Driedimensionale Biomimetic Technologie: Novel Biorubber Creëert Defined micro- en macro-schaal Architectures in Collageen Hydrogels
12 februari 2016
Er is een innovatieve biofabricagetechniek ontwikkeld om driedimensionale constructies te engineeren die lijken op de architecturale kenmerken, componenten en mechanische eigenschappen van in vivo weefsel. Deze techniek beschikt over een nieuw ontwikkeld opofferbaar materiaal, BSA-rubber, dat gedetailleerde ruimtelijke kenmerken overdraagt en de in vivo architectuur van een grote verscheidenheid aan weefsels reproduceert.
Het algemene doel van dit protocol is om driedimensionale collageenschalen te ontwerpen die de architectonische kenmerken, samenstelling en mechanische eigenschappen van in-vivo weefsel kunnen nadoen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van weefselengineering te beantwoorden, zoals ECM-celinteracties, de invloed van architectonische kenmerken bij het creëren van geëngend weefsel en de ontwikkeling van weefselvervangingen, onder andere. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een haalbare procedure biedt om de microgeometrie van interne stroomkanalen en paden met hoge nauwkeurigheid na te bootsen in een biologisch afbreekbaar materiaal.
Het uitvoeren van de procedure zal worden gedemonstreerd door Veronica Rodriguez-Rivera, een post-doctoraal medewerker in mijn laboratorium. De materialen die worden gebruikt om de BSA-rubber voor te bereiden, moeten worden bewaard en koud worden gehouden totdat ze klaar zijn voor gebruik, zodat de BSA-rubber niet voortijdig hard wordt. Steriliteit is ook erg belangrijk voor deze procedure.
Steriliseer eerst de dispenser. Leg in een niet-celcultuurkap de O-ringen, de spuit, het dopje, de mixtip en de vier-naar-één dispenser. Steriliseer deze materialen gedurende 30 minuten met UV.
Schroef eerst de twee roestvrijstalen malstukken aan elkaar en bevestig de Luer-lock. Voordat de dispenser wordt geassembleerd, spuit pipetten en reagentia voorafgaand aan het introduceren in de kap met 70% ethanol. Bevestig eerst de tipcap op de oplossingshouder.
Laad vervolgens de 30% BSA-oplossing in de grotere kamer zonder de andere kamer te besmetten. Laat genoeg ruimte over om de O-ring te bevestigen. Laad vervolgens de kleinere dispenserkamer met drie procent glutaaraldehyde en bevestig een andere O-ring.
Bevestig nu de spuit aan de dispenser. Kantel vervolgens de assemblage zodat de dop bovenaan staat en vervang de dop door een mengingstip. Tik vervolgens zachtjes op de zijden om de luchtbellen omhoog te laten reizen.
Plaats vervolgens de dispenser in een geautoclaveerde zak om de uitlaatvloeistof te bevatten. Spuit in de zak, met de dispenser rechtop, een kleine hoeveelheid oplossing om alle lucht uit de spuit te verwijderen. Het verwijderen van lucht is erg belangrijk.
Verbind vervolgens snel de Luer-lock van de roestvrijstalen Y-mal met de spuittip. Met de mal in uw niet-dominante hand, wissel het uitzetten van oplossing in de linker en rechter uitlaat van de uitstroomkanalen af. Druk op de uitlaat en vul zo de interne holten met oplossing.
Plaats vervolgens de mal horizontaal en injecteer deze met meer oplossing totdat de helft van het dispenservolume is gebruikt. De mal moet nu in een schaal worden geplaatst, in parafilm worden gewikkeld en een nacht bij vier graden Celsius worden bewaard. Deze procedure is geschaald naar vier gram geacidificeerd collageen.
Bewaar het gekoeld totdat het wordt gebruikt. Nadat het collageen is gewogen, gaat u verder met het steriliseren van de oplossing door middel van gammastraling. Maak ter voorbereiding verse 0,2 normale HEPES-oplossing in water.
Breng vervolgens de inhoud over in een conische buis van 50 milliliter. Pas de pH aan op negen met behulp van geconcentreerd natriumhydroxide. Zorg ervoor dat u de kap met UV steriliseert en de forceps, spatel en scalpel autoclaveert.
Meng in de kap 1,5 milliliter van de HEPES-oplossing met 1,5 milliliter van 10x MEM. Bewaar deze mix op ijs. Koel ook een 12-putjesplaat en een 20 milliliter spuit gedurende 10 minuten in de vriezer.
Voor extra steriliteit spuit u de betrokken buizen en platen in met 70% ethanol voordat u ze in de kap plaatst. Spuit de malplaat in en plaats deze in de kap. Verwijder vervolgens de BSA-rubber mallen met forceps.
Snijd vervolgens de uitlaatkanalen van de mal af met een scalpel. Vortex vervolgens kort de HEPES-MEM mix en voeg een milliliter toe aan het collageen. Meng vervolgens de oplossing grondig met een steriele spatel.
Volg met een korte vortex en breng de oplossing snel over naar de koude 20 milliliter spuit. Terwijl u de BSA-rubber in de put vastzet, giet u de helft van de collageenhydrogeloplossing in de putbodem. Gebruik vervolgens pincetten om de mal te positioneren zodat de rubberen in- en uitlaatuiteinden de wanden van de put raken.
Bedek vervolgens de mal met collageenhydrogel. Verzegeld nu de put met parafilm en laad de plaat in een incubator van 37 graden Celsius. Laat een uur staan om het collageen te laten polymeriseren.
Zorg er tijdens deze tijd voor dat het UV-licht in de kap aan staat. Stel ook het UV-crosslinkingapparaat in om 630.000 microjoule per vierkante centimeter af te geven. Spuit vervolgens uw behandschoende handen af met 70% ethanol en laad de plaat met de met collageen bedekte mallen in de crosslinker en start het bestralingsproces.
Na de bestraling, spuit u uw handschoenen opnieuw en ontlaadt u de plaat uit de crosslinker. Verwijder vervolgens met een steriele spatel het gel uit de put, draai het om en crosslink de onderkant van het hydrogel. Na de laatste crosslinkingcyclus, gaat u verder met de enzymdigestie.
Gebruik steriele 0,25% trypsin-oplossing bij pH 7,8 om de BSA-rubber te verwijderen zonder het collageenschaal te verstoren en pers deze door een 0,20 micron filter. Breng voldoende gefilterde trypsin-oplossing over in een nieuwe conische buis van 50 milliliter. Breng vervolgens het collageenhydrogel over in de conische buis die de enzymoplossing bevat.
Zorg ervoor dat het hydrogel volledig bedekt is met de oplossing. Sluit de buis met parafilm en vortex het zachtjes gedurende ongeveer een minuut. Incubeer vervolgens de buis bij 30 graden Celsius en laat de digestie 15 tot 24 uur doorgaan.
Verwijder de buis gedurende de eerste vier uur elke 15 tot 30 minuten en vortex deze voorzichtig om de BSA-rubber digestie te helpen voltooien. De volgende dag wordt de digestie als voltooid beschouwd wanneer er geen rubber in de oplossing drijft of er geen afgebroken stukken rubber in het hydrogel zijn.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een innovatieve biofabricatietechniek voor het ontwikkelen van driedimensionale collageenscans die de architecturale kenmerken en mechanische eigenschappen van in vivo weefsel nabootsen. De methode maakt gebruik van een nieuw ontwikkeld offermateriaal, BSA-rubber, om de microgeometrie van diverse weefsels nauwkeurig te reproduceren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Tissue engineering
- Biofabricage
- Ontwikkeling van scaffolds
Achtergrond
- De studie richt zich op de behoefte aan realistische weefselmodellen in het onderzoek.
- Het onderzoekt de interacties tussen ECM en cellen en hun betekenis in engineered weefsels.
- De techniek beoogt de getrouwheid van weefselvervangingen te verbeteren.
- Het handhaven van steriliteit en een juiste opslag van materialen is cruciaal voor het succes.
Doel van de studie
- Het ontwerpen van scaffolds die nauw lijken op in vivo weefsel.
- Het onderzoeken van de invloed van architecturale kenmerken op weefselkweek.
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het creëren van biologisch afbreekbare scaffolds.
Gebruikte methoden
- Bereiding van BSA-rubber onder gecontroleerde omstandigheden.
- Gebruik van een offermateriaal voor gedetailleerde overdracht van ruimtelijke kenmerken.
- Demonstratie van de procedure door een getrainde postdoctoraal onderzoeker.
- Waarborgen van steriliteit en juiste opslag van materialen.
Belangrijkste resultaten
- De techniek reproduceert met succes de microgeometrie van weefsels.
- Er werd een hoge getrouwheid bereikt bij de creatie van interne stroomkanalen.
- De resultaten wijzen op potentiële toepassingen in tissue engineering en weefselvervangingen.
- Het belang van materiaalbehandeling in het proces werd aangetoond.
Conclusies
- Deze methode biedt een levensvatbare aanpak voor uitdagingen binnen de weefseltechnologie.
- Het vergroot het inzicht in ECM-interacties in genetourde weefsels.
- De bevindingen kunnen leiden tot vorderingen in technologieën voor weefselvervanging.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze biofabricatietechniek maakt een nauwkeurige replicatie van de weefselmicroarchitectuur in collageenhydrogels mogelijk, waarmee een kritisch hiaat in de getrouwheid van preklinische modellen wordt opgevuld. Door een schaalbare methode te bieden voor het engineeren van gedefinieerde kanalen op micro- en macroschaal, ondersteunt het de mechanistische risicoreductie bij de ontwikkeling van weefselgerichte therapieën. De aanpak verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid bij het evalueren van interacties tussen geneesmiddelen en weefsels binnen fysiologisch relevante 3D-omgevingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om te onderzoeken hoe architecturale kenmerken de interacties tussen de ECM en cellen en de activering van signaalpaden beïnvloeden in ziekterelevante systemen.
- Operationele waarde: Biedt reproduceerbare scaffold-geometrieën voor consistente validatie-assays van doelwitten over verschillende experimentele batches heen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde collageensteigers met kwantificeerbare kanaaldimensies voor betrouwbare screening van verbindingen in biomimetische omgevingen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie van assays via opofferingsmatrijzen, waardoor de variabiliteit in microfluïdische weefselmodellen wordt verminderd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Vergemakkelijkt de studie van perfusie- en transportverschijnselen in scaffolds die de in vivo weefselarchitectuur nabootsen, waardoor de translationele relevantie van biomarkers wordt verbeterd.
- Operationele waarde: Maakt preklinische continuïteit mogelijk door scaffolds te creëren met gedefinieerde geometrieën die geschikt zijn voor longitudinale studies naar weefselrijping.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in vroege ontdekkingsworkflows door instelbare, biologisch afbreekbare scaffolds te bieden die een brug slaan tussen eenvoudige 2D-modellen en complexe organoïden, ter ondersteuning van hypothese-gedreven targetvalidatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt het mechanistisch verminderen van risico's door gecontroleerd testen mogelijk te maken van hoe de architectuur van het scaffold cellulaire responsen op therapeutische kandidaten moduleert.
- Screening: Levert reproduceerbare, architectonisch gedefinieerde hydrogels voor kwantitatieve beoordeling van compoundpenetratie en target engagement.
- Analytics: Maakt nauwkeurige meting van kanaaldimensies (bijv. 3 mm en 4 mm) en structurele integriteit tot 300 microns mogelijk, wat objectieve morfometrische read-outs oplevert.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij de preklinische continuïteit door scaffolds te genereren waarvan de architectonische kenmerken gecorreleerd kunnen worden met functionele weefseluitkomsten.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een platformcapaciteit voor het genereren van gestandaardiseerde weefselnabootsingen over meerdere projecten heen via CAD-ontworpen mallen en BSA-rubbergieten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in tissue-engineered modellen door architecturale variabelen te isoleren in ECM-cel-signaleringsstudies.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde BSA-rubberfabricage en enzymatische verwijdering, waardoor variabiliteit tussen batches wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door data te leveren uit scaffolds die de in vivo weefselbeperkingen op geneesmiddeldistributie en celgedrag beter nabootsen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van therapeutica mogelijk op basis van prestaties in architecturaal gedefinieerde, ziekterelevante systemen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met biomaterialen, steriele technieken en de optimalisatie van enzymatische digestie.
- Afhankelijk van toegang tot CAD-software, precisiegietapparatuur (bijv. Microlution) en gecontroleerde incubatie-/crosslinkingsystemen.
- Vereist cross-team standaardisatie van het ontwerp van de mal, de bereiding van BSA-rubber en de collagen hydrogel-protocollen voor reproduceerbaarheid.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het overdragen van de techniek naar verschillende collagen-concentraties of alternatieve natuurlijke polymeren.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak voor koude opslag van BSA-rubberprecursoren en verlengde digestietijden (15–24 uur) voor volledige verwijdering van het offermateriaal.
