Name: Het genereren van een gehumaniseerde Drosophila S2 cellijn Gevoelig voor farmacologische remming van Kinesin-5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Leer hoe je een Drosophila S2 cellijn genereert die gevoelig is voor kinesin-5 remmers om foutcorrectie tijdens celdeling te bestuderen. Deze methode maakt live-beeldvorming van spindel dynamiek mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Patricia Wadsworth bedanken voor de gave van de kinesine-5 construct. Dit werk werd ondersteund door een NIH-subsidie ​​(5 R01 GM107026) naar TJM en door Research Grant No. 5-FY13-205 van de in maart van Dimes Stichting TJM, alsmede steun van de Charles H. Hood Foundation, Inc., Boston, MA. naar TJM

1. transfecteren S2 Cellen <ol><li> Uit een eerder gekweekte 25 cm2 kolf, voeg GFP-α-tubuline expressie S2-cellen 10 een eindvolume van 2 ml van 100% confluentie, en laat ze semi-hechten aan de bodem van een 35 mm weefselkweekplaat voor ongeveer 1 uur. </li><li> Verwijder de media uit de schotel. Transfecteren 2 ug van het Eg5-mCherry construct 11 met 1 ml medium Schneider gesupplementeerd met 10% FBS (hierna aangeduid als Schneider media) en transfectiereagens, volgens het protocol van de fabrikant. Verzegel de schaal met Parafilm en incubeer cellen bij 25 ° C gedurende 16-18 uur. </li><li> Voeg 1 ml Schneider media. Terugkeer cellen tot 25 ° C incubator. </li><li> Op dag 3 na transfectie overdracht 500 pi van getransfecteerde cellen in een nieuwe 35 mm weefselkweekplaat met 1,5 ml Schneider media voor een test inductie. Induceren de expressie van Eg5-mCherry door het toevoegen van CUSO4 </sub&gt; een eindconcentratie van 500 pM. Verzegeling van de schotel in Parafilm en incubeer bij 25 ° CO / N. </li><li> Om concanavaline-A gecoate dekglaasjes, pipet voldoende volume van concanavaline A-oplossing (0,5 mg / ml opgelost in H 2 O) om de vacht te maken een zuur gewassen dekglaasje, het overtollige, en laat het dekglaasje aan de lucht drogen. </li><li> Plaats een 22 mm x 22 mm concanavaline-A gecoate dekglaasje in een schone 35 mm weefselkweekschaal, dan zaad 500 gl van 100% samenvloeiing van de geïnduceerde cellen op het dekglaasje en laat de cellen hechten gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Om te controleren op Eg5-mCherry expressie, monteer de dekglaasje in een roos kamer (of juiste beeldvorming vat) met de media voor de beeldvorming bij RT op een fluorescentiemicroscoop. Gebruik de juiste lichtbronnen en filter sets om de cellen te visualiseren. Bijvoorbeeld, de microscoop gebruikt in deze studie heeft een witte LED-lichtbron en EGFP (FITC / Cy2) en DsRed (TRITC / Cy3) filter kubussen. Eg5-mCherry lokaliseert aan microtubuli en is verrijkt near spindle polen. </li><li> Daarna zorgen dat de cellen die zowel Eg5-mCherry en GFP-α-tubuline, dragen de resterende getransfecteerde, geïnduceerde cellen een 25 cm2 weefselkweek kolf met 4 ml Schneider media. </li><li> Voeg Blasticidine S HCL bij een uiteindelijke concentratie van 25 ug / ml aan de kolf van getransfecteerde cellen en blijven splitsen in aanwezigheid van 25 ug / ml blasticidine S HCl tot celdood ophoudt waarbij u periodiek op expressie van Eg5-mCherry. Incubeer cellijnen 25 ° C incubator. NB: Het percentage van cellen die Eg5-mCherry toeneemt in de tijd. </li><li> Zodra cellen die stabiel zijn getransfecteerd, blijven splitsen in afwezigheid van geneesmiddel en vries 12 cellen voor toekomstig gebruik. </li></ol> 2. RNA interferentie <ol><li> PCR versterken een ~ 500 bp regio Klp61F uit cDNA (LD15641) met behulp van primer met toegevoegde T7 promotorsequentie (sequentie die in Materials List) te zijngebruikt als een sjabloon voor synthese dsRNA. <ol><li> Instellen vier PCR-reacties, 50 pi elk gemaakt met 100 ng matrijs-DNA, 25 uM van elke primer, geschikte buffer en polymerase. Zet de PCR-protocol over de thermocycler volgens het protocol van de fabrikant van de polymerase&#39;s. </li><li> Pool and clean vier PCR-reacties met een PCR ruimen kit volgens protocol van de fabrikant. Bewaar de schone template bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Bereid dubbelstrengs RNA (dsRNA) vanaf matrijs met een T7 RNA transcriptie kit, volgens de instructies van de fabrikant. Verwacht ~ 5-15 mg / ml concentratie van dsRNA. Bewaar dsRNA bij -20 ° C. </li><li> Om Klp61F Knockdown met dsRNA toestaan ​​S2 cellen die Eg5-mCherry bij 25% confluentie semi-hechten aan de bodem van een 35 mm weefselkweekplaat gedurende 1 uur. </li><li> Verwijder de media uit de gerechten en voeg 5 ug dsRNA tegen Klp61F (Drosophila kinesine-5) verdund in 1 ml serumvrij Schneider &#39;s media. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, voeg 1 ml Schneider&#39;s medium met 10% FBS. Incubeer cellen bij 25 ° C. </li><li> 24 uur na behandeling dsRNA, induceren de expressie van Eg5-mCherry door toevoeging CuSO4 tot een eindconcentratie van 500 pM. Incubeer cellen bij 25 ° C nog eens 24 uur. </li></ol> 3. Live-cell imaging <ol><li> Plaats een 22 mm x 22 mm concanavaline A gecoate dekglaasje in een schone 35 mm weefselkweekplaat. </li><li> Zaad 500 ul van de cellen die zijn behandeld met dsRNA en geïnduceerde O / N op de concanavaline A gecoate dekglaasje en laat ze hechten gedurende 1 uur. </li><li> Monteer de dekglaasje in een roos kamer (of geschikt vat) voor de beeldvorming. </li><li> Vind mitotische cellen die zowel Eg5-mCherry en GFP-α-tubuline. OPMERKING: Mitotische cellen die enkel GFP-α-tubuline moet monopolaire spoelen sindsdien Klp61F, die nodig is voor spil tweepoligheid wordt neergeslagen 10,13. </li><li> Verzamelen van time-lapse beelden van bipolaire spindels (bijvoorbeeld 1 beeld per minuut) in cellen die zowel Eg5-mCherry en GFP-α-tubuline. </li><li> Terwijl beeldvorming, verwijder de media uit de roos kamer, en te vervangen door Schneider media met 1 uM STLC meer dan 3 opeenvolgende media uitwisselingen (~ 5 ml totaal) in de kamer om spindel instorten visualiseren. </li><li> Om de drug wash-out en achteruit de as instorten, verwijder voorzichtig de-STLC bevattende media van de roos kamer, en was in Schneider media 4x (6-8 ml totaal) voor het bijvullen van de roos kamer nog een laatste keer met verse media. Doorgaan beeldvorming. </li></ol> 4. Error Correction Assay <ol><li> Plaats een 22 mm x 22 mm concanavaline A gecoate dekglaasjes in schone 35 mm weefselkweek gerechten. </li><li> Zaad 500 pl cellen die zijn behandeld met Klp61F dsRNA op de concanavaline A gecoate dekglaasje en laat ze hechten. </li><li> Na cellen De nalevinged, voeg 1,5 ml Schneider media elk gerecht het eindvolume tot 2 ml te brengen. </li><li> Cellen arrestatie in mitose, voeg MG132 tot een uiteindelijke concentratie van 10 uM elk van de gerechten en incubeer 1 uur. </li><li> Voeg 1 uM STLC en incubeer gedurende 1 uur om monopoles te vormen. </li><li> Spoel de STLC door spoelen coverslips 3x met 2 ml vers medium Schneiders per keer. </li><li> Incubeer dekglaasjes met Schneider media naast enige farmacologische middelen (bijvoorbeeld Aurora kinase remmers) of DMSO als controle. Opmerking: remmerconcentraties variëren en goede eindconcentraties worden bepaald door de experimentator. Stock oplossingen zijn meestal zodanig gemaakt dat de remmer wordt verdund 1: 1000 in de media. In dit geval een 1: 1000 verdunning van DMSO (of geschikt oplosmiddel) dient als voertuigcontrole. We gebruiken de Aurora B remmer Binucleine 2 in een eindconcentratie van 40 uM. </li><li> Fix cellen op verschillende tijdstippen to houden aan de progressie van bipolaire spindel vorming en kinetochoor bevestiging staten te beoordelen. Repareren: <ol><li> Snel spoel de dekglaasjes met 2 ml van 1x BRB-80. </li><li> Fix cellen door toevoeging van 2 ml 10% paraformaldehyd verdund in 1 x BRB-80 gedurende 10 min. Pipet paraformaldehyde zorgvuldig in een chemische kap. </li><li> Permeabilize cellen met 2 ml 1x PBS + 1% Triton-X 8 min. </li><li> Was 3x dia met 2 ml 1x PBS + 0,1% Triton-X. </li><li> Transfer coverslips cel-kant naar boven op een vel Parafilm (gebruik een marker om Parafilm label adequaat bijhouden van de dia&#39;s te houden) in een 150 mm petrischaal. </li><li> Bedek de dekglaasjes met 150 ul gekookt donkey serum (BDS) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur om niet-specifiek antilichaam blokkeert binding. Opmerking: Hier kan de fixatie protocol gestopt worden op een later tijdstip worden voortgezet. Dekglaasjes kunnen worden opgeslagen in een vochtgehalte kamer bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur. Om de vochtkamer maken, langs de rand van een 150 mm schaalmet een natte laboratorium vegen en bedek met de petrischaal deksel. </li><li> Verwijder blok, en incubeer de dekglaasjes gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 150 ul van primaire antilichamen geschikt verdund in BDS kleur wordt kinetochoren en microtubuli eindconcentraties van 2 ug / ml (of volgens de aanbevelingen van de fabrikant) en 1 ug / ml, respectievelijk . Opmerking: Hier kan de fixatie protocol gestopt worden op een later tijdstip worden voortgezet. Dekglaasjes kunnen worden opgeslagen in een vochtgehalte kamer bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur. </li><li> Was coverslips 3x met 500 ul van 1 x PBS + 0,1% Triton-X. </li><li> Incubeer dekglaasjes gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur met het geschikte fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund in BDS. </li><li> Was coverslips 3x met 500 ul van 1 x PBS + 0,1% Triton-X. </li><li> Incubeer dekglaasjes met 150 pl BDS met 1 ug / ml DAPI eindconcentratie gedurende 5 min. </li><li> Was dekglaasjes 2x met 1x PBS + 0,1% Triton-X en zet coverslips cel naar beneden op een 3x1 &quot;dia met 8 ul van de montage media. Verf de hoeken met nagellak om de dekglaasjes immobiliseren op dia&#39;s. </li></ol></li><li> Afbeelding cellen met een bipolaire spindels die uiten Eg5-mCherry. Neem een ​​Z-serie bestaat uit 30 vliegtuigen bij 0,2 micrometer tussenpozen in alle kanalen met een 100X doelstelling. Analyseert zorgvuldig de kinetochoren en microtubuli naar de bijlage staten (gebioriënteerde of syntelic bijlagen) te bepalen. </li></ol>

<ol><li>Cheeseman, I. M., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+kinetochore-microtubule+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).</li>
<li>Maresca, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Welcome+to+a+new+kind+of+tension%3A+translating+kinetochore+mechanics+into+a+wait-anaphase+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal.</a> J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).</li>
<li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146, 568-581 (2011).</li>
<li>Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+kinase+promotes+turnover+of+kinetochore+microtubules+to+reduce+chromosome+segregation+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors.</a> Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).</li>
<li>Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+improper+chromosome-spindle+attachments+during+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division.</a> Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).</li>
<li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Learman, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSC+622124+inhibits+human+Eg5+and+other+kinesins+via+interaction+with+the+conserved+microtubule-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site.</a> Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).</li>
<li>Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop+5-directed+compounds+inhibit+chimeric+kinesin-5+motors%3A+implications+for+conserved+allosteric+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms.</a> J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).</li>
<li>Maliga, Z., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+and+mutational+analysis+of+allosteric+Eg5+inhibition+by+monastrol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol.</a> BMC Chem Biol. 6, 2(2006).</li>
<li>Goshima, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+microtubule-based+motor+proteins+in+mitosis%3A+comprehensive+RNAi+analysis+in+the+Drosophila+S2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line.</a> J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).</li>
<li>Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drosophila+cell-based+error+correction+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Development of a Drosophila cell-based error correction assay.</a> Front Oncol. 3, 187(2013).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li>
<li>Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+microtubule+dynamics+and+sliding+during+bipolar+spindle+formation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells.</a> Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10, 957-963 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Visualiseren foutcorrectie is een waardevolle techniek om de stappen betrokken bij dit belangrijke en complexe cellen te bestuderen. Hiertoe worden foutieve bijlagen gegenereerd met omkeerbare remmers en foutcorrectie wordt waargenomen na uitwassen van het geneesmiddel. Deze test werd oorspronkelijk ontwikkeld met behulp van zoogdieren weefselkweek cellen 5. Maar de aanwezigheid van talrijke kinetochoren vele model zoogdierceltypen een uitdaging in het observeren afzonderlijke foutencorrectie gebeurtenissen. Drosophila S2-cellen bezitten weinig als 4 paren van kinetochoren, waardoor ze een grotere voorkeur cellijn voor het observeren foutcorrectie. Echter, een belangrijk nadeel is dat veel remmers effectief in Drosophila S2-cellen. Dus de mogelijkheid om een gehumaniseerd Drosophila S2-cellijn die humaan kinesine-5 een waardevol hulpmiddel voor foutcorrectie bestuderen. Hoewel Drosophila S2 cellen kan eenbeter cellijn om foutcorrectie te bestuderen, de verschillende stappen die betrokken zijn bij het verkrijgen van de cellijn en neerhalen essentiële genen stelt een aantal uitdagingen om deze techniek. Zo kan transfectie-efficiëntie behoorlijk laag. Indien minder dan 20% van de cellen tot expressie de Eg5-mCherry, dient de transfectie worden herhaald als het selectieproces langer duren. Ook kan het percentage cellen die zowel fluorescerende eiwitten tijd afnemen. Dit kan worden ondervangen door het splitsen van cellen in aanwezigheid van Blasticidine S HCl en hygromycine B om te selecteren op cellen die Eg5-mCherry en GFP-α-tubuline, respectievelijk. Het is ook belangrijk op te merken dat Drosophila S2 cellen orthologen te veel menselijke eiwitten en; Daarom is het essentieel om de knockdown voorwaarden voor endogene eiwitten te optimaliseren. Optimale knockdown kunnen variëren in de hoeveelheid van dsRNA en de duur van de behandeling. Gezien de opkomst en snelle verbetering van CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, genereren van een Drosophila-cellijn met Klp61F gen vervangen door menselijke Eg5 presenteert een krachtig alternatief dat de beperkingen van de transfectie en knock-down benadering zou overwinnen. Ons werk toont die vliegen op mens genvervanging een haalbare optie in dit geval zijn, hoewel de benodigde reagentia daartoe in Drosophila S2-cellen worden momenteel ontwikkeld. Deze procedure is niet beperkt tot Eg5, maar kunnen worden toegepast om de functie van andere eiwitten van belang te bestuderen. Bij gebruik van remmers die eerder zijn vastgesteld ineffectief in Drosophila S2 cellen te zijn, kan dit protocol worden aangepast om de rechtstreekse werking van remmers in levende cellen zonder zorgen over palen effecten te bestuderen. De cellijn verkregen met dit protocol kan ook worden gebruikt in high-throughput screening analyses potentiële medicijnen die eiwitten betrokken bij het foutcorrectie identificeren.

Gelijke scheiding van het genoom tijdens celdeling vereist juiste interacties tussen de gerepliceerde DNA en spindle microtubules. Microtubules fysisch interageren met chromosomen door een ensemble van eiwitten die assembleert op centromeren zogenaamde kinetochoor 1. Juiste verdeling van de chromosomen vereist dat zuster kinetochoren worden gebioriënteerde, waarbij iedere zuster wordt geassocieerd met microtubules afkomstig vanuit tegengestelde spoel polen. Kinetochoor microtubule (kt-MT) bijlagen die niet in de Bioriented conformatie worden snel en efficiënt gedestabiliseerd de gelegenheid om biorientation vestigen in een proces dat bekend staat als foutcorrectie bieden. Een foutcorrectie test die eerder in zoogdiercellen werd opgericht 5 vereist het assembleren monopolar spindels met omkeerbare klein molecuul remmers tegen Eg5 (kinesine-5). De behandeling met geneesmiddelen genereert een veelheid van foutieve syntelic bijlagen waarin both zuster kinetochoren hechten aan dezelfde spil paal. Een volgende uitwassen van het geneesmiddel maakt visualisatie van het foutcorrectieproces. De foutcorrectie test kan worden uitgevoerd in aanwezigheid van kleine molecule inhibitoren of knockdowns de bijdrage van kandidaat eiwitten te bestuderen corrigeren van foutieve kt-MT attachments. De mogelijkheid om foutcorrectie te visualiseren in levende cellen is een krachtig instrument om inzicht in de moleculaire mechanismen betrokken bij dit complex proces. Echter, het grote aantal chromosomen in de meeste cellijnen vormt een uitdaging waarnemen individuele kt-MT attachments. Drosophila S2-cellen zou ideaal zijn voor toepassing van foutcorrectie assay als ze zo weinig als 4 chromosomen 6, maar kleine molecule inhibitoren bevatten kinesine 5 zoals S-trityl-L-cysteïne (STLC) en monastrol 7-9 hebben geen invloed spileenheid of kinesine-5 motorfunctie in Drosophila-cellen. Daarom generated een Drosophila S2-cellijn die humane kinesine-5 onder een induceerbare promoter die gevoelig is voor kinesine-5 remmers. Dit protocol beschrijft hoe de endogene Drosophila kinesine-5 homoloog, Klp61F knockdown, en het gebruik van deze cellijn in de cel-gebaseerde foutcorrectie test.

<table><tbody><tr><td>Effectine Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>Drosophila Genomic Resource Center</td><td>13690</td><td>Gene Naam LD15641</td></tr><tr><td>Schneider&rsquo;s Media</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Rundserum, gecertificeerd</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>Heat Inactivated, VS oorsprong</td></tr><tr><td>Koper(II) Sulfaat (CuSO4)</td><td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500&nbsp;mM stock</td></tr><tr><td>S-trityl-L-cysteïne</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1&nbsp;mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidin HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td>5&nbsp;mg/ml stock in 1x PBS</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>T7 Large scale RNA Productiesysteem</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>De geschatte dsRNA-concentratie uit elke reactie is ongeveer 5-15&nbsp;&micro;g/&micro;l</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi F primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td></tr><tr><td>PCR clean-up kit</td><td>Mo Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0,5&nbsp;mg/ml oplossing gemaakt door oplossen in 1x PBS.</td></tr><tr><td>Gekookt Ezelsserum</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>5% stockoplossing in 1x PHEM buffer, oplossing opgewarmd tot kookpunt. Opgeslagen bij 4&nbsp;&deg;C.</td></tr><tr><td>Montagemedie</td><td></td><td></td><td>20&nbsp;mM Tris pH 8,0,&nbsp; 0,5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Opgeslagen bij 4&nbsp;&deg;C.</td></tr><tr><td>1x BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 mM PIPES pH 6,9; 1&nbsp;mM EGTA; 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Witte Lichtbron</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>DSRed Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td></td></tr><tr><td>anti-NDC80 antilichaam&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Op maat gemaakt door het Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1&alpha; (anti-&alpha;-tubulin)</td><td>Sigma</td><td>T6199</td><td></td></tr><tr><td>anti-CID antilichaam</td><td>AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

het genereren van een &quot;gehumaniseerde&quot;<em&gt; drosophila</em&gt; s2 cellijn gevoelig voor farmacologische remming van kinesin-5

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Kinetochoren zijn grote eiwitstructuren die zich tijdens de celdeling op centromeren vormen en chromosomen aan spilmicrotubuli koppelen. Voor een juiste verdeling van het genetisch materiaal is het noodzakelijk dat zusterkinetochoren op elk chromosoom bi-georiënteerd worden door zich te hechten aan microtubuli van tegenoverliggende spilpolen voordat de anafase begint. Foute, niet bi-georiënteerde hechtingstoestanden komen echter vaak voor en er bestaan cellulaire routes om dergelijke hechtingen tijdens de celdeling zowel te detecteren als te corrigeren. Het proces waarbij onjuiste kinetochore-microtubuli-interacties worden gedestabiliseerd, wordt foutcorrectie genoemd. Om foutcorrectie in levende cellen te bestuderen, worden onjuiste hechtingen opzettelijk gegenereerd via chemische remming van de kinesin-5-motor, wat leidt tot een monopolaire spilsamenstelling, en de overgang van verkeerd-georiënteerd naar bi-georiënteerd wordt waargenomen na het wegspoelen van het medicijn. Het grote aantal chromosomen in veel model weefselkweekceltypen vormt een uitdaging bij het observeren van individuele foutcorrectiegebeurtenissen. Drosophila S2-cellen zijn betere onderwerpen voor dergelijke studies omdat ze slechts 4 paar chromosomen hebben. Kleine molecuul kinesin-5-remmers zijn echter niet effectief tegen Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Hier beschrijven we hoe je een Drosophila cellijn kunt bouwen die Klp61F effectief vervangt door humaan kinesin-5, waardoor de cellen gevoelig worden voor farmacologische remming van de motor en geschikt zijn voor gebruik in de celgebaseerde foutcorrectietest.

Klp61F moet bipolaire assen vormen. De humane kinesine-5, Eg5, kan de functie van Klp61F in Drosophila S2-cellen (Figuur 1A en D) redden. Na toevoeging van het kinesine-5 inhibitor (STLC), microtubule geassocieerde niveaus van de motor druppel (Figuur 1B en E) en de spil stort, wat resulteert in een monopool (figuur 1C en F) in cellen zonder endogene Klp61F na succesvolle RNAi (Aanvullende filmpje 1). Het is opmerkelijk dat de bipolaire spillen instorten na toevoeging van STLC in het gehumaniseerde S2-cellen omdat kinesine-5 activiteit moet spil tweepoligheid in menselijke cellen te behouden. Deze interessante discrepantie gevolg van verschillen in interpolaire microtubuli overlap en / of stabiliteit in beide modelsystemen 14 zijn. Kinesine-5 inhibitie (figuur 2A en E) worden reve<html> rsed door het wassen van de drug en het herstel van een bipolaire spindel kan na verloop van tijd worden gevolgd. Na verwijdering van de remmer (figuur 2B en F), Eg5-mCherry opnieuw associeert met microtubuli als een bipolaire spil monteert (figuur 2C en G), en cellen kan evolueren in een bipolaire anafase (figuur 2D en H, Supplemental film 2 ). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> Figuur 1. Toevoeging van 1 uM STLC leidt tot monopolar spindels in Drosophila S2 cellen. Vertegenwoordiger beelden van time-lapse beeldvorming van een Drosophila S2 cel die Eg5-mCherry (AC) en GFP-α-tubuline (DF) bij toevoeging van 1 uM STLC. De Eg5 inhibitor werd toegevoegd 3 min. Schaal bar = 5 micrometer. Timestamp = min: sec.<html> w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> Figuur 2. Een bipolaire spindel hervormingen bij verwijdering van STLC. Vertegenwoordiger beelden van time-lapse beeldvorming van een Drosophila 2 cel die Eg5-mCherry (AD) en GFP-α-tubuline (EH) tijdens een STLC wash-out experiment. STLC werd gewassen op 5 min. Een bipolaire spindel hervormingen binnen 1 uur van het verwijderen van de STLC. Schaal bar = 5 micrometer. Timestamp: min. Sec <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Aanvullende Movie 1. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Widefield fluorescentie beeldvorming van een representatief voorbeeld van een Drosophila S2 cel die Eg5-mCherry ( links) en GFP-α-tubuline (rechts). 1 uM STLC werd toegevoegd in 2 minuten, en de spil vormt een monopool binnen 10 minuten na toevoeging van de remmer. Beelden werden elke 1 min verkregen en speelde een snelheid van 10 frames per seconde. Schaal bar = 5 micrometer. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">Aanvullende Movie 2. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).</a> Widefield fluorescentie beeldvorming van een representatief voorbeeld van een Drosophila S2 cel die Eg5-mCherry (links) en GFP-α-tubuline (rechts). Medium dat 1 uM STLC verwijderd engespoeld op 5 min. Een bipolaire spil hervorming binnen 1 uur van het verwijderen van de remmer. Beelden werden iedere 1 min verworven en speelde met een snelheid van 10 frames per seconde. Schaal bar = 5 micrometer.

Dit protocol beschrijft hoe je een Drosophila S2-cellijn genereert die gevoelig is voor kleine molecuulremmers van kinesin-5. Het gebruik van deze cellen in een op cellen gebaseerde foutcorrectie-assay wordt ook geschetst.

Het genereren van een &quot;gehumaniseerde&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 cellijn Gevoelig voor farmacologische remming van Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Het algemene doel van dit experiment is het genereren van een Drosophila S2-cellijn die gevoelig is voor kleine moleculaire inhibitoren van de Kinesine-5-motor, zodat deze kunnen worden gebruikt om foutcorrectie te bestuderen. Foutcorrectie tijdens de celdeling is een proces waarbij foutieve interacties tussen kinetochoren en microtubuli worden gedestabiliseerd, om de cel een tweede kans, of een nieuwe gelegenheid, te geven om correcte verbindingen te vormen zodat het genoom vervolgens correct kan worden gesegregeerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de celbiologie met betrekking tot het proces van foutcorrectie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een Drosophila S2-cellijn kunnen gebruiken die minder chromosomen heeft en gevoelig is voor een Kinesin-5-remmer, wat beide de visualisatie van individuele foutcorrectiegebeurtenissen vergemakkelijkt. Begin met een eerder gekweekte vierkante kolf van 25 centimeter met 100%confluente S2-cellen die GFP-Alpha Tubuline tot expressie brengen, en breng twee milliliters van de cultuur over naar een schaal van 35 millimeter. Incubeer de cellen vervolgens gedurende ongeveer één uur bij kamertemperatuur om semi-adherentie te bewerkstelligen.Verwijder het medium uit de schaal en voeg één milliliter Schneider's medium, aangevuld met FBS, toe aan twee microgram van het Eg5-mCherry-construct en transfectiereagens om de cellen te transfecteren volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik Parafilm om de schaal af te dichten en incubeer de cellen bij 25 °C gedurende 16 tot 18 uur. Voeg vervolgens één milliliter Schneider's medium toe en plaats de cellen terug in de incubator.Breng op dag drie na transfectie 500 microliters van de getransfecteerde cellen over naar een nieuwe 35 millimeter weefselkweekschaal met 1,5 milliliters Schneider's medium voor een testinductie. Om de expressie van Eg5-mCherry te induceren, wordt kopersulfaat toegevoegd tot een eindconcentratie van 500 micromolar. Sluit de schaal af met Parafilm en incubeer deze gedurende de nacht bij 25 graden Celsius.Plaats een vooraf geprepareerd, met Concanavalin A gecoat dekglas van 22 millimeter bij 22 millimeter in een schone 35 millimeter weefselkweekschaal. Zaai vervolgens 500 microliters van de 100%confluente geïnduceerde cellen op het dekglas en laat de cellen hechten bij kamertemperatuur. Om de expressie van Eg5-mCherry te controleren, wordt het dekglas samen met medium in een rose-kamer geplaatst en bij kamertemperatuur gefotografeerd met een fluorescentiemicroscoop, volgens de richtlijnen in het tekstprotocol.Nadat is vastgesteld dat de cellen zowel Eg5-mCherry als GFP alfa tubuline tot expressie brengen, wordt de rest van de getransfecteerde, niet-geïnduceerde cellen overgebracht naar een vierkante weefkweekfles van 25 centimeter met vier milliliter Schneider's medium. Voeg Blasticidin S HCL toe aan de fles tot een eindconcentratie van 25 micrograms per milliliter en ga door met het splitsen van de cellen in aanwezigheid van Blasticidin S HCL totdat de celdood stopt. Na het bereiden van KLP61F dubbelstrengs RNA volgens het tekstprotocol, worden S2-cellen die Eg5-mCherry tot expressie brengen uitgezaaid in een kweekschaal van 35 millimeter bij 25% confluency, waarna ze één uur de tijd krijgen om te hechten.Verwijder het medium uit de schalen en voeg één milliliter serumvrij Schneider's medium toe aan vijf microgram dubbelstrengs KLP61F RNA. Na incubatie gedurende één uur bij kamertemperatuur, voegt u één milliliter Schneider's medium met 10% FBS toe. Incubeer de cellen bij 25 °C.Induceer 24 uur na de dsRNA-behandeling de expressie van Eg5-mCherry door kopersulfaat toe te voegen tot een eindconcentratie van 500 micromolar. Incubeer de cellen nogmaals 24 uur bij 25 degrees Celsius. Plaats voor live cell imaging een met Concanavalin A gecoate dekglasplaat van 22 millimeter bij 22 millimeter in een schone 35 millimeter weefselkweekschaal.Zaai 500 microliters van de met dsRNA behandelde cellen, die gedurende de nacht zijn geïnduceerd, uit op het dekglas en laat ze ongeveer een uur hechten. Nadat er time-lapse beelden van bipolaire spoelen zijn verzameld volgens het tekstprotocol, wordt het medium uit de rose-kamer verwijderd en wordt Schneider's medium toegevoegd dat een micromolar STLC bevat; vervang het STLC-medium nog twee keer, waarbij het medium na elke wasbeurt wordt weggegooid om het inklappen van de spoel te visualiseren. Om het geneesmiddel uit te spoelen en het inklappen van de spoel ongedaan te maken, wordt het STLC-bevattende medium voorzichtig uit de rose-kamer verwijderd en in een afvalcontainer weggegooid, waarna in totaal 6 tot 8 millimeters Schneider's medium wordt gebruikt om de cellen vier keer te wassen, waarbij de media na elke wasbeurt worden weggegooid.Voeg vervolgens vers medium toe om de kamer aan te vullen en ga door met het beelden. Om toegang te krijgen tot het medium voor het wassen met geneesmiddelen en de uitspoeling, verwijdert u voorzichtig het bovenste dekglas van de rose chamber terwijl deze op de microscoop is bevestigd. Als alternatief kan een glazen Petri-schaal met bodem, behandeld met Concanavalin A op een vergelijkbare wijze als de dekglazen, worden gebruikt voor live-cell imaging.Nadat 500 µL S2-cellen behandeld met KLP61F dsRNA op een Concanavaline A-dekglaasje zijn gezaaid en de cellen zich hebben kunnen hechten, wordt 1,5 mL Schneider's medium toegevoegd om het eindvolume op twee mL te brengen. Zodra de cellen in mitose zijn gearresteerd volgens het tekstprotocol, wordt één µM STLC toegevoegd en volgt een incubatie van één uur om de vorming van monopolen mogelijk te maken. Spoel het STLC weg door de dekglaasjes drie keer te spoelen met twee mL vers Schneider's medium.Om de cellen te fixeren op verschillende tijdstippen van de vorming van de bipolaire spoel, en om de aanhechtingsplaatsen van de kinetochoren te beoordelen, begin je met het snel spoelen van de dekglasjes met twee milliliters 1X BRB80. Voeg in een zuurkast twee milliliters 10% PFA in 1X BRB80 toe en incubeer dit gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens, om de cellen te permeabiliseren, 1% Triton X in 1X PBS toe en incubeer dit gedurende 10 minuten.Was de cellen vervolgens drie keer met twee milliliter 0,1% Triton X in 1X PBS. Breng daarna het dekglas, met de cellen naar boven, over op een vel Parafilm in een Petri-schaal van 150 millimeter. Voeg 150 microliter gekookt ezelsserum, of BDS, toe aan de dekglazen en incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur om aspecifieke antilichaambinding te blokkeren.Verwijder na de incubatie het blok en voeg 150 µL primaire antilichamen toe, bereid volgens het tekstprotocol, alvorens één uur bij kamertemperatuur te incuberen. Nadat de dekglasjes drie keer zijn gewassen, voegt u Fluoro-4-geconjugeerde secundaire antilichamen toe, verdund in BDS, en incubeert u deze gedurende 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur. Zodra de dekglasjes drie keer zijn gewassen, incubeert u deze vijf minuten met 150 µL BDS, bevattend 1 µg/mL DAPI.Nadat de dekglasjes twee keer zijn gewassen, gebruikt u acht microliters monteermedium om het monster, met de celzijde naar beneden, op een objectglas van drie bij één inch te monteren. Gebruik nagellak om de hoeken te verzegelen. Gebruik tot slot een 100X objectief om cellen met bipolaire spoelen die Eg5-mCherry tot expressie brengen, af te beelden.Maak een Z-serie, bestaande uit 30 vlakken met intervallen van 0.2 micrometer in alle kanalen. Analyseer zorgvuldig het kinetochoor en de microtubuli om de aanhechtingsstatus te bepalen. KLP61F is vereist voor de vorming van bipolaire spoelen in Drosophila S2-cellen; kleine molecuul Kinesine-5-remmers zijn echter niet effectief tegen dit eiwit.Deze afbeeldingen tonen aan dat het menselijke Kinesine-5 Eg5 de functie van KLP61F in Drosophila S2-cellen kan herstellen. Wanneer de Kinesine-5-remmer STLC wordt toegevoegd, dalen de microtubuli-geassocieerde niveaus van de motor en stort de spoel in, wat resulteert in een monopool in cellen die endogeen KLP61F missen als gevolg van een succesvolle RNAi. Deze figuur demonstreert dat remming van Kinesine-5 kan worden omgekeerd door het middel uit te wassen, waarbij het herstel van een bipolaire spoel in de loop van de tijd kan worden gevolgd. Na verwijdering van de remmer associeert Eg5-mCherry zich opnieuw met de microtubuli, waardoor de cellen kunnen progresseren naar een bipolaire anafase.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een Drosophila S2-cellijn kunt genereren die gevoelig is voor een klein molecuul-inhibitor van Kinesine-5. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer zes uur worden uitgevoerd, mits correct uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om vooruit te plannen, omdat deze methode een voorbereiding van enkele dagen vereist.Vergeet niet dat het werken met kleine molecuulremmers gevaarlijk kan zijn, draag daarom altijd handschoenen. De constructie van gehumaniseerde fruitvliegcellen kan worden aangetoond via de toepassing van Crispr-Cas 9-technologieën, waarbij Drosophila Kinesin-5 wordt vervangen door het menselijke tegenhangertje. De ontwikkeling van gehumaniseerde Drosophila-cellen zou in de toekomst ons begrip van foutcorrectie en andere essentiële cellulaire processen moeten bevorderen.

generating-humanized-drosophila-s2-cell-line-sensitive-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Drosophila Schneider (S2)-cellen zijn een steeds populairder systeem voor de ontdekking en functionele analyse van genen. Ons doel is het beschrijven van een aantal van de microscopische technieken die S2 cellen te maken die een steeds belangrijker experimenteel systeem.

De voorbereiding van Drosophila S2 cellen voor lichtmicroscopie

Dit is een protocol om actief volle lengte Kinesine isoleren...

Isolatie en zuivering van kinesine uit Drosophila Embryo&#39;s

Bij het kleuren van Drosophila imaginal schijven, vaak een ruwe dissectie wordt uitgevoerd waar de schijven worden blootgesteld, maar blijven bevestigd aan het lichaam. Eenmaal bevlekt, worden de schijven van belang geïsoleerd en gemonteerd. Het voorbeeldprotocol demonstreert een procedure voor vleugel imaginaire schijfdissectie en montage.

Drosophila Larva Imaginal Disc Dissectie: Een methode om de ontwikkeling van Epithelia te observeren

Dit protocol beschrijft de dissectie en cultivatie van intacte testikels en kiembaan-cysten uit Drosophila melanogaster poppen. Deze methode maakt microscopisch waarnemen van spermatogenese ex vivo mogelijk. Verder beschrijven we een farmacologisch assay van het effect van remmers op specifieke stadia van kiembaan-celontwikkeling in de testikels van de pop.

Ex vivo cultuur van Drosophila Pupal testis en Single Man Germ-lijn Cysten: Dissection, Imaging, en farmacologische behandeling

Mozaïek kloon analyse in Drosophila imaginal disc epithelia is een krachtig model systeem om de genetische en cellulaire mechanismen van tumorigenese te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om tumoren te induceren in Drosophila- vleugel-imaginale schijven met behulp van het GAL4-UAS-systeem, en introduceert een diagnose-methode om de tumorfenotypen te classificeren.

Inductie en diagnose van tumoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epithelia

Hier presenteren we een methode voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door vervanging van de eerste codering exon van genen met transcriptie stuurprogramma's. De CRISPR/Cas9 gebaseerde methode plaatst een transactivator reeks onder de endogene regulering van een vervangen gen, en bijgevolg vergemakkelijkt transctivator expressie uitsluitend in gen-specifieke Spatio patronen.

Een efficiënte strategie voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door het bewerken van het genoom

Het doel van dit protocol is om het ontwerp en de prestaties van in vivo experimenten in Drosophila melanogaster te schetsen om de functionele gevolgen van zeldzame genvarianten in verband met menselijke ziekten te beoordelen.

In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

We presenteren een protocol met een voorwaartse genetische benadering van het scherm voor mutanten die neurodegeneratie in Drosophila melanogastertentoonstellen. Het bevat een klim test, histologie analyse, genmapping en DNA-sequencing om uiteindelijk nieuwe genen te identificeren die verband houden met het neuroprotectie proces.

In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Celcyclusanalyse met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) en fosfo-histon H3 (pH3) etikettering is een procedure in meerdere stappen die uitgebreide optimalisatie kan vereisen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat alle stappen voor deze procedure beschrijft, inclusief beeldanalyse en kwantificering om cellen in verschillende celcyclusfasen te onderscheiden.

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol voor celcyclusprogressieanalyse in drosophila neurale stamcellen

Dit artikel neemt de phiC31-integrase-gemedieerde transgenese in Drosophila als voorbeeld en presenteert een geoptimaliseerd protocol voor micro-injectie van embryo's, een cruciale stap voor het creëren van transgene vliegen.

Embryo-micro-injectie voor transgenese bij Drosophila

Leer hoe je een Drosophila S2 cellijn genereert die gevoelig is voor kinesin-5 remmers om foutcorrectie tijdens celdeling te bestuderen. Deze methode maakt live-beeldvorming van spindel dynamiek mogelijk.

Het genereren van een "gehumaniseerde"

Meer video's verkennen