Oprichting van Genome bewerkte menselijke pluripotente stamcellijnen: Van Targeting naar Isolation

Het algemene doel van deze procedure is om humane pluripotente stamcellen genetisch te manipuleren met behulp van moderne genoombewerkingstechnologie. Hoewel deze procedure inzicht kan geven in de stamcelbiologie, kan het ook worden toegepast om humane ziektemodellering in een genetisch gedefinieerde omgeving te vergemakkelijken. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode, oefening nodig hebben in het isoleren van kolonies voordat ze vakkundig worden.

Visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat het identificeren en kiezen van kolonies moeilijk kan zijn. Begin met het kweken van humane pluripotente stamcellen in hESC-medium op een zes-wellplaat met mitomycin C-geïnactiveerde muizenembryofibrobladen, of MEF-feedercellen gekweekt op gelatine. Elke volgende dag na het plateren, totdat de hPSC's 50% confluency bereiken, gebruik een glazen pipet en vacuüm om het gehele volume medium te verwijderen.

Vervang met drie milliliters warm hESC-medium per well. Een dag voor het targeten, verwijder het hESC-medium en voeg vers, voorverwarmd hESC-medium toe, aangevuld met 10 micromolar Y-27632. Bereid ook een tot twee zes-wellplaten van geneesmiddelresistente MEF-feedercellen van DR4-muizen voor.

Op de dag van het targeten, bereid de transvectieoplossingen voor door vijf microgram van Zinc finger nuclease expressieplasmide 1 en 2, TALON 1 en 2 expressieplasmide, of 15 microgram van de CRISPR cas9 px330 coderende plasmide in een anderhalve milliliter buis te pipetten. Voeg 30 microgram van de herstelde donorplasmide toe, gevolgd door voldoende 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing om het volume tot 300 microliters te brengen. Inspecteer de cellen onder een microscoop om 50% confluency te verzekeren.

Gebruik vervolgens een glazen pipet en vacuüm om het medium van de plaat van hPFC's te verwijderen, was de cellen vervolgens met 2 milliliters warm 1x PBS. Na het aspireren van de PBS, voegt u nul punt vijf milliliters van 0,25% Trypsin-EDTA-oplossing direct op de cellen. Plaats in de weefselkweekincubator gedurende ongeveer 10 minuten, of totdat de feederlaag begint los te komen van de plaat.

Na de incubatie, voegt u twee milliliters warm ES-wasmedium toe aan elke well om de Trypsin-reactie te stoppen. Verzamel de cellen van elke well, en zorg ervoor dat de feedercellen als een blad loskomen. Pipetteer de inhoud van elke well in een enkele 50 milliliter conische buis, combineer alle wells en tritureer de cellen met behulp van een 10 milliliter serologische pipet.

Voeg ES-wasmedium toe om de celsuspensie tot 40 milliliters te brengen. Wacht een tot twee minuten om grote feeder-brokken op de bodem van de buis te laten bezinken, verwijder vervolgens het supernatant, met behulp van een serologische pipet, en deponeer in een nieuwe 50 milliliter conische buis. Na het centrifugeren van de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 190 keer g, aspireer het supernatant zonder de celpallet te verstoren.

Resuspendeer de cellen in 500 microliters van 1x PBS. Combineer de gesuspendeerde cellen met de plasma transectieoplossing die eerder werd bereid. Pipetteer de cellen en transfectiemengsel in een vier millimeter elektroporatiecuvet, en plaats op ijs gedurende drie tot vijf minuten.

Stel de parameters voor het exponentiële programma op het elektroporatiesysteem in op 250 volt, 500 microfarads, oneindige weerstand en vier millimeter cuvetgrootte. Elektroporeer de cellen, en plaats vervolgens de cuvet terug op ijs gedurende drie minuten. Resuspendeer de elektroporeerde cellen in 18 milliliters warm hESC-medium, aangevuld met 10 micromolar Y-27632.

Inspecteer de DR4 MEF's onder een microscoop. Plateer drie milliliters van de enkele celsuspensie in elke well van een zes-wellplaat met DR4-feedercellen, en keer terug naar de incubator. Op dag drie na het plateren, vervang het medium op de cellen hESC-medium zonder Y-27632.

Op dag vier, vervang het niet-aanvullend medium met medium dat de juiste selectieantibioticum bevat. Puromycine wordt hier gebruikt. Op de dag voor koloniekiezen, bereid een 12-wellplaat van MEF-feedercellen voor voor elke kolonie die moet worden gekozen.

Op dag 12 na het plateren, onderzoek de plaat onder een dissectiemicroscoop. Identificeer kolonies van 800 tot 1.200 micron in diameter die klaar zijn om te worden gekozen. Zorg ervoor dat die kolonies geen cellen bevatten die beginnen te differentiëren, zoals degene die hier wordt getoond.

Zorg ook dat de cellen GFP tot expressie brengen. Op de dag van het kiezen, inspecteer MEF's onder de microscoop om er zeker van te zijn dat ze gezond zijn. Verwijder al het medium van de MEF-feedercelplaten, en vervang met één milliliter hESC-medium.

Verander ook het hESC-medium op de zes-well hPSC-platen die gaan worden gekozen. Trek vervolgens glazen pipetten voor het kiezen van kolonies. Om kolonies te kiezen, plaats eerst de plaat hPFC's op het podium van de dissectiemicroscoop in de weefselkweekkap, monteer het kiesapparaat door het uiteinde van de glazen pipet in de zuigbulb te plaatsen.

Identificeer de kolonie die moet worden gekozen, en plaats de punt van de getrokken glazen pipet boven de kolonie. Druk vervolgens de bulb van het kiesapparaat samen om voorzichtig een individuele kolonie in 10 tot 20 gelijke stukken te snijden. Trek vervolgens de uitgesneden stukken kolonie in de pipet door de bulb los te laten.

Probeer zo min mogelijk medium te nemen tijdens het overbrengen. Druk de bulb samen om de nu gebroken kolonie rechtstreeks in één well van een 12-well MEF-feedercelplaat over te brengen. Label elk well om een unieke identificatie van uit een enkele cel afgeleide klonen mogelijk te maken.

Verwissel de glazen pipet en herhaal de procedure voor de volgende kolonie. Breng de platen terug naar de incubator, en schud de platen voorzichtig om de cellen in het well te verspreiden. De vol