Kwantitatieve fundus autofluorescentie voor de beoordeling van Netvliesaandoeningen
11 maart 2016
Het retinale pigmentepitheel (RPE) ondersteunt de sensorische retina door het recyclen van bijproducten van de visuele cyclus, die zich ophopen als lipofuscine. Deze producten zijn autofluorescent en kunnen kwalitatief in vivo worden geïmaged. Hier beschrijven we een methode om RPE lipofuscine kwantitatief te beeldvormen met behulp van confocale scanlaser oftalmoscopie.
Het algemene doel van kwantitatieve autofluorescentie, of qAF, is om het algemene niveau van lipofuscine in de ondersteunende cellen van het netvlies, het retinale pigmentepitheel of RPE, te evalueren in zowel gezonde als zieke ogen. Deze techniek kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in de retinale celbiologie, zoals hoe de gezondheid van het retinale pigmentepitheel samenhangt met de ontwikkeling van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, of AMD. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de bepaling van absolute niveaus van lipofuscine-autofluorescentie in de fundus mogelijk maakt, en dus een kwantitatief en reproduceerbaar vervolgonderzoek tussen patiënten, tussen beeldvormingssessies van patiënten en in grote studiepopulaties.
Voor het maken van beelden, moet de confocale scanlaser of CSLO volgens de instructies van de fabrikant worden ingesteld voor data-acquisitie. Om een interne fluorescente referentie te monteren, die bij de fabrikant wordt gekocht, draait u het objectief om het te verwijderen, schroeven de metalen ring van de machine los en vervangt deze door de nieuwe metalen ring met de referentie. Het is essentieel dat de pupillen minimaal 6 mm worden verwijd om een ononderbroken doorgang van licht mogelijk te maken.
Met 0,5% tropicamide en 2,5% phenylephrine, worden de pupillen van de patiënt minimaal 6 mm verwijd, wat essentieel is voor een ononderbroken doorgang van licht om het fundus te zien en te meten. Plaats de patiënt correct op de CSLO met de kin op de kinsteun, de voorhoofd tegen de voorhoofdsteun en de laterale canthi goed uitgelijnd met de indicatoren. Om basisbeelden te verkrijgen, beeldt u eerst het fundus af met nabij-infraroodreflectie of IR-licht om de camera over de macula te centraliseren en een ruwe focus te verkrijgen.
Met de patiënt correct gepositioneerd, schakelt u de hardware-instelling op het controlepaneel naar de IR-beeldvormingsmodus, positioneert u de camera handmatig totdat de fundus volledig scherp staat en maakt u een foto. Pas de instelling op het controlepaneel aan naar IROCT, dat gebruik maakt van spectrale domein optische coherentietomografie of SDOCT, in combinatie met IR-beeldvorming, om de macula te evalueren op onderliggende ziekte. Gebruik de gidsen in het beeldvormingsvenster om de OCT correct te oriënteren op het IR-beeld van de fundus.
Om optimale SDOCT-kwaliteit te bereiken, plaatst u de camera zodanig dat de OCT-afbeelding zich in de bovenste derde van het beeldvormingsvenster bevindt. Verwerft u ten minste een horizontale lijnscan door de fovea, en over het hele beeldveld. Om qAF-beeldvorming in te stellen, gebruikt u hogesnelheidsbeeldverwerving, die het risico op signaalverlies door beweging van de patiënt en blokkering van licht door de iris of oogleden vermindert.
Gebruik het Gemiddelde van 9 frames, dat snel en sequentieel negen beeldframes vastlegt die vervolgens worden gemiddeld om ruis en artefacten te verminderen. Kies een veld van 30 x 30 graden, dat verwijst naar de graden van het retinale gebied dat tijdens beeldacquisitie wordt vastgelegd. Nadat u de patiënt heeft gewaarschuwd voor het blauwe licht, zet u de AF-modus aan en richt u de camera-as uit zodat het scherm maximaal is gevuld met fundus AF, met minimale verduistering van de zijden en hoeken van het beeld. Als patiënten moeite hebben met het tolereren van het felle blauwe licht, beweegt u de camera verder weg van het oog om met beeldvorming te beginnen, en brengt u de camera langzaam naar de patiënt tot de fundus volledig in beeld is. Stel de camera-uitlijning aan met behulp van de oftalmoscoopjoystick, door de CSLO te verplaatsen om de camera te herpositioneren, zodat het AF-signaal op het hoogste niveau in het hele veld staat, in plaats van het scherpste beeld te bereiken. Tijdens beeldacquisitie geven gekleurde pixels die zichtbaar zijn in de interne referentie of het fundus oververzadiging aan, en dus verlies van signaal.
Stel de retina bloot aan AF-licht gedurende minimaal 20 seconden om de absorptie van licht door rodopsine in de sensorische retina tijdens de beeldvorming te minimaliseren. Gebruik deze periode om de camera-uitlijning, focus en gevoeligheid te optimaliseren. Laat de proefpersonen voor elke beeldacquisitie knipperen, omdat een frisse traanfilm de signaalkwaliteit verbetert.
Vermijd oogleden in het vlak van acquisitie en neem het beeld op. Het is belangrijk om ten minste twee hoogwaardige beelden per beeldvormingssessie te genereren voor gegevensanalyse. Voer post-beeldverwerking uit door de CSLO-software te gebruiken om het gemiddelde van de negen frames te berekenen, om de signaal-ruisverhouding te verhogen.
Voer de beeldanalyse uit volgens het tekstprotocol. Zoals hier getoond, wordt in gezonde ogen AF uitgestoten door het RPE relatief uniform over de fundus verdeeld. Verminderde intensiteit wordt gezien in de centrale maculaire regio als gevolg van het blokkeren van licht door maculaire pigment, en aan de zijden en hoeken vanwege de optica van het oog en de camera.
Vaten moeten donker en helder zijn. Deze figuur vertegenwoordigt een corresponderende warmtekaartpresentatie van de qAF-niveaus van deze figuur. Koelere kleuren komen overeen met gebieden met lagere AF-intensiteit, terwijl warmere kleuren overeenkomen met gebieden met hogere AF-intensiteit.
Maximale intensiteit wordt over het algemeen gezien in de tweede concentrische achtsegmentenring, en de gemiddelde intensiteiten in dit gebied worden gebruikt voor de meeste gegevensanalyse. Hier getoond is een representatieve analyse van het oog met AMD, die geografische atrofie demonstreert, een gevorderde vorm van AMD. Deze vorm van AMD resulteert in gelokaliseerde gebieden van RPE-verlies, aangetoond door merkbaar verminderde of afwezige AF, en veroorzaakt progressieve centraal zichtverlies.
Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om zorgvuldig kandidaatpatiënten te selecteren en reproduceerbaar hoogwaardige beelden te verkrijgen om de gegevenskwaliteit te maximaliseren. Het gebruik van deze procedure kan zorgen voor de longitudinale follow-up van de gezondheid van het netvlies
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel bespreekt een methode voor kwantitatief beeldvorming van lipofuscine in het retinale pigmentepitheel (RPE) met behulp van confocale scannende laser oftalmoscopie (CSLO). De techniek is bedoeld om lipofuscineniveaus te evalueren in zowel gezonde als zieke ogen, wat bijdraagt aan ons begrip van retinale celbiologie.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oftalmologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Het RPE ondersteunt het sensorische netvlies door bijproducten van de visuele cyclus te recyclen.
- Accumulatie van lipofuscine kan wijzen op cellulaire gezondheid.
- Begrip van lipofuscineniveaus is cruciaal voor het bestuderen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD).
- Kwantitatieve beeldvorming maakt reproduceerbare beoordelingen mogelijk tussen patiënten en studies.
Doel van de studie
- Om kwantitatief de lipofuscineniveaus in het RPE te beoordelen.
- Om de relatie tussen RPE-gezondheid en AMD-ontwikkeling te onderzoeken.
- Om een betrouwbare beeldvormingstechniek te vestigen voor klinische en onderzoekstoepassingen.
Gebruikte methoden
- Confocale scannende laser oftalmoscopie (CSLO) setup en kalibratie.
- Gebruik van een interne fluorescente referentie voor nauwkeurige metingen.
- Uitbreiden van de pupillen tot minstens 6mm voor optimale lichtdoorgang.
- Kwantitatieve autofluorescentie beeldvorming van de fundus.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van lipofuscineniveaus in verschillende oogcondities.
- Vestiging van baseline autofluorescentieniveaus voor vergelijking.
- Demonstratie van de reproduceerbaarheid van de techniek over beeldvormingssessies heen.
- Inzichten in de rol van lipofuscine in retinale gezondheid en ziekte.
Conclusies
- Kwantitatieve beeldvorming van lipofuscine is een waardevol hulpmiddel in retinale onderzoek.
- Deze methode verbetert ons begrip van RPE-functie en pathologie.
- Verdere studies kunnen deze techniek gebruiken om AMD en andere retinale ziekten te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative fundus autofluorescence (qAF) enables reproducible, absolute measurement of retinal pigment epithelium (RPE) lipofuscin levels, providing a biomarker for cellular stress and degeneration in preclinical models of retinal disease. This approach supports target validation by correlating RPE functional status with sensory retina integrity, informing mechanistic de-risking in ophthalmology discovery programs. The technique enhances predictive confidence in lead identification by enabling longitudinal tracking of pathological progression in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying lipofuscin accumulation as a readout of RPE phagocytic and lysosomal function in disease models.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized, reproducible assessment of RPE health across experimental conditions and timepoints.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking RPE lipofuscin levels to photoreceptor stress and degeneration, informing target confidence in preclinical validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated retinal models for downstream compound screening by establishing baseline lipofuscin levels and detection thresholds.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via internal fluorescent reference calibration and controlled imaging parameters.
- Scalability Value: Facilitates high-throughput applicability through rapid frame averaging and standardized field-of-view acquisition for large study populations.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains translational continuity by linking RPE lipofuscin patterns to outer retina structural changes, supporting biomarker-aligned disease modeling.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through quantitative, longitudinal tracking of degeneration progression in preclinical studies.
- Predictive Value: Enhances mechanistic de-risking by providing objective, correlative data on RPE functional decline preceding photoreceptor loss.
Pipeline & Workflow Integration
Quantitative autofluorescence integrates into the ophthalmology discovery continuum from early target validation through preclinical efficacy assessment, enabling data-driven go/no-go decisions based on RPE health metrics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying lipofuscin as a functional readout of RPE metabolic and lysosomal activity.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, noise-reduced imaging via mean-of-9-frames acquisition and standardized 30x30 degree field imaging.
- Analytics: Generates quantitative lipofuscin intensity maps and regional mean values (e.g., second concentric ring) for comparative analysis across conditions and longitudinal studies.
- Translational Research: Connects RPE lipofuscin metrics to sensory retina integrity, enabling preclinical continuity when structural and functional biomarkers align.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across disease models (e.g., AMD, inherited retinopathies) due to standardized calibration and imaging protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RPE-photoreceptor crosstalk.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via internal reference use, pupil dilation control, and consistent image acquisition parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on quantifiable RPE stress biomarkers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through longitudinal, reproducible tracking of degeneration progression in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ophthalmic imaging and confocal scanning laser ophthalmoscopy operation.
- Dependent on CSLO instrumentation with autofluorescence mode and internal fluorescent reference compatibility.
- Necessitates cross-team standardization for pupil dilation protocols (0.5% tropicamide, 2.5% phenylephrine) and imaging session consistency.
- Involves adaptation considerations across model species due to variations in fundus anatomy, lipofuscin fluorescence, and pupil size.
- Limited by signal saturation risk from prolonged blue light exposure and media opacity, requiring careful exposure timing and blink protocols.
