Het genereren van een "gehumaniseerde" Drosophila S2 cellijn Gevoelig voor farmacologische remming van Kinesin-5

Het algemene doel van dit experiment is om een Drosophila S2-cellijn te genereren die gevoelig is voor kleine molecuulremmers van het Kinesin-5-motor, zodat ze kunnen worden gebruikt om foutcorrectie te bestuderen. Foutcorrectie tijdens celdeling is een proces waarbij foutieve kinetochore- en microtubulusinteracties worden gedestabiliseerd, om de cel een tweede kans of een andere gelegenheid te geven om juiste aanhechtingen te vormen, zodat het genoom goed kan worden gesegregeerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celbiologie, met betrekking tot het foutcorrectieproces.

Het grote voordeel van deze techniek is dat we een Drosophila S2-cellijn kunnen gebruiken die minder chromosomen heeft en gevoelig is voor een Kinesin-5-remmer, wat beide de visualisatie van individuele foutcorrectiegebeurtenissen vergemakkelijken. Begin met een eerder gekweekte 25 centimeter vierkante flacon van 100% confluente GFP-Alpha Tubulin-expresserende S2-cellen, breng twee milliliter van de cultuur over naar een 35 millimeter schotel. Bewaar de cellen vervolgens ongeveer een uur op kamertemperatuur om semi-adhereer te worden.

Verwijder het medium uit de schotel en voeg een milliliter Schneider's medium, aangevuld met FBS, toe aan twee microgram van het Eg5-mCherry-construct en transfectiereagens om de cellen te transfecteren volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik Parafilm om de schotel af te sluiten en bewaar de cellen gedurende 16 tot 18 uur op 25 graden Celsius. Voeg vervolgens een milliliter Schneider's medium toe en breng de cellen terug naar de incubator.

Op dag drie na de transfectie, breng 500 microliter van de getransfecteerde cellen over naar een nieuwe 35 millimeter weefselkweekschotel met 1,5 milliliter Schneider's medium voor een testinductie. Om de expressie van Eg5-mCherry te induceren, voeg kopersulfaat toe tot een eindconcentratie van 500 micromolar. Sluit de schotel af met Parafilm en bewaar de cellen een nacht op 25 graden Celsius.

Plaats een eerder voorbereide 22 millimeter bij 22 millimeter Concanavalin A-gecoate deksel in een schone 35 millimeter weefselkweekschotel. Zaai vervolgens 500 microliter van de 100% confluente geïnduceerde cellen op de deksel en laat de cellen bij kamertemperatuur aanhechten. Om de expressie van Eg5-mCherry te controleren, monteer de deksel in een rozenkamer met medium en beeld in bij kamertemperatuur met behulp van een fluorescentiemicroscoop, volgens de richtlijnen in het tekstprotocol.

Na te hebben gecontroleerd of de cellen zowel Eg5-mCherry als GFP-alpha-tubuline tot expressie brengen, breng de rest van de getransfecteerde, niet-geïnduceerde cellen over naar een 25 centimeter vierkante weefselkweekflacon met vier milliliter Schneider's medium. Voeg Blasticidin S HCL toe tot een eindconcentratie van 25 microgram per milliliter in de flacon en blijf de cellen splitsen in aanwezigheid van Blasticidin S HCL totdat de celdood stopt. Nadat KLP61F dubbelstrengs RNA is bereid volgens het tekstprotocol, zaai S2-cellen die Eg5-mCherry tot expressie brengen op een 35 millimeter kweekschotel bij 25% confluency en laat ze een uur aanhechten.

Verwijder het medium uit de schotels en voeg een milliliter serumvrij Schneider's medium toe aan vijf microgram dubbelstrengs KLP61F RNA. Na bewaring bij kamertemperatuur gedurende een uur, voeg een milliliter Schneider's medium met 10% FBS toe. Bewaar de cellen op 25 graden Celsius.

24 uur na dsRNA-behandeling, induceer de expressie van Eg5-mCherry door kopersulfaat toe te voegen tot een eindconcentratie van 500 micromolar. Bewaar de cellen gedurende nog eens 24 uur op 25 graden Celsius. Om levende celbeeldvorming uit te voeren, plaats een 22 millimeter bij 22 millimeter Concanavalin A-gecoate deksel in een schone 35 millimeter weefselkweekschotel.

Zaai 500 microliter van de dsRNA-behandelde cellen die 's nachts zijn geïnduceerd op de deksel en laat ze ongeveer een uur aanhechten. Na het verzamelen van tijdsverloopbeelden van bipolaire spindels volgens het tekstprotocol, verwijder het medium uit de rozenkamer en voeg Schneider's medium toe met een micromolaire STLC-concentratie en vervang het STLC-medium nog twee keer, waarbij het medium na elke wasbeurt wordt weggegooid om spindelcollaps te visualiseren. Om het medicijn weg te spoelen en de spindelcollaps om te keren, verwijder voorzichtig het STLC-bevattende medium uit de rozenkamer en gooi het weg in een afvalinische, en gebruik 6 tot 8 milliliter totaal Schneider's medium om de cellen vier keer te wassen, waarbij het medium na elke wasbeurt wordt weggegooid.

Na het toevoegen van vers medium om de kamer bij te vullen, ga verder met beeldvorming. Om toegang te krijgen tot het medium voor het wassen en wegwasbeurt van het medicijn, verwijder voorzichtig het bovendeksel van de rozenkamer terwijl deze op de microscoop is beveiligd. Als alternatief kan een glazen bodem Petri-schaal worden gebruikt die op dezelfde manier met Concanavalin A is behandeld als de deksels voor levende celbeeldvorming.

Na het zaaien van 500 microliter S2-cellen behandeld met KLP61F dsRNA op een Concanavalin A-deksel en het toestaan van de cellen om aan te hechten, voeg 1,5 milliliter Schneider's medium toe om het eindvolume op twee milliliter te brengen. Zodra de cellen zijn gearresteerd in mitose volgens het tekstprotocol, voeg een micromolaire STLC toe en bewaar gedurende een uur om monopoles te laten vormen. Was de STLC weg door twee milliliter vers Schneider's medium te gebruiken om de deksels drie keer te spoelen.

Om de cellen op verschillende tijdstippen van bipolaire spindelvorming te fixeren en om de kinetochore-aanhechtingsplaatsen te beoordelen, begin met het gebruik van twee milliliter 1X BRB80 om de deksels snel te spoelen. Voeg in een chemische kap twee milliliter 10% PFA in 1X BRB80 toe en bewaar gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 1% Triton X in 1X PBS toe om de cellen te permeabiliseren en bewaar gedurende