Weefsel karakterisering na een New Uitsplitsing Methode voor de huid Micro-Enten Generation

Het algemene doel van deze chirurgische uitvinding is om autologe huid micro-grafts te produceren die direct gebruikt kunnen worden in dezelfde operatie voor wondgenezing. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van regeneratieve geneeskunde en huidweefsel engineering over zaken zoals chronische wondgenezing, brandwonden en posttraumatische ulcera. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zeer eenvoudig te gebruiken is door een arts zonder een complexe techniek, en het is even snel en betaalbaar.

Om te beginnen, gebruik een biopsie-pons om huidmonsters van een patiënt te verzamelen. Vervolgens verwijder en gooi het epitheellaagje weg. Combineer elk weefselmonster met 1 milliliter zoutoplossing om autologe micro-grafts te genereren.

Om biocomplexen voor klinische toepassing voor te bereiden, breng 1 milliliter van de micro-graft-oplossing over op collageen sponzen. Breng het biocomplex onmiddellijk aan op het beschadigde gebied van de patiënt. Om in vitro, test de levensvatbaarheid van het biocomplex.

Na drie dagen cultuur, giet 0,3% formaline direct op de biocomplexen en fixeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik een microtoom om secties van 5 micrometer dik te snijden en monteer direct op een glazen plaat. Plaats vervolgens de secties gedurende drie minuten in 15 tot 20 milliliter xyleen.

Dompel vervolgens de plakken in afnemende graden van ethanol gedurende een uur elk voordat ze in gedeïoniseerd water worden geplaatst om de secties te deparaffineren en te rehydrateren. Gebruik vervolgens 1 tot 2 milliliter van 1 gram per liter hematoxylinen gedurende één tot twee minuten om de secties te kleuren. En breng over naar water om de verf weg te spoelen.

Nu met 1 tot 2 milliliter van 1% Eosin Y en 70% ethanol en verdun het in water, kleurt u de secties vier tot vijf minuten. Gebruik vervolgens stromend kraanwater om de dia's te spoelen. Dompel de secties in toenemende concentraties ethanol gedurende een uur elk voor een uur incubatie in xyleen.

Ten slotte brengt u een basismontagemedium aan op de monsters voordat u een dekglas toevoegt. Observeer vervolgens onder een lichtmicroscoop met 100x vergroting. Gebruik een dermatoom om respectievelijk 0,6 millimeter, 1 millimeter of 0,2-millimeter dikke papillaire, dode of dermis monsters te nemen van de rompgebieden van vier 40 tot 55-jarige meervoudige weefseldonoren volgens nationale regels voor oogst.

Plaats de monsters in 0,9% NaCl en plaats op een orbitale shaker gedurende vijf minuten om het weefsel voorzichtig te spoelen. Maak met een 5-millimeter biopsie-pons monsters met een uniforme diameter van het huidweefsel, dood en dermis, en weeg alle weefselmonsters. Plaats vervolgens acht, drie of vier uniforme monsters van huidweefsel, dood of dermis, respectievelijk in de weefselverstoorder en voeg 1,5 milliliter zoutoplossing toe voor de aggregatie.

Voer desaggregatie uit voor alle weefselmonsters zoals aangegeven in deze tabel. Gebruik een overeenkomstig aantal ponsbiopsieën afgeleid van intacte weefselmonsters als controles. Na mechanische desaggregatie, aspireer de zoutoplossing met micro-grafts en plaats elk monster afzonderlijk in een enkele put van een 12-wellsplaat.

Voeg 1 milliliter RPMI-1640-medium toe, gesupplementeerd met 10%FBS en antibiotica aan elk monster. Om de cellevensvatbaarheid te evalueren, voegt u aan elke put 1 milliliter medium toe dat 0,5 milligram per milliliter MTT-oplossing bevat, en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende drie uur. Na de incubatie, verwijdert u het MTT-medium en vervangt u het door 1 milliliter DMSO.

Na incubatie gedurende 10 minuten, brengt u elk monster in DMSO over naar een cuvet en gebruikt u een spectrofotometer om de optische dichtheid bij 570 nanometer te lezen. Bereken de cellevensvatbaarheid als de verhouding van absorptie bij 570 nanometer en het gewicht in gram van het weefsel dat voorafgaand aan desaggregatie werd gebruikt. Vervolgens, zodra de zoutoplossing is geaspireerd uit de huidweefsel-, dode en dermismonsters van een enkele donor, plaatst u elk monster afzonderlijk in een put van een 12-wellsplaat voor een cellevensvatbaarheidstest of een kweekfles voor morfologische analyse.

Voeg 1 milliliter RPMI-1640 met 10%FBS en antibiotica toe aan de 12-wellsplaat of 5 milliliter aan de kweekfles en kweek gedurende 24 uur of zeven dagen, respectievelijk, bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Gebruik na 24 uur lichtmicroscopie om morfologische analyse uit te voeren door de aanwezigheid van celsuspensie te evalueren. Herhaal dit op dag zeven.

Met FACS-analyse analyseert u de dermismonsters op mesenchymatische en hematopoietische celmarkers, zoals CD146, CD34 en CD45. Voeg medium toe aan de gedesintegreerde cellen en incubeer vervolgens bij 37 graden Celsius gedurende drie dagen. En beoordeel de steriliteit van het weefsel door microbiologische analyse uit te voeren zoals eerder beschreven.

Zoals hier getoond, werden humane autologe micro-grafts onmiddellijk geladen op collageenondersteuning geïmplanteerd in een beenlaesie. En een volledige re-epithelialisatie geassocieerd met weefselreparatie werd waargenomen na 30 dagen. Bovendien toonde het klinische vervolg een goede textuur en zachtheid van het beschadigde gebied na vijf maanden.

Zoals vermeld in deze tabel, werden de drempels van acht, vier en drie biopsies die in een enkele stap kunnen worden verwerkt, vastgesteld en werden de weefsels op vier verschillende tijdstippen gedesaggregeerd om optimale omstandigheden voor desaggregatie te identificeren om een goede cellevensvatbaarheid te behouden. De mechanische desaggregatie die in deze video wordt gedemonstreerd, behoudt een gemiddelde waarde van 30% cellevensvatbaarheid in alle huidmonsters, dood en dermis, wanneer geëvalueerd op verschillende tijdstippen ten opzichte van intact weefsel. Deze graft toont aan dat na 24 uur of zeven dagen in cultuur geen substantiële variatie in cellevensvatbaarheid in huidweefselmonsters werd waargenomen op het moment van