Beeldvorming CD4 T Cell interstitiële Migratie in de ontstoken Dermis

Het algemene doel van dit beeldvormingsprotocol is het visualiseren van de dynamiek van CD4-positieve T-cellen in ontstoken huid. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de immunologie, zoals de mechanismen die ten grond liggen aan de motiliteit en functie van immuuncellen in ontstoken weefsels. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een minimaal invasieve manier biedt om het dynamische gedrag van CD4 T-cellen In Situ te bestuderen.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen om het oor voor beeldvorming voor te bereiden moeilijk aan te leren zijn en een juiste positionering van het oor noodzakelijk is om beelden van hoge kwaliteit vast te leggen. Ik ben Alison Gaylo, een promovendus, en ik zal de demonstratie van dit protocol uitvoeren. Begin met het opzuigen van 300 µL fluorescent gelabelde effector T-cel suspensie per muis in een spuit die is uitgerust met een naald van 27,5 gauge.

Keer de spuit vervolgens om zodat de naald naar boven wijst en tik voorzichtig tegen de schacht van de spuit, waarbij de zuiger indien nodig op en neer wordt bewogen om eventuele luchtbellen te verwijderen. Wanneer de cellen gereed zijn, worden de muizen overgebracht naar een schone kooi en onder een warmtelamp geplaatst totdat de staartvenen zijn gedilateerd. Plaats daarna de eerste muis in de fixatiehouder en reinig de staart met een alcoholdoekje.

Nadat een laterale staartvene is geïdentificeerd, injecteert u langzaam 200 microliters cellen in de vene. Wanneer alle cellen zijn overgebracht, trekt u 50 microliters complete fluorescens-emulsie op in een insulinespuit met een gauge van 28,5 en drukt u stevig op de zuiger om eventuele grote luchtbellen te verwijderen. Plaats vervolgens een vingerhoedje op de linkerwijsvinger en pak het oor van de muis voorzichtig vast tussen de linkerduim en het vingerhoedje, waarbij de ventrale zijde van het oor naar boven is gericht.

Schuif vervolgens de naald, met de schuine zijde naar boven, in de dermis in het buitenste derde deel van de oorschelp, iets uit het midden, en injecteer langzaam tien µL emulsie in het weefsel. Monitor de muizen na het injecteren van alle dieren totdat ze volledig zijn hersteld. Drie dagen na de immunisatie wordt de staartvenen van de geïnjecteerde dieren gedilateerd, zoals zojuist is gedemonstreerd.

Immobiliseer na het anesthetiseren de staart van de eerste muis met een pincet. Reinig de staart met een alcoholgaasje en schuif vervolgens voorzichtig een naaldcanule van 30,5 gauge in een laterale staartvene, waarbij de doorgankelijkheid wordt gecontroleerd door zachte druk uit te oefenen op de zuiger van de spuit. Wanneer de canule op zijn plaats zit, brengt u één tot twee druppels cyanoacrylaat-weefsellijm aan op de injectieplaats en laat u de lijm ongeveer 30 seconden drogen.

Gebruik vervolgens een schaar om de snorharen en het haar aan de achterkant en zijkanten van het oor voorzichtig weg te trimmen. Maak daarna het binnenoppervlak van het oor vochtig met PBS met behulp van een wattenstaafje. Draai de muis vervolgens en druk het geïnjecteerde oor plat op een glazen dekglas van 24 bij 50 millimeter met een dikte van nummer één punt vijf, totdat het volledig aansluit op het glas.

Dep het overtollige PBS weg. Gebruik vervolgens twee paren gebogen pincetten om een stuk geweven tape van ongeveer 20 millimeter lang in de lengte bij de bovenhoeken vast te pakken, en plaats de onderkant van de tape op het dekglas aan de bovenkant van het muisoor. Rol de tape over de rest van het oor, waarbij u indien nodig het overtollige haar met de pincetten opzij duwt, en gebruik een droog wattenstaafje om de tape voorzichtig rond het oor aan te drukken om een luchtdichte afsluiting te garanderen, waarbij u er zorg voor draagt niet op het oor zelf te drukken.

Het is essentieel dat het oor correct aan het dekglas wordt geplakt met een goede afdichting aan beide zijden en met minimale luchtbellen, aangezien dit de kwaliteit van de verkregen beelden zal beïnvloeden. Plak nu een beeldplatform voor fluorescentiemicroscopie op een verwarmingsblok van 37 degree Celsius en breng vacuümvet aan op beide zijden van het oorgebied van het platform. Draai de muis om het dekglas op het platform te plaatsen, waarbij u er zorg voor draagt dat het oor in het midden van het vilt wordt uitgelijnd.

Zodra het oor op zijn plaats is, klikt u de isofluraan-neuskap in de houder op het platform, waarbij u erop let dat de kap stevig vastzit en de neus van de muis volledig bedekt. Gebruik vervolgens een wattenstaafje om het dekglas stevig, maar voorzichtig, op het beeldvormingsplatform te drukken, zodat het vacuümvet onder het dekglas wordt verspreid. Wikkel twee stukken tape van 20 millimeter en twee langere stukken tape rond het bovenste gedeelte van het platform om het dekglas aan het platform te bevestigen.

Plaats de muis vervolgens op de microscooptafel. Bevestig het platform met extra plakband en breng een dubbele laag vacuümvet aan op het dekglas rondom het oor. Wikkel daarna een met water gevulde warmtemat om de muis en vul het vacuümvetreservoir met gedestilleerd water van 37 °C.

Begin bij in vivo time-lapse imaging door het objectief boven het centrum van het oor te positioneren en het objectief te laten zakken tot het net het wateroppervlak in het reservoir raakt. Laat vervolgens, met behulp van een externe lichtbron, het objectief langzaam zakken tot het oppervlak van het oor scherp in beeld komt. Laat daarna de binnenste en buitenste gordijnen rond de microscooptafel zakken en stel de golflengte van de laser in op 900 nanometers in het venster van de MP-lasercontroller, het laservermogen in het venster voor laserinstellingen voor acquisitie en de PMT-spanningen in het venster voor de besturing van de beeldacquisitie in.

Stel in de vensters voor acquisitie-instellingen voor grootte en modus de microscoop in op een resolutie van 512 bij 512 pixels, met een dwell-tijd van 2 µs per pixel, en selecteer XY-herhaling om een live-imagingmodus te activeren voor het scannen door het weefsel. Zodra een geschikt beeldveld is gevonden, lokaliseert u de hoogste cel in de dermis en klikt u op de knop voor nulstelling om de Z-positie op nul in te stellen. Scroll in de Z-richting naar beneden om de omvang van de celdiepte te meten.

Stel vervolgens de start- en eindposities in het venster voor acquisitie-instellingen van de microscoop in, en pas de PMT-spanningen en het laservermogen van het instrument in het bright Z-venster aan om de visualisatie van de cellen over de gehele diepte van het beeldveld te optimaliseren. Controleer de diepte- en tijdknoppen en stel een gemeenschappelijk filter in om het beeld drie keer per lijn te scannen in het venster voor de filtermodus van de acquisitiecontrole. Pas de Z-slice-diepte in het microscoopvenster voor beeldacquisitie aan, zodat het ongeveer één minuut duurt om een volledige stack vast te leggen, zoals aangegeven in het tijdweergavevenster.

Stel vervolgens, om de stabiliteit van het weefsel te beoordelen, het aantal herhalingen in het venster voor de acquisitie-instellingen van de tijdscan in op vijf en klik op de scanknop om een time-lapse-afbeelding van vijf minuten van het gebied vast te leggen. Als het weefsel na vijf minuten stabiel is, stelt u het aantal herhalingen in het venster voor de acquisitie-instellingen van de tijdscan in op 30 tot 45 en verzamelt u een time-lapse-afbeelding van 30 tot 45 minuten, terwijl u tijdens de beeldverwerving controleert op geringe weefseldrift. Sla de afbeelding van vóór de antilichaamtoevoeging op in het juiste formaat en trek vervolgens het antilichaammengsel op in een tuberculinespuit van 1 mL, waarbij u er zorgvuldig op let dat alle luchtbellen worden verwijderd.

Druk voorzichtig op de zuiger zodat de antilichaamoplossing een druppel vormt aan het uiteinde van de naald, en til de gordijnen rond de tafel op om de katheter te lokaliseren. Vervang de PBS-spuit door de spuit met antilichamen en injecteer vervolgens langzaam de antilichamen in de katheter. Wanneer de antilichamen succesvol zijn geïnjecteerd, laat de gordijnen opnieuw zakken en noteer het tijdstip van injectie.

Start vervolgens onmiddellijk met het verzamelen van een nieuwe beeldsequentie van 20 tot 40 minuten, op dezelfde locatie, met dezelfde instrumentinstellingen als bij de afbeelding vóór de antilichaamtoediening. Sla tot slot het bestand van de afbeelding na de antilichaamtoediening op in het juiste formaat en verwijder de muis voorzichtig van de microscooptafel, waarbij het dier wordt gemonitord tot het volledig is hersteld. Beeldbepaling van de intacte dermis van het oor via dit protocol vergemakkelijkt de acquisitie van beelden met een hoge resolutie en time-lapse beelden van de dynamiek van effector T-cellen in de ontstoken dermis.

In deze video is te zien hoe de groene, adoptief overgedragen effector T-cellen zich door het dermale weefsel bewegen. Na toediening van antibeta one en antibeta three entogrin-blokkerende antilichamen via de katheter, stoppen de voorheen beweeglijke cellen echter met bewegen binnen de dermis. De cellen vertonen een afname in gemiddelde snelheid na toediening van de antilichamen, evenals een significante afname in hun meandering-index.

Dat wil zeggen, de verhouding tussen de totale verplaatsing en de totale trajectlengte. Autofluorescentie van haarzakjes, schaduwvorming en autofluorescentie van bovenliggend haar, en luchtbellen die gevangen zitten tussen het oppervlak van het oor en het dekglas, kunnen allemaal leiden tot imaging-artefacten, die de visualisatie van de T-cellen bemoeilijken en interfereren met de geautomatiseerde software voor beeldanalyse. Daarnaast kan het gebruik van meerdere warmtebronnen leiden tot problemen met de weefselstabiliteit, wat resulteert in grote oscillaties tijdens de beeldvorming die de interpretatie van de resultaten bemoeilijken.

Zodra de methode onder de knie is, kan de beeldvorming van CD4 T-cellen in de dermis in twee tot drie uur worden voltooid, mits de procedure correct is uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de toepasselijke richtlijnen voor dierverzorging en -gebruik bij het werken met muizen te volgen. Deze procedure kan worden aangepast om andere T-cel-subsets of typen immuuncellen in het oor te visualiseren, gebruikmakend van verschillende infectiemodellen of verschillende methoden om ontsteking op te wekken.

Na de ontwikkeling maakte intravitale beeldvorming de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van immunologie om de dynamiek van lopende immuunresponsen in levende dieren te onderzoeken. Vergeet niet dat werken met een multi-fosforlaser extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals adequate afscherming, bij het uitvoeren van deze procedure. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een ontsteking in de dermis van een muisoor induceert en hoe u intravitale beeldvorming gebruikt om time-lapsebeelden vast te leggen van CD4 T-celactiviteit vóór en na de toediening van antilichamen.