Weefsel karakterisering na een New Uitsplitsing Methode voor de huid Micro-Enten Generation

Het algemene doel van deze chirurgische uitvinding is het produceren van autologe huidmicrotransplantaten die onmiddellijk tijdens dezelfde operatie kunnen worden gebruikt voor wondgenezing. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de regeneratieve geneeskunde en huidweefselengineering over zaken als chronische wondgenezing, brandwonden en posttraumatische ulcera. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze zeer eenvoudig kan worden toegepast door artsen zonder gespecialiseerde technieken, en dat het snel en betaalbaar is.

Begin met het verzamelen van huidmonsters van een patiënt met behulp van een biopsietpons. Verwijder vervolgens de epitheellaag en gooi deze weg. Combineer elk weefselmonster met 1 milliliter zoutoplossing om autologe microtransplantaten te genereren.

Om biocomplexen voor klinische toepassing voor te bereiden, brengt u 1 milliliter van de micro-graft-oplossing over op collageensponzen. Breng het biocomplex onmiddellijk aan op het beschadigde gebied van de patiënt. Test de levensvatbaarheid van het biocomplex in vitro.

Giet na drie dagen cultuur 0,3% formaline direct over de biocomplexen en fixeer deze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik een microtoom om coupes van 5 micrometers dik te snijden en monteer deze direct op een glazen objectglas. Plaats de coupes vervolgens gedurende drie minuten in 15 tot 20 milliliters xyleen.

Dompel de coupes vervolgens gedurende elk een uur onder in afnemende concentraties ethanol voordat ze in gedeïoniseerd water worden geplaatst om de coupes te deparaffineren en te rehydrateren. Gebruik daarna 1 tot 2 milliliters van 1 gram per liter hematoxylin gedurende één tot twee minuten om de coupes te kleuren. Breng ze vervolgens over naar water om de kleurstof af te spoelen.

Voeg nu 1 tot 2 milliliter 1% Eosine Y en 70% ethanol toe en verdun dit in water, en kleur de coupes gedurende vier tot vijf minuten. Spoel de coupes vervolgens af met stromend kraanwater. Dompel de coupes telkens een uur lang onder in oplossingen met toenemende ethanolconcentraties, gevolgd door een incubatie van één uur in xyleen.

Breng tot slot een basisch montagemedium aan op de monsters voordat u een dekglas plaatst. Observeer deze vervolgens onder een lichtmicroscoop bij een vergroting van 100x. Neem met een dermatoom papillaire, dode of dermale monsters met een dikte van respectievelijk 0,6 millimeter, 1 millimeter of 0,2 millimeter uit de rompgebieden van vier multi-tissue donoren in de leeftijd van 40 tot 55 jaar, conform de nationale regels voor weefselwinning.

Plaats de monsters in 0,9% NaCl en zet ze vijf minuten op een orbitale schudmachine om het weefsel voorzichtig te spoelen. Maak met een biopsietang van 5 mm monsters met een uniforme diameter van het huidweefsel, respectievelijk epidermis en dermis, en weeg alle weefselmonsters. Plaats vervolgens acht, drie of vier uniforme monsters van huidweefsel, respectievelijk epidermis of dermis, in de weefseldisruptor en voeg 1,5 ml zoutoplossing toe voor de disaggregatie.

Voer de disaggregatie uit voor alle weefselmonsters zoals aangegeven in deze tabel. Gebruik een overeenkomstig aantal punchbiopten afgeleid van intacte weefselmonsters als controles. Aspireer na mechanische disaggregatie de zoutoplossing die de micro-transplantaten bevat en plaats elk monster afzonderlijk in een enkele put van een 12-wellplaat.

Voeg 1 milliliter RPMI-1640-medium, aangevuld met 10% FBS en antibiotica, toe aan elk monster. Om de cellevensvatbaarheid te evalueren, wordt aan elke put 1 milliliter medium toegevoegd dat 0,5 milligram per milliliter MTT-oplossing bevat, waarna er wordt geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2 gedurende drie uur. Verwijder na de incubatie het MTT-medium en vervang dit door 1 milliliter DMSO.

Na een incubatie van 10 minuten wordt elk monster in DMSO overgebracht naar een cuvet, waarna met een spectrofotometer de optische dichtheid bij 570 nanometer wordt gemeten. Bereken de celviabiliteit als de verhouding tussen de absorbentie bij 570 nanometer en het gewicht in grammen van het gebruikte weefsel vóór de disaggregatie. Zodra de zoutoplossing uit het huidweefsel is geaspireerd, worden de epidermis- en dermis-monsters van een enkele donor afzonderlijk geplaatst in een well van een 12-well plaat voor een celviabiliteitstest of in een kweekfles voor morfologische analyse.

Voeg 1 milliliter RPMI-1640 met 10% FBS en antibiotica toe aan de 12-well plaat of 5 milliliter aan de kweekfles en kweek gedurende respectievelijk 24 uur of zeven dagen bij 37 °C en 5% CO2. Voer na 24 uur een morfologische analyse uit met behulp van lichtmicroscopie door de aanwezigheid van cel-suspensie te evalueren. Herhaal dit op dag zeven.

Analyseer met FACS-analyse de dermis-monsters op mesenchymale en hematopoëtische celmarkers, zoals CD146, CD34 en CD45. Voeg medium toe aan de gedisaggregeerde cellen en incubeer deze vervolgens gedurende drie dagen bij 37 °C. Beoordeel de steriliteit van het weefsel door een microbiologische analyse uit te voeren zoals eerder beschreven.

Zoals hier wordt getoond, werden menselijke autologe microtransplantaten die direct op een collageondrager waren geplaatst, geïmplanteerd in een laesie aan het been. Na 30 dagen werd een volledige re-epithelialisatie waargenomen in combinatie met weefselherstel. Bovendien toonde de klinische follow-up na vijf maanden een goede textuur en zachtheid van het beschadigde gebied aan.

Zoals in deze tabel vermeld, zijn drempelwaarden vastgesteld van acht, vier en drie biopten die in één stap kunnen worden verwerkt, en de weefsels werden op vier verschillende tijdstippen gedisaggregeerd om de optimale disaggregatiecondities te identificeren voor het behoud van een goede celviabiliteit. De mechanische disaggregatie die in deze video wordt gedemonstreerd, behoudt een gemiddelde waarde van 30% celviabiliteit in alle huidmonsters, zowel epidermis als dermis, wanneer dit op verschillende tijdstippen wordt geëvalueerd ten opzichte van intact weefsel. Deze grafiek laat zien dat er na 24 uur, of zeven dagen in cultuur, geen substantiële variatie in de celviabiliteit van huidweefselmonsters werd waargenomen op het moment van homogenisatie in cultuur vergeleken met het startmoment.

Er werd echter een verminderde levensvatbaarheid van dode monsters waargenomen na 24 uur in cultuur vergeleken met het startpunt. De cellevensvatbaarheid werd echter na zeven dagen in cultuur hersteld. Vergelijkbare resultaten werden waargenomen voor de dermis.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in vijf minuten worden uitgevoerd mits dit correct gebeurt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de epitheellaag van de huid moet worden verwijderd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals de desaggregatie van botweefsel, worden uitgevoerd om andere vragen te beantwoorden, zoals het mechanisme van botgenezing.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van regeneratieve geneeskunde en weefseltechnologie om weefselgenezing bij patiënten te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deze micro-transplantatieprocedure uitvoert. Vergeet niet dat het werken met weefsel uiterst gevaarlijk kan zijn.

En er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van een veiligheidsbril, bij het uitvoeren van deze procedure.