Name: Meiotische Spil Assessment in Muis Eicellen door siRNA-gemedieerde silencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Leer siRNA-gemedieerde silencing om meiotische spilvorming in muizenoöcyten te bestuderen. Deze methode maakt functionele analyse van chromosoomsegregatie en aneuploïdie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door de Universiteit van Georgia en een subsidie (HD071330) van de National Institutes of Health aan MMV.

Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Georgia. 1. Voorbereidingen <ol><li> Voor eicel cultuur aankoop of vers bereiden Minimaal Essentieel Medium (MEM) en aangevuld met 3 mg / ml runderserumalbumine (BSA) als aangegeven in tabel 1. Plaats een polystyreen fles op een laad- saldo (tarra nul). Voeg alle reagentia, behalve BSA, teneinde brengen en het uiteindelijke volume met MQ-water per gewicht in totaal 250 g. Voeg dan de BSA, laten ontbinden en filter steriliseren. Opmerking: De beschreven MEM medium vereist equilibratie en celincubatie met een medisch gasmengsel van 5% CO2, 5% O2 en 90% N2. Maar ook andere media (bijvoorbeeld CZB) worden gebruikt die het mogelijk maken cellen incuberen in 5% CO 2 onder atmosferische omstandigheden. </li><li> Voor eicel micro-injectie, kopen of te bereiden M2 medium. </li><li> Bereid pregnant merrie serum gonadotropin (PMSG) tot een concentratie van 5 IU / 100 ui. </li><li> Aankoop en reconstrueren siRNA voorraden om een ​​werkende concentratie van 1 uM. </li></ol> 2. Mouse Eicel Collection <ol><li> DAG 1: follikel ontwikkeling te stimuleren en het verhogen van het aantal pre-ovulatoire follikels, beheren 5 IE PMSG intraperitoneaal aan vrouwelijke muizen 48 uur voorafgaand aan de eicel collectie. </li><li> DAG 3: Voor eicel inzameling en cultuur, het opzetten van 35 mm cultuur gerechten met 3 ml MEM / BSA aangevuld met 1 ug / ml milrinon. Dit fosfodiesteraseremmer handhaaft de eicellen in profase-I te arresteren en voorkomt kiemblaasje afbraak (GVBD). Equilibreer de kweekschalen in een medisch gasmengsel gedurende tenminste 15 min. Opmerking: Milrinon aangevuld media vereist heel eicel collectie, evenals eicel micro-injectie en de 24 uur cultuur hold periode na siRNA. </li><li> Halen de eierstokken van de vrouwelijke muizen met gevestigde laboratorium beoefent 15 en over te dragen aan een nieuwe cultuur schotel met voorverwarmde en in evenwicht MEM / BSA / milrinon. </li><li> Plaats de cultuur schotel op het podium van een stereomicroscoop voor eicel collectie. Vrijkomen cumulus-eicel complexen (COC&#39;s) door het handmatig doorboren de antrale follikels met 27 G naalden. Bevestig een eierstok aan de bodem van de kweekschaal met een 27 G naald bevestigd aan een injectiespuit 1 ml, en moet een tweede naald alle grote follikels doorboren. Herhaal dit voor elke eierstok. </li><li> Met behulp van standaard procedures mond pipetteren of ander eicel aspiratie, verzamel oöcyten die zijn omgeven door 2 of meer lagen compacte cumulus cellen. Breng de COC&#39;s een nieuwe schaal en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Haal de omringende cumulus cellen door herhaalde voorzichtig pipetteren met een pipet 1 ml ingesteld op een aspiratie volume van 750 pi. Herhaal de pipetteren stap ongeveer 12 keeren laat de oöcyten te herstellen gedurende 5 min. Ga zo verder totdat alle of de meeste van de cumulus cellen zijn verwijderd. Breng de blootgelegde oöcyten om een ​​kweekschaal om de temperatuur bij 37 ° C gedurende 15 min. </li><li> Verdeel de blootgelegde oöcyten in drie experimentele groepen worden gebruikt: (i) micro-injectie van siRNA&#39;s tegen doelwit van belang, (ii) micro-injectie van onspecifieke (control) siRNAs, en (iii) een niet-geïnjecteerde controlegroep verantwoorden kweekomstandigheden. </li></ol> 3. Eicel micro-injectie <ol><li> Opgericht kweekplaten met 3 ml M2 medium aangevuld met milrinon (1 ug / ml) voor oöcyt micro-injectie. Bereid cultuur gerechten met MEM / BSA / milrinon voor het wassen en de daaropvolgende cultuur van de geïnjecteerde eicellen. Opmerking: M2 medium bevat HEPES buffer en vereist voorverwarmen bij 37 ° C gedurende 15 min onder atmosferische omstandigheden. MEM vereist pre-opwarming en verevening met behulp van medische gassen zoals beschrevend hierboven. </li><li> Bereid de micro-injectie systeem. Laad de injectienaald met 5 ul van 1 uM specifieke siRNA-oplossing. Bevestig het bedrijf pipet en injectienaald te micromanipulators van de micro-injectie systeem en het opzetten van de injectie-eenheid met gekalibreerde volume en druk. </li><li> Plaats een 200 ul micro-druppel M2 media aan de binnenzijde van het deksel van een 3 cm kweekschaal en voeg een eicel te zetten en uitlijning van de micro-injectie systeem. </li><li> Met behulp van de eicel als een gids, stel de positie van het bedrijf en injectienaalden. Breng negatieve druk op het bedrijf pipet zachtjes zet de eicel en de positie van de injectienaald aan te passen aan het breedste diameter van de cel. Instellingen aanpassen om micro-injectie van ongeveer 10 pl van de siRNA-oplossing mogelijk te maken overal in de eicel cytoplasma. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> Figuur 1. Eicel micro-injectie opgezet. ( <strong&gt; A) representatief beeld van 200 ul micro-druppel M2 media uit een 3 cm kweekschaal geplaatst op het deksel, met het bedrijf pipet en injectienaald gepositioneerd links en rechts, respectievelijk. (B) Groep profase-I gearresteerd eicellen (GV-fase) voor micro-injectie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> </li><li> Zet de deksel op de stereomicroscoop podium en voeg 200 ul micro-druppel vers medium M2. Een groep van eicellen (~ 10) aan de micro-drop via de mond pipetteren of alternatieve methoden, dan terug het deksel met micro-neerzetten aan de micro-injectie podium. <ol><li> Overgaan tot de individuele eicellen microinject. Bevestig een eicel met die pipet langzaam steek de punt van de injectienaald in het cytoplasma en uitzetting van het injectievolume van siRNA oplossing. Intrekken zorgvuldig de injectienaald en move de geïnjecteerde eicel naar een positie onder in de micro-drop. Verplaats succesvol geïnjecteerde oöcyten naar een positie aan de bovenkant van de micro-drop. </li><li> Herhaal de procedure micro-injectie bij elke oöcyt. Om een ​​optimale leefbaarheid eicel, microinject slechts een klein aantal eicellen te houden op een moment. Ervoor zorgen dat dit proces niet meer dan een paar minuten op temperatuur en pH veranderingen in het micro-schommelingen te voorkomen. </li></ol></li><li> Aspireren succes geïnjecteerd eicellen of voorzichtig te verplaatsen van het deksel met de micro-drop van geïnjecteerde eicellen aan de stereomicroscoop. Breng de geïnjecteerde levensvatbare oöcyten oraal pipetteren of alternatieve methoden, naar / BSA / milrinon medium te wassen en te equilibreren bij 37 ° C MEM. </li><li> Een andere groep oöcyten, herhaalt de micro-injectie proces een nieuwe injectienaald geladen met aspecifieke siRNA&#39;s van de controlegroep. Was de eicellen in MEM / BSA / milrinon en transfer naar een aparte cultuur schotel. </li><li> Cultuur alle groepenoöcyten voor 24 uur in MEM / BSA / milrinon bij 37 ° C onder een atmosfeer van medisch gas. Opmerking: De &#39;milrinon blok&#39; kweekperiode is nodig voor een efficiënte doelwit mRNA / eiwit uitputting. </li></ol> 4. Eicel Cultuur voor Meiotische rijping <ol><li> DAG 4: Voor elke experimentele groep van eicellen set-up 4 cultuur gerechten (35 mm) met 3 ml MEM / BSA. Supplement één media schotel per groep 10% (hoge kwaliteit) foetaal runderserum (FBS) dat voor rijping van oöcyten. Sta alle cultuur gerechten in evenwicht komen bij 37 ° C met medische gasmengsel. </li><li> Om eicellen vrijgeven van &quot;milrinon block&quot;, achtereenvolgens wassen van de eicellen driemaal in schalen met MEM / BSA en breng de oöcyten om de rijping schaaltje met medium met 10% FBS. Culture alle eicel groepen voor 17 uur bij 37 ° C, om hervatting van de meiose en progressie mogelijk. </li><li> DAG 5: Bereid oplossingen voor eicel fixatie, waaronder: (i) 4% paraformaldehyde (PFA) in PEM buffer (100 mM PIPES [pH 6,9], 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA) met 0,5% Triton-X 100, en (ii) PBS aangevuld met 5 % FBS die wordt gebruikt voor wassen en blokkeren de eicellen. Opmerking: Deze oplossingen vereisen vooraf opwarmen tot 37 ° C voorafgaand aan fixatie eicel. </li><li> Voor eicel fixatie (na 17 uur kweek), snelle elke experimentele groep eicellen overdragen via de mond pipetteren of alternatieve werkwijzen in individuele putjes (een 4-putjes) met 750 ul voorverwarmde 4% PFA-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Vervolgens wast elke groep oöcyten 3 keer (15 minuten elk) in 750 pl voorverwarmde PBS bevattende 5% FBS. </li><li> Block eicellen in 200 ul PBS / 5% FBS O / N bij 4 ° C om niet specifieke binding te minimaliseren antilichaam. </li></ol> 5. Immunofluorescentie analyse <ol><li> DAG 6: Opmerking: Immunokleuring wordt uitgevoerd in een multi-putjesplaat en OOCYtes worden serieel overgedragen aan opeenvolgende putten, met respectieve antilichaam en wasoplossingen. Ofwel 48 of 96-well platen kunnen worden gebruikt, alleen het volume van de oplossing aanpassen op basis van goed formaat. Voor 96-putjes platen gebruiken 200 ul per putje. Eicellen worden overgebracht naar de verschillende oplossingen in de volgende volgorde: primaire antilichaam oplossing - 3 wash putten - secundair antilichaam oplossing - 3 wassen putten. Blootstelling aan licht de plaat kan worden afgedekt met folie te beperken. Bereid verse PBS / 5% FBS en deze oplossing antilichaam verdunningen bereiden (bijvoorbeeld konijn anti-pericentrin (1 / 1.000), muizen anti-tubuline (1 / 1.000)). </li><li> Breng de vaste eicellen van elke experimentele groep individuele putjes die 200 ul (of 100 pl, indien minder volume gewenst) van de primaire antilichaamoplossing en bedekken het goed met parafilm. Incubeer volgens optimale antilichaam-specifieke omstandigheden (bijvoorbeeld 37 ° C gedurende 1 uur of 4 ° CO / N). Opmerking: Primaire antilichaam dilution en specifieke incubatietijd en temperatuur vereisen testen om de optimale omstandigheden voor de verschillende gebruikte antilichamen te bepalen. </li><li> Na incubatie met het primaire antilichaam, was de eicellen drie keer in PBS / 5% FBS (10-15 min elk). </li><li> Breng de eicellen in de oplossing die fluorescent-geconjugeerde secundaire antilichamen (bijvoorbeeld 1/1000 verdunning van anti-konijn en anti-muizen-antilichamen geconjugeerd met fluorochromen van verschillende golflengten). Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Was de eicellen drie keer in PBS / 5% FBS (10 - 15 min elk). </li><li> Na de laatste wasstap, de overdracht van de eicellen op een schoon glasplaatje en zachtjes zuigen de overtollige wasoplossing. Dit zal immobiliseren oöcyten op het glasoppervlak. Voeg 8 ul van de montage media (met DAPI) en voorzichtig overlay de montage media met een 22 mm x 22 mm dekglas. Laat de dekglaasje langzaam om te voorkomen dat luchtbellen en / of beschadiging van de eicellen. Opmerking: Als alternatief voor het 3-dimensionale eigenschappen van de eicel voor confocale microscopie analyse handhaven, voeg een klein volume van 100 urn glasparels (gemengd met vaseline) aan de hoeken van het dekglas vóór montage op de dia. </li><li> WINKEL slides bij 4 ° C, of ​​op de beoordeling van de meiotische progressie en de analyse van expressieniveaus en subcellulaire lokalisatie eiwit met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met de nodige filters naar de secundaire antilichamen gebruikt passen. </li></ol>

<ol><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+Centrioles+in+the+First+and+Second+Meiotic+Spindles+of+Mouse+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes.</a> J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).</li>
<li>Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+Reduction+During+Gametogenesis+and+Its+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance.</a> Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).</li>
<li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).</li>
<li>Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEDD1+is+crucial+for+meiotic+spindle+stabilty+and+accurate+chromosome+segregation+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 339 (439-450), (2010).</li>
<li>Ma, W., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+pericentrin+in+mouse+oocytes+disrupts+microtubule+organizing+center+function+and+meiotic+spindle+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization.</a> Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).</li>
<li>Bouniol-Baly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Transcriptional+Activity+Associated+with+Chromatin+Configuration+in+Fully+Grown+Mouse+Germinal+Vesicle+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes.</a> Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).</li>
<li>De La Fuente, R., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Activity+of+the+Mouse+Oocyte+Genome%3A+Companion+Granulosa+Cells+Modulate+Transcription+and+Chromatin+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling.</a> Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).</li>
<li>Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPEB+phosphorylation+and+cytoplasmic+polyadenylation+are+catalyzed+by+the+kinase+IAK1%2FEg2+in+maturing+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes.</a> Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).</li>
<li>De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+in+the+germinal+vesicle+%28GV%29+of+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).</li>
<li>Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+with+gene+function+by+double-stranded+RNA+in+early+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development.</a> Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).</li>
<li>Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li>
<li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Hoewel er meerdere werkwijzen voor het exogene nucleïnezuur overdracht somatische cellen, zoals elektroporatie en transfectie, microinjectie is de optimale methode voor afgifte van RNA moleculen in transcriptioneel rustende muizen oöcyten. Het huidige protocol levert een effectieve aanpak voor in vitro depletie van specifieke mRNAs die de functionele testen van verschillende spil en / of MTOC geassocieerde factoren bij oöcyten mogelijk. Deze aanpak resulteert in een efficiënte transcript uitputting en is zeer f...

Meiose is een unieke divisie proces dat plaatsvindt in gameten (eicellen en zaadcellen) en omvat twee opeenvolgende divisies zonder tussenliggende DNA-synthese van homologe chromosomen en zusterchromatiden scheiden tijdens de meiose I en meiose II, respectievelijk 1. Fouten in chromosoom segregatie tijdens de meiose verdeeldheid in eicellen kan leiden tot aneuploïdie, die wordt overgenomen door het embryo tijdens de bevruchting. Met name de incidentie van aneuploïdie in ontwikkelende embryo&#39;s stijgt met voortschrijdende leeftijd van de moeder en is een hoofdoorzaak van aangeboren afwijkingen en miskramen 1,2, dus het benadrukken een grote behoefte om de moleculaire basis van aneuploïdie in meiotische deling begrijpen . Tijdens de celdeling, chromosoom segregatie is sterk afhankelijk van de montage van de microtubule spoelfiguur en de vestiging van stabiele chromosoom-microtubuli interacties voor de juiste bevestiging aan tegenovergestelde spindelpalen. Belangrijker nog, meiotische spindel formatie in zoogdieren eicellen verschilt van mitose in somatische cellen, en wordt gereguleerd door unieke microtubule organiserende centra (MTOCs) dat centriolen 3,4 missen. Essentiële eiwitten die nodig zijn voor microtubuli nucleatie en organisatie lokaliseren aan eicel MTOCs, waaronder γ-tubuline dat microtubule assemblage katalyseert. Bovendien pericentrin functioneert als essentiële steigers eiwit, dat bindt en ankers γ-tubuline alsook andere factoren MTOCs 5. Met name onze studies aangetoond dat depletie van belangrijke MTOC-geassocieerde eiwitten verstoort meiotische spindel organisatie en leidt tot chromosoomsegregatie fouten eicellen, die niet volledig opgelost door de spileenheid checkpoint (SAC) 6,7. Daarom defecten in spindel stabiliteit, die niet leiden tot meiotische arrestatie, vormen een groot risico bij te dragen aan aneuploïdie. Ondanks hun essentiële rol in de assemblage van de spoel en organisatie, eicel MTOC protein samenstelling en functie blijft slecht begrepen. Het testen van de functie van de specifieke doelgroep eiwitten in zoogdieren eicellen is een uitdaging, omdat de cellen transcriptie rusttoestand kort voor de hervatting van de meiose 8,9. Vandaar pre-ovulatoire eicellen afhankelijk maternale mRNA winkels meiose hervatten en te ondersteunen meiotische deling en de eerste splitsing divisies na bevruchting 10,11. De werkzaamheid van RNA-interferentie (RNAi) gemedieerde afbraak van mRNA transcripten in zoogdieren eicellen is goed ingeburgerd en moedersterfte RNA&#39;s geworven voor de vertaling tijdens de meiose rijping zijn bijzonder vatbaar voor siRNA gericht 12-14. Daarom, micro-injectie van korte interfererende RNA&#39;s (siRNA&#39;s) in de eicellen levert een waardevolle aanpak doel mRNA afbrekende voor functionele testen. We beschrijven hier werkwijzen voor de isolatie van muizen eicellen en siRNA-gemedieerde depletie specifieke transcripts de functie van wezenlijke MTOC-geassocieerde eiwit te testen, pericentrin. Verder beschrijven we immunofluorescentieanalyse voorwaarden meiotische spindel formatie in oöcyten evalueren.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG)</td><td>EMD Biosciences</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM)</td><td></td><td></td><td>*Recipe outlined in Table 1</td></tr><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution (10x)</td><td>Sigma</td><td>E-7510</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic Acid, sodium salt&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G, potassium salt&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-7794</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfate&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S-9137</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G-8540</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, disodium salt dihydrate&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td></td></tr><tr><td>Essential Amino Acids (50x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitamin Mixture (100x)</td><td>Sigma</td><td>M-6895</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red solution</td><td>Sigma</td><td>P-0290</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.01</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Media with Hepes</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>siRNAs targeting Pericentrin</td><td>Qiagen</td><td>GS18541</td><td></td></tr><tr><td>Negative control siRNAs&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16% solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td><td>Covance</td><td>PRB-432C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td><td>Sigma</td><td>T-6793</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21430</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti -mouse Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Major Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright Fluorescent Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Micro-injections System</td><td>Eppenforf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro manipulators</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-injection needles (femtotips)</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>Holding pipettes (VacuTip)</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm culture dishes</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>4-well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3367</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm CA Filter System</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430768</td><td></td></tr></tbody></table>

meiotische spil assessment in muis eicellen door sirna-gemedieerde silencing

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Fouten in chromosoomsegregatie tijdens meiotische deling in gameten kunnen leiden tot aneuploïdie die vervolgens bij bevruchting aan het embryo wordt overgedragen. De resulterende aneuploïdie in zich ontwikkelende embryo's wordt herkend als een belangrijke oorzaak van zwangerschapsverlies en aangeboren geboorteafwijkingen zoals het syndroom van Down. Nauwkeurige chromosoomsegregatie is kritisch afhankelijk van de vorming van het microtubulusspilapparaat, toch blijft dit proces slecht begrepen in zoogdier-eicellen. Intrigerend is dat meiotische spilvorming verschilt van mitose en wordt gereguleerd, althans gedeeltelijk, door unieke microtubulus-organiserende centra (MTOC's). Beoordeling van MTOC-geassocieerde eiwitten kan waardevolle inzichten verschaffen in de regulatorische mechanismen die meiotische spilvorming en organisatie beheersen. Hier beschrijven we methoden om muis-eicellen te isoleren en MTOC-geassocieerde eiwitten te depleteren met behulp van een siRNA-gemedieerde aanpak om functie te testen. Daarnaast beschrijven we omstandigheden voor eicellenfixatie en immunofluorescentie-analyse om meiotische spilvorming en organisatie te evalueren.

Micro-injectie van siRNAs een effectieve aanpak voor mRNA afbraak en daaropvolgende eiwit depletie in oöcyten die efficiënt en zeer specifieke functionele testen van verschillende doelwit factoren in vitro mogelijk maakt. Vervolgens wordt immunofluorescentie gebruikt voor specifieke fenotype analyse en eiwit uitputting valideren siRNA-geïnjecteerde oöcyten. In het huidige voorbeeld, fluorescent etikettering van individuele eicellen met DAPI samen met anti-tubuline en anti-pericentrin antilichamen ingeschakeld: ...

Hier presenteren we een protocol specifieke siRNA-gemedieerde mRNA afbraak gevolgd door immunofluorescentie analyse meiotische spileenheid en organisatie evalueren muizen oöcyten. Dit protocol is geschikt voor in vitro depletie van transcripties en functionele beoordeling van verschillende spil en / of MTOC geassocieerde factoren in oöcyten.

Meiotische Spil Assessment in Muis Eicellen door siRNA-gemedieerde silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Het algemene doel van deze procedure is om de vorming en organisatie van de mitotische spoel in cellen te beoordelen na irna-gemedieerde depletie van belangrijke MTOC-geassocieerde eiwitten zoals perrin. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de reproductieve biologie, zoals de mechanismen die chromosoomsegregatie reguleren en potentiële verstoringen die leiden tot aneuploïdie in alle locaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het resulteert in een efficiënte transcript-knockdown en specifieke immunofluorescentieanalyse van individuele cellen.Deze procedure kan ook worden aangepast om bijna elk doeleitwit te bestuderen. Behandel de vrouwelijke muizen die worden gebruikt voor de oöcytverzameling 48 uur voor de verzameldag met vijf internationale eenheden PMSG via intraperitonele injectie. Nadat de eierstokken volgens standaardprocedures zijn verzameld, worden deze overgebracht naar een schaal met voorverwarmd, geëquilibreerd MEM-medium aangevuld met BSA en mil reone, om de oöcyten onder een dissectiemicroscoop te isoleren. Bevrijd de cumulus-oöcytcomplexen of COC's door een eierstok met een 27 gauge naald op de bodem van de kweekschaal te fixeren en gebruik een tweede naald om de antrale follikels te ponceren via oöcytaspiratie of standaard mouth-pipetting technieken.Verzamel de oocyten die omringd zijn door twee of meer lagen compacte cumuluscellen. Breng deze COCs over naar een nieuw schaaltje met M-E-M-B-S-A mild reone en incubeer ze gedurende een uur bij 37 °C. Ga vervolgens over tot het denuden van de cyten met standaardmethoden.Bereid de injectieschaal voor met drie milliliter M2-medium met één microgram per milliliter milone. Bereid daarnaast de was- en kweekschalen voor met MEM BSA milone. Laad vervolgens vijf microliter van de 1 millimolaire INA-oplossing in de injectienaald en stel deze klaar voor de micro-injectie.Plaats nu een druppel van 100 µL M2-medium op het deksel van een schaal van 3 cm. Breng één oöcyt in de druppel aan en gebruik deze om de positie van de holding-pipet af te stellen. Fixeer de OAS-plaats door deze met behulp van onderdruk aan de holding-pipet te bevestigen.Pas vervolgens de positie van de injectienaald aan naar de grootste diameter van de oöcyt. Zodra deze is gepositioneerd, injecteert u ongeveer 10 picoliters van de oplossing in het cytoplasma van de oöcyt, waarbij u de nucleus vermijdt. Plaats het deksel terug op de tafel van de stereomicroscoop en voeg 100 microliters vers M two-medium toe.Plaats ongeveer 10 oocyten in het medium. Ga vervolgens op de micro-injectietafel over tot de micro-injectie. Fixeer elke oocyt met de holdingpipet en voer de injectienaald langzaam in het cytoplasma in.Injecteer de S irna-oplossing en trek de injectiepipet voorzichtig terug. Verplaats succesvol geïnjecteerde cytes naar één uiteinde van de druppel en verplaats niet succesvol geïnjecteerde cytes naar het tegenovergestelde uiteinde van de druppel. Het injecteren van 10 cytes zou slechts enkele minuten moeten duren, wat essentieel is om hun levensvatbaarheid te behouden.Plaats het deksel op de tafel van de stereomicroscoop en breng alle succesvol geïnjecteerde cellen over naar een schaal met M-E-M-B-S-A medium dat is voorverwarmd tot 37 °C. Plaats de cellen in een incubator van 37 °C met een medische gasatmosfeer en incubeer gedurende 24 uur. Begin met het losmaken van de cellen uit het mediumblok door de cellen drie keer te wassen in M-E-M-B-S-A.Breng de cellen vervolgens over naar rijppingsmedium met 10% FBS. Incubeer de cellen gedurende 17 uur bij 37 °C, zodat de meiose de volgende dag wordt hervat.Fixeer de cellen. Gebruik celaspiratie of mondpipettering om de verschillende experimentele groepen snel over te brengen naar wells van vier-wellplaten die 750 µL voorverwarmde 4% PFA bevatten. Laat de cellen vervolgens een uur incuberen.Was elke groep drie keer met 750 µL voorverwarmde PBS met 5% FBS. Elke wasbeurt moet 15 minuten in de incubator duren. Blok vervolgens elke O-sitegroep in 5% FBS in BS. Laat de blokkering overnacht bij 4 °C plaatsvinden voor de immunostaining. Gebruik een rij van acht wells op de multi-well plaat voor elke experimentele groep cyten.4 platen van 96 putjes bevatten 200 µL oplossing per putje. Begin het kleuringsproces met vers bereide primaire antilichaamoplossing. Dek vervolgens de putjes af met parafilm en incubeer de cellen volgens de specificaties van het antilichaam na toevoeging van het primaire antilichaam.Was de cellen drie keer met 5% FBS in PBS gedurende 10 tot 15 minuten per wasbeurt. Breng de cellen na drie wasbeurten over naar een putje met secundaire antilichaamoplossing. Dek deze putjes af met parafilm.Incubeer de cellen gedurende een uur bij 37 °C en was ze vervolgens drie keer zoals voorheen. Na het wassen worden de oocyten overgebracht naar schone glazen objectglazen. Alle oocyten uit één experimentele groep worden naar één enkel objectglas overgebracht.Zuig alle overtollige oplossing af om de cellen te immobiliseren en voeg onmiddellijk acht µL dappy met montage medium toe. Dek ze vervolgens voorzichtig af met een dekglas om luchtbellen of beschadiging van de oocyten te voorkomen. De oocyten werden gemicro-injecteerd met een niet-specifieke controle of perrin irna. Na 17 uur cultuur bereikten de meeste controles het stadium van metafase II en bevatten ze georganiseerde mitotische spoelen met uitgelijnde chromosomen. De perrin-labeling, in rood weergegeven, was helder en geconcentreerd bij de spoelpolen.De transcripten werden succesvol neergeslagen, aangezien perrin-kleuring in de met irna geïnjecteerde cellen niet werd gedetecteerd. De meeste van deze oocyten bleven in metafase I en vertoonden gedesorganiseerde spoelstructuren met verkeerd uitgelijnde chromosomen. Een enkel aantal vorderde naar metafase II, maar vertoonde eveneens verstoorde spoelen.Nu zou u een goed inzicht hebben in hoe u muis-oocyten verzamelt en micro-injecteert met specifieke siRNA, en hoe u deze cellen vervolgens immunokleurt voor fluorescentieanalyse van de vorming en organisatie van de spoel. Het is belangrijk om eraan te denken snel en met grote zorgzaamheid te werken om de levensvatbaarheid en kwaliteit van de oocyten te behouden.

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eicellen zijn gevoelig voor te wijten aan fouten in chromosoom segregatie aneuploïdie tijdens de meiotische rijping. Aneuploïde eieren kan leiden tot onvruchtbaarheid, miskramen of ontwikkelingsstoornissen, zoals het syndroom van Down. Hier beschrijven we methoden om materialen van keuze te introduceren in eicellen en methoden om meiotische rijping onderzoeken en te beoordelen ploïdie.

Eicel muis micro-injectie, rijping en ploïdie Assessment

Oögenese bij zoogdieren is bekend dat zij vergissing-geneigd, met name als gevolg van chromosoom missegregation. Dit manuscript chromatine verspreid voorbereiding worden methoden beschreven voor muis profase, metafase I en II-geënsceneerde eicellen. Deze fundamentele technieken toestaan voor de studie van chromatine-gebonden eiwitten en chromosoom morfologie in zoogdieren oögenese.

Chromatine verspreid preparaten voor de analyse van muis oöcyt progressie van profase naar metafase II

Als de genetische varianten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens begint te worden blootgelegd, wordt het steeds belangrijker systemen waarmee snel evalueren de biologische betekenis van deze geïdentificeerde varianten te ontwikkelen. Dit protocol wordt beschreven methoden voor de evaluatie van menselijke genfunctie tijdens vrouwelijke meiose ik met behulp van de muis eicellen.

Met behulp van de muis eicellen te beoordelen van menselijke genfunctie tijdens de meiose I

Reproducibly het om getallen te tellen van mRNAs in individuele eicellen, enkel molecuul RNA fluorescentie in situ is hybridisatie (RNA-vis) geoptimaliseerd voor niet-aanhanger cellen. Eicellen werden verzameld, gekruist met het transcript specifieke sondes en gekwantificeerd aan de hand van een afbeelding kwantificering software.

Gebruik van één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (SM-vis) om Quantify en lokaliseer mRNAs in lymfkliertest eicellen

We bieden een overzicht van het klinische protocol voor niet-invasieve beoordeling van menselijke Eier volwassenheid met behulp van gepolariseerd Lichtmicroscopie.

Menselijke Eier looptijd beoordeling en de klinische toepassing ervan

Er wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd dat de uitputting van cytoplasmatische microtubuli organiserende centra in muizenoöcyten tijdens metafase I mogelijk maakt met behulp van een nabij-infrarode femtosecondelaser.

Multi-foton laserablatie van cytoplasmatische microtubule organiserende centra in muizenoöcyten

Fout in chromosoomsegregatie is een veel voorkomend kenmerk in eicellen. Daarom geeft het bestuderen van het controlepunt voor de spindelassemblage belangrijke aanwijzingen over de mechanismen die nodig zijn om gezonde eieren te produceren. Het huidige protocol beschrijft drie complementaire testen om de integriteit van het controlepunt van de spindelassemblage in muizenoöcyten te evalueren.

Evaluatie van de integriteit van het spindelassemblagecontrolepunt in muizenoöcyten

Het handhaven van de integriteit van het oöcytengenoom is noodzakelijk om de genetische getrouwheid in het resulterende embryo te waarborgen. Hier presenteren we een nauwkeurig protocol voor het detecteren van DNA-dubbelstrengsbreuken in vrouwelijke geslachtscellen van zoogdieren.

Detectie van DNA-dubbelstrengsbreuken in eicellen van muizen

Dit protocol biedt een experimenteel kader om de fysieke impact van het cytoskelet op de nucleaire vorm en de interne membraanloze organellen in het eicelsysteem van muizen te documenteren. Het raamwerk kan worden aangepast voor gebruik in andere celtypen en contexten.

Het vastleggen van op cytoskelet gebaseerde agitatie van de eicelkern van muizen op ruimtelijke schalen

Meiotische fouten in synapsen en recombinatie komen vaak voor bij eicellen van zoogdieren. Grondige analyse van eiwitten die bij deze processen betrokken zijn, is essentieel om te begrijpen hoe en waarom oögenese vaak fout gaat. De hier gepresenteerde technieken maken een uitgebreide monitoring van recombinatie en synapsen mogelijk om de eicelkwaliteit bij muizen te evalueren.

Voorbereiding van meiotische chromosoomspreads van eicellen van muizen voor beoordeling van synapsis en recombinatie

Leer siRNA-gemedieerde silencing om meiotische spilvorming in muizenoöcyten te bestuderen. Deze methode maakt functionele analyse van chromosoomsegregatie en aneuploïdie mogelijk.

Meiotische Spil Assessment in Muis Eicellen door siRNA-gemedieerde silencing

Meer video's verkennen