische activiteit 29 vergelijken. In de controle omstandigheden, kunnen twee afzonderlijke corticale dynamiek worden gegenereerd. Sleep-achtige electrocorticographic (ECoG) patronen werden veroorzaakt door injectie van gematigde doses natrium pentobarbital. Als alternatief zou een snelle ECoG golven van kleine amplitude vergelijkbaar met de corticale activiteit ten grondslag liggen aan de wakende toestand (waak-achtig patroon) worden geproduceerd door injectie van fentanyl. Vervolgens, met behoud van dezelfde ECoG en intracellulaire opname, een volledige inactivatie van endogene hersenen elektrische activiteit werd verkregen door systemische injectie van een hoge dosis natriumpentobarbital, gekenmerkt door isoelektrisch ECoG en intracellulaire activiteiten. Omdat de inductie van een dergelijke extreme comateuze zou kunnen fatale gevolgschadeces op biologische functies, een zorgvuldige en continue monitoring van de fysiologische variabelen was van essentieel belang. Daarom hebben we nauwgezet volgden de hartslag frequentie, de end-tidal CO 2 concentratie (EtCO 2), de O 2 verzadiging (SpO 2) en de kerntemperatuur van de rat gedurende de experimenten. We evalueren enkele neuronen eigenschappen tijdens deze verschillende toestanden met behulp van scherpe micro-elektroden, die bijzonder geschikt zijn voor lange en stabiele opnames in vivo zijn. De hier beschreven procedure kan worden gecombineerd met andere elektrofysiologische en beeldvormingstechnieken en kan worden uitgebreid tot andere diermodellen.

<table><tbody><tr><td>Sodium Pentobarbital</td><td>Centravet</td><td>Pentobarbital</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine 500</td><td>Merial</td><td>Imalg&egrave;ne 500</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl&nbsp;</td><td>Janssen-Cilag</td><td>Fentanyl</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine</td><td>Centravet</td><td>Xylovet</td><td></td></tr><tr><td>Gallamine triethiodide</td><td>Sigma</td><td>G8134</td><td></td></tr><tr><td>ECoG amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>AC amplifier, Model 1700</td><td></td></tr><tr><td>Intracellular amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Axoclamp 900A</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition interface</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>CED power 1401-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Data analysis software</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Spike2 version 7</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Scientifica</td><td>IVM-3000</td><td></td></tr><tr><td>Capillary Puller</td><td>Narishige</td><td>PE-2</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Silver wire 0.125 mm (intracellular recording)</td><td>WPI</td><td>AGT0525</td><td></td></tr><tr><td>Ag-AgCl reference</td><td>Phymep</td><td>E242</td><td></td></tr><tr><td>Silver wire 0.25 mm (ECoG recording)</td><td>WPI</td><td>AGT1025</td><td></td></tr><tr><td>Artificial respiration system</td><td>Minerve</td><td>Alpha Lab</td><td></td></tr><tr><td>Physiological parameters monitoring</td><td>Digicare</td><td>LifeWindow Lite</td><td></td></tr><tr><td>Heating Blanket</td><td>Harvard Apparatus</td><td>507215</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5</td><td>FST</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5SF</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>IP Polyurethane catheter - 0.43x0.69 mm&nbsp;&nbsp;</td><td>Instech</td><td>BTPU-027</td><td></td></tr><tr><td>Silicon elastomere</td><td>WPI</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr><tr><td>Dental drill</td><td>NSK</td><td>Y1001151 and P496</td><td></td></tr><tr><td>Surgical glue</td><td>3M</td><td>vetbond</td><td></td></tr></tbody></table>

inductie van een iso-elektrisch brain staat om de impact van endogene synaptische activiteit op neuronale exciteerbaarheid onderzoek<em&gt; in vivo</em

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

De manier waarop neuronen procesgegevens hangt zowel hun intrinsieke membraan eigenschappen en de dynamiek van de afferente synaptische netwerk. Vooral endogeen aangemaakte activiteit die sterk verschilt echter afhankelijk van de staat van waakzaamheid, moduleert aanzienlijk neuronale berekening. Om te onderzoeken hoe verschillende spontane cerebrale dynamiek invloed integrerende eigenschappen enkelvoudige neuronen, hebben we een nieuwe experimentele strategie bestaat de rat onderdrukken in vivo alle hersenactiviteit door een systemische injectie van een hoge dosis natriumpentobarbital. Corticale activiteiten, continu bewaakt door gecombineerde electrocorticogram (ECoG) en intracellulaire recordings geleidelijk vertraagd, wat leidt tot een stabiele isoelektrisch profiel. Deze extreme hersentoestand schiet de rat in een diepe coma, zorgvuldig gevolgd door meting van de fysiologische constanten van het dier gedurende de experimenten. intracellulaire recordings lieten karakteriseren en vergelijk de integratieve eigenschappen van hetzelfde neuron ingebed in fysiologisch relevante corticale dynamica, zoals aangetroffen in de slaap-waak cyclus, en wanneer de hersenen was volledig stil.

Inducerende en onderhouden van een iso-elektrisch brein staat is een delicate in vivo experimentele procedure. Het is bewezen een krachtig instrument om de impact van corticale netwerkactiviteit op neuronale exciteerbaarheid en overdrachtsfunctie 29 rechtstreeks te bestuderen. Figuur 1 toont de multiparameter monitoren, waaronder ECoG en vitale constanten van fysiologische toestand van het dier vóór (Figuur 1A ) en na (figuur ...

Deze procedure voert langdurige in vivo intracellulaire recordings uit één neuronen in fysiologisch relevante cerebrale staten en na volledige afschaffing van lopende elektrische activiteiten, waardoor een isoelektrisch hersentoestand. De fysiologische constanten van het dier worden zorgvuldig gecontroleerd tijdens de overgang naar de kunstmatige comateuze toestand.

Inductie van een iso-elektrisch Brain staat om de impact van endogene synaptische activiteit op neuronale Exciteerbaarheid Onderzoek<em&gt; In Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Het algemene doel van dit protocol is om in vivo een algemene staat van cerebrale inactiviteit op te wekken om de geïntegreerde eigenschappen van individuele neuronen te bestuderen in afwezigheid van synaptische input. De methode die we hier presenteren kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in de neurofysiologie, zoals het beoordelen van de impact van netwerkactiviteit op de computationele werking van individuele cellen of het bestuderen van de responsiviteit van neuronen in comateuze toestanden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat neuronale eigenschappen in isolatie van het netwerk kunnen worden bestudeerd in een intacte in vivo preparaat.Om met deze procedure te beginnen, plaatst u een volledig geanestheseerde rat op een warmtedeken. Plaats een rectale probe in het dier om de kerntemperatuur rond de 37 °C te handhaven. Om een katheter in de peritoneale holte te plaatsen ter facilitering van de daaropvolgende injectie van anesthetica, verwijdert u eerst het haar over een klein gebied in het rechter- of linkeronderkwadrant van de buik met behulp van ontharingscrème.Steriliseer na het injecteren van het lokale anestheticum de chirurgische plaats en maak met een scherpe schaar een incisie van twee tot drie millimeter in de huid. Verwijder met een botte schaar de vet- en spierlagen totdat de peritoneale holte zichtbaar is. Voer vervolgens ongeveer één tot twee centimeter van een kleine katheter in de holte in en sluit de wond met chirurgische lijm.Maak een lus en hecht de katheter aan de huid om deze op zijn plaats te fixeren. Om een trachealtube te plaatsen voor de beheersing van de ventilatie tijdens kunstmatige beademing, moet het haar worden verwijderd, de plek worden gesteriliseerd en de huid over de trachea vlak boven het manubrium worden ingesneden. Voer een botte dissectie uit van de eerste laag vet en spieren.Schuif de speekselklier opzij en leg de trachea vrij door de laatste spierlaag voorzichtig te dissekeren. Isoleer de trachea zorgvuldig en schuif met een kleine pincet een draad eronderdoor. Maak vervolgens een losse chirurgische knoop met de draad.Maak een transversale incisie in de trachea tussen twee kraakbeenringen. Plaats vervolgens een trachealtube met de juiste diameter en knoop de draad vast om de tube te fixeren. Voor extra stabiliteit kan de draad verder aan een hoger punt van de trachealtube worden bevestigd.Hecht de wond met hechtdraad of gebruik chirurgische nietjes om de wond te sluiten. Plaats het dier vervolgens in een stereotaxisch frame en breng oogzalf aan om uitdroging te voorkomen. Plaats daarna geschikte probes om de fysiologische variabelen te monitoren, zoals het elektrocardiogram, de zuurstofsaturatie in het bloed en de end-tidale CO2-druk.Verwijder daarna het haar op de hoofdhuid en steriliseer de operatielocatie. Maak een longitudinale incisie van twee centimeter en resecteer de bindweefsels over de schedel met een scalpel. Breng vervolgens chirurgische lijm aan op de schedel en de weefsels om de preparatie te stabiliseren.Maak vervolgens met een tandartsboor een kleine craniotomie van 1,5 millimeter diameter boven het gebied van belang. Gebruik daarna een extra fijne pincet en venisschaar om voorzichtig een klein gaatje in de dura te maken. Houd binnen de craniële trepanatie een gebied van 0,5 millimeter vrij om de electrocorticografische elektrode te plaatsen.Zorg ervoor dat de cortex vochtig blijft met 0,9% natriumchloride-oplossing of aCSF. Plaats vervolgens een referentie-elektrode op de contralaterale hoofdhuidspier en plaats een elektrocorticografische elektrode met een lage impedantie op de dura. Stel het kunstmatige ventilatiesysteem zo in dat de ademhalingsfrequentie en het volume vergelijkbaar zijn met die van de spontane ademhaling van de rat.Indien alle fysiologische variabelen en elektrocorticografische patronen binnen de normale waarden liggen, injecteer dan gallamine triethiodide in elk been om het dier te verlammen. Sluit vervolgens de mechanische ventilatie aan op de trachealtube en controleer of de borstkas aan beide zijden correct wordt opgeblazen. Trek bij deze stap een glazen micropipet met een tip van 0,2 micrometer en vul deze met een twee molar kaliumacetaatoplossing.Plaats de pipet in een specifieke houder met een zilver/zilverchloride-draad om de pipetoplossing te verbinden met een intracellulaire versterker. Plaats vervolgens een zilver/zilverchloride-referentie-elektrode op de nekspieren van de rat. Plaats de pipet boven het gebied van belang.Voeg de pipette langzaam in het brein in tot de gewenste diepte, waarbij indien nodig de buzz-knop van de versterker wordt gebruikt om de pipette vrij te maken. Compenseer de pipetteresistentie door de spanningsvallen in reactie op stroomstappen te nulstellen met het brugcircuit van de versterker. Gebruik vervolgens wattenstaafjes of synthetische absorptiedriehoeken om de craniotomie te drogen en bedek deze met siliconenelastomeer of 4% agarose om hersenbewegingen te verminderen.Breng de pipet daarna in stappen van één of twee micrometer naar beneden tot de weerstand toeneemt bij het naderen van een cel. Gebruik de buzz-functie van de versterker om in het neuron te penetreren. Zodra de registratie stabiel is, wordt de elektrodeweerstand gecompenseerd door de bridge-parameter aan te passen terwijl er kleine stroomstappen in het neuron worden geïnjecteerd.Voer vervolgens het passende experimentele protocol uit, zoals het intracellulair injecteren van stroom om intrinsieke eigenschappen van het neuron te extraheren of het uitvoeren van sensorische stimulaties. Injecteer daarna een hoge, maar infralethale dosis natriumpentobarbital via de intraperitoneale lijn. Binnen 15 tot 20 minuten moeten de intracellulaire en elektrocorticografische activiteiten vertragen met intermitterende elektrische stiltes om tijdelijk het zogenaamde burst suppression-profiel te bereiken, dat progressief overgaat in een volledige isoelektrische toestand.Er wordt verwacht dat de hartslag aanzienlijk vertraagt, maar dat de SPO2 en EtCO2 relatief stabiel blijven. Herhaal vervolgens het stimulatieprotocol om de impact van de netwerkdynamica op de integratieve eigenschappen van de geregistreerde neuronen te vergelijken. Na het stopzetten van de anesthetische injecties zou de elektrische hersenactiviteit binnen drie tot vier uur volledig moeten herstellen.Deze figuur toont spontane intracellulaire activiteiten en elektrocorticogramactiviteiten onder twee anesthetische condities, die de corticale dynamiek nabootsen die endogeen wordt gegenereerd tijdens de vroege stadia van de slaap of tijdens het waken. De slaapachtige toestand wordt geïnduceerd door injectie van natriumpentobarbital, en de wakkere toestand door fentanyl. In beide gevallen leidde de daaropvolgende injectie van een hoge dosis natriumpentobarbital tot een volledige afschaffing van de spontane activiteit in het ECOG en de gelijktijdig geregistreerde neuronen, vandaar de term isoelectrisch.Het onderdrukken van de aanhoudende synaptische activiteit leidde tot een significante hyperpolarisatie van het neuronale membraanpotentiaal. Door stroom opgewekte responsen kunnen worden gegenereerd vóór en na de inductie van de isoelectrische toestand. Dit maakt het mogelijk om de invloed van verschillende cerebrale activiteiten op de input-output-overdrachtsfunctie van neuronen te vergelijken, uitgedrukt als de gemiddelde opgewekte vuursnelheid in reactie op stroomstappen van toenemende intensiteit.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het dier in de beste fysiologische conditie moet worden gehouden om opnamegegevens van goede kwaliteit te verkrijgen die geassocieerd zijn met onze betrouwbare cerebrale dynamiek. Deze aanpak kan verder worden ingezet als model om de responsiviteit van neuronen in irreversibele of reversibele diepe comateuze toestanden te bestuderen.

induction-an-isoelectric-brain-state-to-investigate-impact-endogenous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the recording of electrical signals from single brain neurons using a fine-tipped glass micropipette and a specialized setup. The micropipette is carefully inserted into the rat's brain and is buzzed to penetrate the neuron to record internal neuronal electrical signals.

In Vivo Recording of Intracellular Signals from a Single Neuron

Hier maken we een glazen pipette met twee functies: remming van diepe hersenstructuren door micro-injecties van geneesmiddelen en real-time monitoring van hun effecten door gelijktijdige elektrofysiologische opnames.

Gelijktijdig Elektrofysiologische opname en Micro-injecties van remmende middelen in de knaagdierhersenen

Studies hebben aangetoond dat cathodale transcraniële gelijkstroom-stimulatie onderdrukkende effecten kan hebben op geneesmiddelresistente epileptische aanvallen. In deze studie werd een in vitro experimentele opstelling bedacht waarin de gelijkstroom-stimulatie en de multi-elektrode array-registratie van aanvallen-achtige activiteit werden geëvalueerd in een herfsnede-preparaat van muizen. De parameters van de gelijkstroom-stimulatie werden geëvalueerd.

Direct-current stimulatie en multi-elektrode Array Registratie van Inbeslagneming-achtige activiteit in de muizen Brain Slice Voorbereiding

We presenteren methoden voor de constructie van elektroden om gelijktijdig extracellulaire neurale activiteit op te nemen en meerdere neuroactieve stoffen in de buurt van de opnameplaatsen bij wakkere muizen vrij te geven. Deze techniek maakt de gedetailleerde analyse van veronderstelde lokale synaptische input naar de belangrijke neuron mogelijk.

Extracellulaire van neuronale activiteit Gecombineerd met Microiontophoretic Toepassing van neuroactive stoffen in Awake Muizen

We illustreren hoe u opnemen en elektrische modulatie van 4-aminopyridine-geïnduceerde epileptiform activiteit in knaagdier hersenen segmenten met behulp van micro-elektrode arrays. Een aangepaste opname-kamer onderhoudt weefsel levensvatbaarheid in langdurige experimentele sessies. Leven van de elektrode toewijzing en selectie van stimulerende paren worden uitgevoerd door een aangepaste grafische gebruikersinterface.

Opname en moduleren van Epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes gekoppeld aan micro-elektrode Arrays

Acute inbeslagneming modellen zijn belangrijk voor de studie van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de epileptiform gebeurtenissen. Bovendien biedt de mogelijkheid om het genereren van epileptiform evenementen op afroep een zeer efficiënte methode om te bestuderen van de exacte volgorde van de gebeurtenissen ten grondslag liggen aan hun inleiding. Hier beschrijven we de acute 4-aminopyridine corticale inbeslagneming modellen gevestigd in muis en menselijk weefsel.

Generatie en On-Demand inleiding van Acute Ictale activiteit in knaagdier en menselijk weefsel

Hersenstam Evoked Response audiometrie is een belangrijk hulpmiddel in de klinische neurofysiologie. Tegenwoordig is Brain stem Evoked Response audiometrie ook toegepast in de basiswetenschap en preklinische studies waarbij zowel farmacologische als genetische diermodellen betrokken zijn. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van hoe auditieve hersenstam reacties met succes kunnen worden opgenomen en geanalyseerd in muizen.

Data-acquisitie en analyse in hersenstam evoked respons-Audiometrie bij muizen

Ex vivo hersenplakken kunnen worden gebruikt om de effecten van vluchtige anesthetica op opgeroepen reacties op afferente inputs te bestuderen. Optogenetica wordt gebruikt om zelfstandig thalamocorticale en corticocorticale afferente stoffen te activeren voor niet-primaire neocortex, en synaptische en netwerkresponsen worden gemoduleerd met isofluraan.

Optogenetische activering van afferente paden in hersenplakken en modulatie van reacties door vluchtige anesthetica

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

We beschrijven een protocol voor het beoordelen van dosis-responscurves voor extracraniële stimulatie in termen van elektrische veldmetingen van de hersenen en een relevante biomarker-cerebrale bloedstroom. Aangezien dit protocol invasieve elektroden in de hersenen plaatst, is algemene anesthesie nodig, waarbij spontane ademhaling de voorkeur heeft boven gecontroleerde ademhaling.

Plaatsing van extracraniële stimulerende elektroden en meting van cerebrale bloedstroom en intracraniële elektrische velden bij verdoofde muizen

Hier beschrijven we een protocol voor het induceren van langetermijn plasticiteit van neuronale intrinsieke prikkelbaarheid in relaisneuronen van de dorsale laterale geniculate kern, bewaard in ex vivo hersensneden.

Het induceren van langdurige plasticiteit van intrinsieke neuronale prikkelbaarheid in neuronen van de dorsale laterale geniculate nucleus

Leer hoe je een iso-elektrische hersentoestand induceert om neuronale exciteerbaarheid in vivo te onderzoeken zonder synaptische input. Deze methode isoleert intrinsieke neuronale eigenschappen.

Inductie van een iso-elektrisch Brain staat om de impact van endogene synaptische activiteit op neuronale Exciteerbaarheid Onderzoek In Vivo (Video) | JoVE Journal

Inductie van een iso-elektrisch Brain staat om de impact van endogene synaptische activiteit op neuronale Exciteerbaarheid Onderzoek

Meer video's verkennen