Name: CN-GELFrEE - Clear Inheems Gel-uitgewassen vloeibare fractie Entrapment elektroforese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Leer de CN-GELFrEE-techniek voor het fractioneren van native eiwitsamples met behoud van niet-covalente interacties. Deze methode biedt hoge opbrengst en resolutie voor analyse van eiwitcomplexen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De WM Keck Foundation royaal verstrekte financiering voor dit werk. Dit materiaal is gebaseerd op het werk ondersteund door FAPERJ onderzoek subsidie ​​100,039 / 2014 van de regering van Rio de Janeiro - Brazilië voor RDM, Science without Borders beurs 88.888,075416 / 2013-00 van het Coördinatieorgaan voor de verbetering van het hoger onderwijs personeel, onder de regering van Brazilië, voor HSS, de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder fellowship nummer 2014171659 voor OSS, en door CNPq onderzoek subsidie ​​202.011 / 2012-7 van de regering van Brazilië voor LHFDVPCH is een ontvanger van een Northwestern University&#39;s Chemistry of levensprocessen Institute Postdoctorale Fellowship Award.

Opmerking: Deze video protocol is gebaseerd op een bijbehorende publicatie 9. Specifieke reagentia, materiaal en apparatuur noodzakelijk alle stappen in dit protocol worden beschreven zijn opgesomd in de sectie materialen. De recepten en gegevens bereiding van alle benodigde oplossingen worden gespecificeerd in Tabel 1. 1. Het gieten van Gradient Tube Gels <ol><li> Montage van de Casting System <ol><li> Met een vlam verwarmd scheermesje of scalpel, snijd een 20 ml serologische pipet langs een orthogonale doorsnede 10 cm van de bovenkant van het afgifte-uiteinde. Zorg ervoor dat het snijvlak glad is. Houd het onderste stuk (met de punt) en gooi het bovenste stuk. Klem de onderste pipet stuk verticaal (kegelvormige punt naar beneden) om een ​​statief. LET OP: Raak de verwarmde mes metaal, gebruik de juiste handvatten of een tang om brandwonden te voorkomen. </li><li> Snij 3 cm van flexibele buizen en sluit deze aan op de snede pipet door strekken het overde afgifte-uiteinde. Sluit de stroomregelklep aan het andere uiteinde van de buis. </li><li> Verbinden de onderkant van de klep naar de afgifte-uiteinde van de gradiënt mixer met een buisstuk. Houd de klep open is. </li><li> Stel de gradiënt mixer op een magnetische roerder. Plaats magnetische bars in de mengkamers. </li><li> Plaats de afgifte-uiteinde van de gradiënt mixer 5-10 cm boven de bovenkant van de pipet stuk, teneinde de gel door zwaartekracht te gieten. </li><li> Test het systeem op lekkage met gedemineraliseerd water. Als er geen lekken worden gevonden, droogt het systeem door te blazen lucht in voordat u verder gaat. </li><li> Bedek de bovenkant van de pipet stuk met twee of meer lagen tape. Doorboren gat door de tape lagen in het midden van de cirkelvormige opening. Zorg ervoor dat de punctie is groot genoeg voor de glazen buis strak passeren. </li><li> Schuif de glazen buis, waar de gel zal worden uitgebracht, via de lekke gat, het uitrekken van de tape, zodat het glas strak past. iknsert de glazen buis zodat de bodem van de buis 2 mm boven de bodem pipet. </li><li> Controleer of de glazen buis wordt vastgehouden en gecentraliseerd en niet aanraken van de pipet muur zodra het systeem wordt voorbereid. Het systeem is nu gereed voor het gieten. </li></ol></li><li> casting Gel <ol><li> Bereid gel buffer, APS en Coomassie-oplossingen (oplossingen 1-3, tabel 1). </li><li> Bereid 12% T (oplossing 4, Tabel 1) en 1% T (oplossing 5, tabel 1) het scheiden gel oplossingen. Voeg 10 ul van Coomassie-oplossing in 12% T scheidende gel oplossing. APS en TEMED in beide oplossingen Snel voor het gieten in gradiënt mixer. LET OP: polyacrylamide is zeer neurotoxisch en handschoenen moeten worden gedragen. </li><li> Controleer de doseerklep van de gradiënt mixer gesloten. Voeg de 12% T scheiden geloplossing de mengkamer verst van het afgifte-uiteinde. Open de klep tussen beide kamers en laat de oplossing stromen into de volgende kamer. </li><li> Sluit de klep en pipet de ontwrichte 12% T scheidende gel oplossing terug naar de vorige kamer. Dit wordt gedaan om luchtbellen tussen de kamers te vermijden. </li><li> Voeg de 1% T scheiden geloplossing de mengkamer dichtst bij het afgifte-uiteinde. Zet de magneetroerder. </li><li> Open beide gradiënt mengkranen tegelijkertijd zodat de scheidende gel oplossingen te mengen en te stromen in de pipet en glazen buis. </li><li> Zodra de scheidende gel oplossingen in het verloop menger uitgeput, ontkoppelen de slang van de mixer en deszelfs een 10 ml spuit. Zorg dat het uiteinde van de buis steeds boven het vloeistofniveau in de pipet tot de spuit stevig is bevestigd. </li><li> Gebruik de spuit om duw de resterende scheiden gel oplossing uit de slang in de pipet en de glazen buis. Sluit de pipet klep alvorens luchtbellen in. </li><li> Voorzichtig een laagje van ongeveer 0,25 ml water verzadigde butanol (oplossing 6, Tabel 1) bovenop de geloplossing in de glazen buis de polymerisatiereactie uit zuurstof verzegelen lucht boven meniscus plat. </li><li> Reinig de stromende apparaat onmiddellijk met gedemineraliseerd water (gebruik geen wasmiddel). </li><li> Wacht nachts voor volledige gelpolymerisatie bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Losmaken Gel Tube uit Apparaatbeheer en opslaan <ol><li> De volgende dag, zorgvuldig verwijderen van de tape van de bovenkant van het apparaat. </li><li> Koppel de klep van de buis onder het pipet. Laat de pipet uit de klem en voer de stappen 1.3.3. en 1.3.4. boven de gootsteen. </li><li> Paar een 10 ml injectiespuit gevuld met gedeïoniseerd water om de flexibele buis. Duw water door de slang in de pipet, langzaam glijden de gepolymeriseerde gel uit de pipet. </li><li> Houd de pipet horizontaal en zorgvuldig zet de gel uitschuiven van het open einde. </li><li> Snijd overtollig polyacrylamide onder en around de glasbuis met een scheermesje. Zorg ervoor dat een glad uiteinde aan de gel in de buis te creëren, doordat het gelijk met het uiteinde van de glazen buis. </li><li> Verdeel resterende butanol vanaf de bovenzijde van de gel en zet de gelbuis per afgetopte 15 ml centrifugebuis. Meng 0,5 ml gel buffer (oplossing 1, Tabel 1) met 4,5 ml ultrazuiver water en voeg ongeveer 2 ml van de oplossing voor zowel de bovenzijde (binnen glazen buis) en de onderzijde (in centrifugebuis) van gelbuis. </li><li> Bedek de volledige bovenkant van de centrifugebuis, waaronder de glasbuis opening met parafilm buffer verdamping te voorkomen. Gels gedurende 2 weken bewaard bij 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Monstervoorbereiding <ol><li> Weeg twee muis harten en gehakt ze in een petrischaal met behulp van een scheermesje. </li><li> Voeg het verwerkte weefsel een vijzel en voeg voldoende vloeibare stikstof om het monster te dekken. Verpulveren van het weefsel met een stamper, het toevoegen van meervloeibare stikstof als het verdampt. </li><li> Zodra het weefsel grondig gemalen, laat de stikstof verdampen en voeg 1 ml lysis buffer (oplossing 7, tabel 1) bij 4 ° C voor elke 100 mg weefsel. Verplaats oplossing in een centrifugebuis. </li><li> Centrifugeer bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verzamel zorgvuldig de bovenstaande vloeistof in een nieuwe buis en gooi de pellet. Kwantificeren de eiwitconcentratie in het supernatant met behulp van de bicinchoninezuur-methode 12, of zoals de voorkeur. Opmerking: Native cellysaten of subcellulaire fracties kunnen worden bereid als voorkeur. CN-GELFrEE is compatibel met verschillende inheemse monster preparaten. </li><li> Bereid de solubilisatie bufferoplossing en laden oplossing (oplossing 8 en 9, tabel 1). </li><li> Als het monster een pellet te resuspenderen in 50-150 pl solubilisatiebuffer. Bewaar het monster op ijs gedurende 15 min. </li><li> Buffer wisselen de geresuspendeerde monster of het cellysaat met solubilization buffer met behulp van een 30-kDa MWCO ultra centrifugaal filter. </li><li> Centrifugeer het eiwit monster bij 4 ° C en 10.000 g gedurende 5-10 min of totdat de vastgehouden fractie volume tot ca. 20 pl. Gooi het doorstroomkanaal. </li><li> Voeg 400 ul van solubilisatie buffer aan de ingehouden fractie en meng door pipetteren. Centrifugeer bij 4 ° C en 10.000 g gedurende 5-10 min of totdat de vastgehouden fractie tot ca. 20 pl. Gooi het doorstroomkanaal. </li><li> Herhaal stap 2,9 nog tweemaal. </li><li> Verdun het gefiltreerde monster (ongeveer 20 ui) in 100 pl solubilisatiebuffer. </li><li> Voeg 20 ul van beladingsoplossing te proeven. </li></ol> 3. CN-GELFrEE Device <ol><li> Om CN-GELFrEE fractionering uit te voeren, de vervaardiging van de onderdelen van het apparaat door te verwijzen naar een werkplaats. Vervaardigen de onderdelen van het apparaat in Teflon. Zie Figuur 1 voor alle nodige informatie om de onderdelen en t vervaardigeno Tabel 2 voor het aantal benodigde onderdelen voor een bepaald apparaat. Veiligheidsoverwegingen: Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Zorg moeten worden genomen om de high-voltage voedingen, en alle knooppunten moet correct worden gemonteerd. Gebruik het apparaat of een aangrenzende natte ruimte niet aan terwijl de spanning is ingeschakeld en het omringende bank gebied droog te houden tijdens de elektroforese. Voorts moet de stroomvoorziening volledig worden uitgeschakeld bij het hanteren van het apparaat en / of het verzamelen van fracties. </li><li> Bereid de anode en kathode buffer buffer (oplossingen 10-11, Tabel 1) en bewaar ze bij 4 ° C of op ijs. </li><li> Breng het boveneinde van de gelbuis (uiteinde zonder gel) via een spacer, een O-ring en een tweede afstand in een &quot;sandwich&quot; mode. </li><li> Voeg de buffer kamer (kathode) na de tweede afstandhouder, passeren de schroeven volledig door de zijkant gaten, toe te voegen en draai de moeren aan beide kanten. Zorg ervoor dat de bovenkant van het glass buis is bevestigd voor de top opening van de buffer kamer, niet direct onder het of verleden. </li><li> Breng de onderkant van de gel buis door een tussenstuk, een O-ring, de verzamelkamer, en een tweede afstandhouder. </li><li> Voeg de buffer kamer (anode) na de tweede afstandhouder, passeren de schroeven volledig door de zijkant gaten, toe te voegen en draai de moeren aan beide kanten. Zorgen dat het ondereinde van de gelbuis is bevestigd boven de bovenste opening van de bufferkamer, maar sluit de achterwand niet raken. </li><li> Stel de CN-GELFrEE apparaat verticaal met de kathode buffer kamer boven het gebruik van een statief met klemmen. </li><li> Voeg buffer anode aan de anode bufferkamer (onder) en kathode buffer om de kathode bufferkamer (boven). Houd alle buffers bij 4 ° C. </li><li> Verwijder luchtbellen van binnen de glazen buis door zachtjes te tikken op de glazen buis en controleer het systeem op lekkage. </li><li> Controleer de platina-elektroden in contact zijn met de buffers in de kamers en dat beidegel buis uiteinden worden ondergedompeld in de buffer in elke kamer. </li><li> Sluit de stekkers uit het stopcontact aan de respectieve banaanstekkers: negatief op de kathode buffer kamer (boven) en positief over de anode buffer kamer (onderaan). </li><li> Laad het monster met behulp van een gel belasting tip naar boven oppervlak van de gel, binnen de gel buis. </li><li> Voer de elektroforese op 1 W constant, om oververhitting te voorkomen, totdat de rode kleurstof voorkant is aan de onderkant van de gel buis. LET OP: Schakel de voeding uit voordat u verdergaat. </li><li> Gooi anode en kathode buffers. </li><li> En los de moeren van de anode buffer kamer en demonteer de onderste afstandhouder en de kamer, het handhaven van een afstandhouder en de O-ring. Plaats de onderkant van de gel buis in de verzamelkamer, voordat de bovenste opening, dat eerdere of direct eronder. Duw de spacer en de O-ring in de buurt van de collectie kamer. </li><li> Knip een stuk cellulose dialysemembraan en hydrateren door alom tegenwoordige in anode buffer. Bedek de aperture tussen de verzamelkamer en de onderste afstandhouder met het dialysemembraan. </li><li> Monteer de anode buffer kamer na de tweede afstandhouder, toe te voegen en draai de schroeven en bouten. </li><li> Leg het toestel horizontaal over een ijsemmer. Voeg frisse anode en kathode buffers aan de buffer kamers en controleer het systeem op lekkage. </li><li> Voeg 150 ul van anode buffer in de collectie kamer. Sluit de netsnoeren aan de respectieve banaanstekkers. </li><li> Schakel de stroomvoorziening 3 mA constante stroom. De kleurstof voorkant moet dan beginnen te elueren in de buffer in de collectie kamer. </li><li> Wanneer de gehele kleurstof voorzijde wordt uitgewassen, schakelt u de stroomvoorziening en het verzamelen van de eerste fractie (0 min), het overbrengen van het in een laag-eiwit binding microcentrifugebuis. </li><li> Vul de opvangruimte met 150 ul van anode buffer. Houd alle verzamelde fracties op het ijs. </li><li> Verzamel fracties na de volgende tijdsintervallen uit de collectie van heteerste fractie: 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 45 min en 60 min. Houden geen rekening met de tijd, terwijl de stroomtoevoer is uitgeschakeld. Vergeet niet de voeding uit te schakelen voordat het verzamelen van de fracties en de opvangruimte te vullen met 150 ul van anode buffer tussen de monsters. Schakel de voeding weer aan na het verzamelen om te beginnen met het elueren van het volgende deel. </li><li> Verdeel de anode en kathode buffers en nieuwe oplossingen toevoegen bufferkamers na 60 min. Verzamel fracties van 90 min en 120 min. </li><li> Veranderen anode en kathode buffers per uur. </li><li> Voer een duidelijke inwoner of een blauwe inheemse pagina met de fracties en vlekken op het als voorkeur. Volg de instructies van de fabrikant of de voorkeur protocol. </li><li> Voer een reducerende SDS-PAGE en vlekken als voorkeur. Volg de instructies van de fabrikant of de voorkeur protocol. </li><li> Het schoonmaken van de GELFrEE breuken en voorleggen aan inheemse massaspectrometrie-analyses zoals beschreven previously 9. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53597/53597fig1.jpg" /> Figuur 1:. CN-GELFrEE apparaat (A) GELFrEE apparaat delen tekeningen en (B) foto van de vervaardigde onderdelen; (C) CN-GELFrEE inrichtingsamenstel schema: (1) bufferkamer, (2) spacer, (3) O-ring (4) gel buis (5) verzamelkamer, en (6) dialysemembraan. <img alt="tafel 1" src="/files/ftp_upload/53597/53597table1.jpg" /> Tabel 1: Tabel oplossingen. <img alt="tabel 2" src="/files/ftp_upload/53597/53597table2.jpg" /> Tabel 2: Tabel van GELFrEE onderdelen van het apparaat.

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cell+as+a+Collection+of+Protein+Machines%3A+Preparing+the+Next+Generation+of+Molecular+Biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li>
<li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).</li>
<li>Gavin, A. C., Bösche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).</li>
<li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tandem+Affinity+Purification+%28TAP%29+Method%3A+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li>
<li>Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+vanadium+complexes+in+serum%2C+packed+cells+and+tissues+of+Wistar+rats+by+means+of+gel+filtration+and+anion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22JBIC+J.+Biol.+Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography.</a> JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).</li>
<li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Scale+Density+Gradient+Sedimentation+to+Separate+and+Analyze+Multiprotein+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li>
<li>Bunai, K., Yamane, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+and+limitation+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+in+bacterial+membrane+protein+proteomics+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives.</a> J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).</li>
<li>Wittig, I., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+clear-native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of clear-native PAGE.</a> PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).</li>
<li>Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+GELFrEE%3A+A+New+Separation+Technique+for+Biomolecular+Assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies.</a> Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).</li>
<li>Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+Native+electrophoresis+to+study+mitochondrial+and+other+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes.</a> Methods. 26 (4), 327-334 (2002).</li>
<li>Tran, J. C., Doucette, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-Eluted+Liquid+Fraction+Entrapment+Electrophoresis%3A+An+Electrophoretic+Method+for+Broad+Molecular+Weight+Range+Proteome+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation.</a> Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).</li>
<li>Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

CN-GELFrEE is afgeleid van het natieve heldere (CN) PAGE buffersysteem dat een mengsel van anionische en neutrale wasmiddelen als dragermoleculen voor 9 molecuulgewicht-eiwitten fractionering gebruikt door een gelmatrix. De toepassing van de GN-GELFrEE om een ​​native muis hart eiwit extract gegenereerd lage complexiteit fracties met discrete bandbreedtes met behoud van niet-covalente interacties van biomoleculaire assemblies. Vergelijking van fracties tussen CN-PAGE en reducerende SDS-PAGE toonde plaatgels m...

De meeste biologische processen gebeurt in een cel worden bedacht door verzamelingen van eiwitten in plaats van één eiwit 1 uit te voeren. Bijgevolg, om de specifieke biologische functie van een eiwit subeenheid ontrafelen in een cel is het noodzakelijk om de structurele interacties met andere eiwitten of liganden in complexen 2 begrijpen. Echter, het bestuderen van eiwitten native, met behoud van hun niet-covalente interacties en de activiteit blijft uitdagend. Een tekortkoming van natief eiwit studies is een geschikt natief scheidingstechniek die compatibel is met verschillende stroomafwaartse eiwitanalyse technieken. Daarom heeft de recente interesse in scheidingstechnieken in staat is het karakteriseren van niet-covalente assemblages van biomoleculen fors 3 toegenomen. Eiwit scheidingstechnieken zijn noodzakelijk om de biochemie, biofysica en diverse andere studies. Huidige inheemse scheidingstechnieken hebben intrinsic tekortkomingen die compatibiliteit te verminderen met downstream-analyses, zoals lage resolutie, lage omzet, verlies voor neerslag, en de eis van grote hoeveelheden van de eerste steekproef. Tandem affiniteitszuivering wordt gebruikt voor eiwit interactie studies, maar het moet afzonderlijk voor elk eiwit doel uitgevoerd, waardoor het onverenigbaar met high-throughput analyse 4 zijn. Gelpermeatiechromatografie 5, selectieve precipitatie met ion affiniteitschromatografie 5 en dichtheid-gradiënt scheiding 6 hebben alle inheemse scheidingen voorzien, maar zijn inherent lage resolutie technieken en vereisen hoge initiële monster bedragen. Alternatief gel gebaseerde technieken, zoals Blue inheemse (BN) en Clear Eigen (CN) PAGE (ofwel 1-D of 2-D), weergegeven hoge resolutie scheiding. Bovendien, contrasteren met andere technieken genoemd, zowel inheemse PAGE scheidingen behouden oplosbaarheid en inheemse conformatie van een brede range van macromolecuul species, waaronder hydrofobe eiwitten. Deze mogelijkheid verbreedt verder het proteoom dekking te bereiken met deze methoden 7,8 en wordt bereikt door middel van verschillende chemie tussen CN en BN-PAGE. CN-PAGE berust gewoonlijk op zachte gebracht wasmiddelen als dragermoleculen, ter vervanging van de Coomassie Blue kleurstof in BN-PAGE. BN-PAGE, hoewel geassocieerd met een hogere resolutie, heeft kanttekeningen zoals verminderde enzymatische activiteit in de gescheiden eiwitten 8 en Coomassie molecule adduct formatie, waarbij de laatste zeer nadelig is voor downstream MS analyses 9. Beide methoden zijn echter traditioneel geassocieerd met lage terugwinning en smalle proteoom dekking voor verkleuring en gelextractie beperkingen 7. Voor de studie van gedenatureerde eiwitten, zijn er verschillende technieken die macromolecule oplosbaarheid houden tijdens het uitvoeren van hoge-resolutie fractionering met eiwitrijke terugwinning en die verenigbaar zijn met diVerse nascheiding eiwit analysetechnieken. Gel geëlueerd vloeibare fractie Vangst Elektroforese (GELFrEE) is een van de fractionering technieken die al deze kenmerken passen. Deze methode wordt voornamelijk toegepast in high-throughput top-down proteomics studies, wat aangeeft dat het is snel en veelzijdig. In GELFrEE, eiwitten gedenatureerd en gescheiden op basis van molecuulgewicht door een buisvormige gelmatrix, kan de porositeit daarvan worden gevarieerd gebaseerd op monstervereisten en de gewenste fractionering resultaten. Fracties worden geëlueerd in de vloeistoffase, waardoor de terugwinning beperkingen geassocieerd met SDS-PAGE onder handhaving van hoge resolutie verminderen. Fractie fracties kunnen vervolgens met 1-D PAGE worden geanalyseerd op moleculair gewicht bandbreedte selectie 11. Er is grote vraag naar de voordelen verbonden aan GELFrEE in inheemse scheidingstechnieken. De hierin beschreven werkwijze, Clear Indiaans GELFrEE (CN-GELFrEE), is een inwoner aanpassing van GELFrEE. Om compatibel met een breed s zijnpectrum van macromoleculen in hun natieve toestand, deze werkwijze berust niet alleen op de zachte CN-PAGE chemie, maar ook op een porositeit gradiëntscheiding, welk eiwit precipitatie vermindert door het elimineren van de ruwe overgang tussen poreusheid aanwezig discontinue gelsystemen 9. Toegepast op eiwitcomplexen geëxtraheerd uit muizenhart fractioneren, weergegeven geëlueerde fracties hoge herstel en een hoge-resolutie scheiding van uiteenlopende molecuulgewichten werd verkregen. Verder zijn de verkregen fracties zijn compatibel met de meeste downstream biochemische en biofysische analyses eiwit.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% acrylamide/bis solution, 37.5:1</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td>Deze oplossing is neurotoxisch.</td></tr><tr><td>6-aminohexanoic acid (&epsilon;-aminocaproic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td>Deze chemische stof is irriterend.</td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7727-54-0</td><td>Deze chemische stof is ontvlambaar, giftig en corrosief.</td></tr><tr><td>Coomassie blue G250</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylmaltoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4641</td><td>Deze chemische stof is irriterend.</td></tr><tr><td>Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td><td>FLUKA</td><td>3777</td><td>Deze chemische stof is giftig.</td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td>Deze chemische stof is giftig.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td>Elke leverancier</td><td>n/a</td><td>Bewaar vloeibare stikstof in containers ontworpen voor laag-temperatuur vloeistoffen</td></tr><tr><td>Mouse heart</td><td>Bioreclamation LLC</td><td>MSE-HEART</td><td></td></tr><tr><td>n-butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>71-36-3</td><td>Deze chemische stof is ontvlambaar en giftig.</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BP103</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78430</td><td>Deze chemische stof is giftig.</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td>Deze chemische stof is irriterend.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>JTBaker</td><td>4097</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td>Deze chemische stof is ontvlambaar en irriterend.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Trycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-071</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gradient mixer</td><td>Hoefer</td><td>SG15</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stir&nbsp;</td><td>Elke leverancier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic bars&nbsp;</td><td>Elke leverancier</td><td>n/a</td><td>Klein genoeg om in de gradietmixerkamers te passen.</td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5056</td><td>Voltage tot 1.500 V</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>022622552</td><td>Tot 15.000 x g</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml conische buis</td><td>Elke leverancier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa-MWCO ultra centrifugale filter</td><td>Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>Flexibele slang</td><td>Saint-Gobain</td><td>B000FOV1J0</td><td>Ongeveer 1 m lengte</td></tr><tr><td>IJsemmer</td><td>Elke leverancier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Liquid/air metalen of plastic klep. (bijv. aquarium lucht/water stroomsnelheid controle hendelklep)</td><td>Elke leverancier&nbsp;</td><td>n/a</td><td>Aquarium kleppen zijn compatibel.</td></tr><tr><td>Korstel en stamper</td><td>Elke leverancier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Native PAGE 3-12% T slab gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1003</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>Protein low bind buis 1,5&nbsp;ml</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Vleesmesblad</td><td>IDL Tools</td><td>TE05-091C</td><td></td></tr><tr><td>Geregenereerde cellulose dialyseslang 3.500 MWCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-152-9</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE slab gel voor elke kDa</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten (25&nbsp;ml)</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>Spuit (10 ml)</td><td>Elke leverancier</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

cn-gelfree - clear inheems gel-uitgewassen vloeibare fractie entrapment elektroforese

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

Eiwitcomplexen voeren een reeks belangrijke cellulaire functies. Ophelderen van hun niet-covalente interacties en dynamiek van het grootste belang voor het begrijpen van de rol van de complexen in biologische systemen. Terwijl de directe karakterisering van biomoleculaire assemblees in de afgelopen jaren steeds belangrijker is geworden, inheemse fractionering technieken die compatibel zijn met downstream analysetechnieken, met inbegrip van massaspectrometrie zijn, zijn nodig om deze studies verder uit te breiden. Niettemin, het veld mist een high-throughput, wide-range, high-recovery scheiding methode voor het natieve eiwit assemblages. Hier presenteren we duidelijke natieve geëlueerd vloeibare fractie insluiten elektroforese (CN-GELFrEE), wat een nieuw scheiding modaliteit voor niet-covalente eiwit samenstellen. CN-GELFrEE scheiding prestatie werd aangetoond door fractioneren complexen geëxtraheerd uit muis hart. Fracties werden verzameld gedurende 2 uur en weergegeven discrete banden variërend van ~ 30-500 kDa. Een conconsistente patroon van toenemend molecuulgewicht bandbreedte werd geobserveerd, elke variërend ~ 100 kDa. Verder latere heranalyse van natieve fracties via SDS-PAGE toonde molecuulgewicht verschuift in overeenstemming met de denaturatie van eiwitcomplexen. Daarom CN-GELFrEE werd bleek het vermogen om hoge resolutie en hoge recovery natieve scheidingen op eiwitcomplexen uit een groot molecuulgewichttraject bieden, die fracties die geschikt downstream eiwitanalyses zijn.

200 ug van eiwitten geëxtraheerd uit cryogeen gemalen muisharten werden native gefractioneerd in 14 fracties van 150 pl elk, met behulp van de methode CN-GELFrEE in een 1-12% T gel buis. Een hoeveelheid van 10 pl van elke fractie werd op een CN-PAGE plaatgel en zilver gekleurd. Een duidelijke afbeelding van de fractionering en resolutie verkregen met CN-GELFrEE fractionering wordt getoond in figuur 2A. Fracties werden verzameld gedurende twee uur en de gel assay toont ee...

Dit protocol beschrijft hoe je clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE) kunt voorbereiden en uitvoeren, een native scheidingstechniek voor niet-covalente biomoleculaire assemblages en eiwitten uit heterogene monsters die compatibel is met verschillende downstream-eiwitanalysetechnieken.

CN-GELFrEE - Clear Inheems Gel-uitgewassen vloeibare fractie Entrapment elektroforese

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Het algemene doel van deze nieuwe scheidingstechniek is het fractioneren van native monsters met een hoge terugwinning en resolutie, terwijl niet-covalente macromoleculaire interacties, zoals proteïnecomplexen, behouden blijven. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de studie van native macromoleculaire complexen, zoals de samenstelling en stoichiometrie van complexen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge terugwinning en de geringe monsterverdunning, wat ongeëvenaard is door elke andere native scheidingsmethode.Begin met het samenstellen van het gietsysteem. De eerste stap is om met een verhit mesje de punt van een serologische pipet van 20 milliliter af te snijden. Snijd loodrecht 10 centimeter vanaf de bovenkant van de doseerpunt.Klem vervolgens de afgesneden pipetpunt vast aan een statief. Snijd daarna een stukje slang van drie centimeter af om aan de punt te bevestigen. Trek één uiteinde van de slang over de punt en bevestig een debietregelklep.Verbind het ventiel met de doseertip van een gradiëntmenger met behulp van een ander stuk slang. Houd het ventiel voorlopig open. Plaats vervolgens de gradiëntmenger op een magneerroerder en pl

cn-gelfree-clear-native-gel-eluted-liquid-fraction-entrapment

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

De bijhorende video beschrijft het gebruik van de GELFREE 8100 Fractionation System, welke partities complex eiwit monsters op basis van moleculair gewicht en herstelt de fracties in de vloeibare fase. De video beschrijft hoe de technologie werkt, hoe het wordt gebruikt, en biedt resulterende data, met polyacrylamidegelelektroforese analyse van gefractioneerde runderen leverhomogenaat.

Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery

In deze video, beschrijven we de karakterisering van multiprotein complexen (MPL), door blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). In een eerste dimensie, worden gedialyseerd cellulaire lysaten gescheiden door BN-PAGE om individuele Mediterrane partnerlanden te identificeren. In een tweede dimensie SDS-PAGE, zijn mediterrane partnerlanden van belang verder onderverdeeld naar hun kiezers te analyseren door immunoblotting.

Blauwe Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de Analyse van multiprotein complexen van Cellular Lysaten

Ons protocol legt uit hoe meerdere eiwitten gels gieten in een tijd van recycling Invitrogen Nupage Novex MiniGel cassettes, en goedkope materialen die zijn aangeschaft bij een bouwmarkt te vinden. Deze voordelige gestroomlijnd werkwijze omvat een manier om de gels bewaren bij 4 ° C gedurende enkele weken. Door hergebruik van kunststof gel cassettes uit de handel verkrijgbare gels, laboratoria dat frequent eiwit gels draaien kan besparen aanzienlijke kosten en help het milieu.

Gieten en runnen van een eiwitgel door hergebruik van Commercial Cassettes

Een basisprotocol voor het scheiden van DNA-fragmenten met agarose gel elektroforese beschreven.

Agarosegelelektroforese voor de scheiding van DNA fragmenten

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Gel-seq kan onderzoekers gelijktijdig bereiden bibliotheken voor beide DNA - en RNA-seq op de te verwaarlozen extra kosten vanaf 100-1000 cellen met behulp van een eenvoudige hydrogel-apparaat. Dit document stelt een gedetailleerde aanpak voor de fabricage van zowel het apparaat als het biologische protocol voor het genereren van gepaarde bibliotheken.

Gel-seq: Een methode voor de voorbereiding van de bibliotheek van de gelijktijdige Sequencing van DNA en RNA met Hydrogel Matrices

Hier presenteren we een protocol te halen, op te lossen en te identificeren mitochondriale supercomplexen die blootstelling aan detergenten en Coomassie blauw minimaliseert. Dit protocol biedt een optimaal evenwicht tussen resolutie, en behoud van enzymactiviteiten, terwijl het minimaliseren van het risico om labiele proteïne-eiwitinteractie te verliezen.

Hybride duidelijke/blauwe inheemse elektroforese voor de scheiding en de analyse van mitochondrial Ademhalingsketen supercomplexen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van oligomere toestand van membraaneiwitten dat gebruik maakt van een inheems celmembraan nanodeeltjessysteem in combinatie met elektronenmicroscopie.

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Een protocol voor het gebruik van reactieflow hoogprestatievloeistofchromatografie kolommen voor methoden die post-kolom derivatisatie (PCD) toepassen, wordt gepresenteerd.

Bericht Column Derivatisering behulp Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Een tweedimensionaal modelmateriaal van discotisch zirkoniumfosfaat werd ontwikkeld. Het anorganische kristal met gelaagdde structuur werd gesynthetiseerd door hydrothermale, reflux- en microgolfgeassisteerde methoden. Bij exfoliatie met organische moleculen kunnen gelaagde kristallen worden omgezet in monolagen, en een nematische vloeibare kristalfase werd gevormd bij voldoende concentratie van monolagen.

Synthese en afschilfering van discotische zirkonium Fosfaten om colloïdale vloeibare kristallen te verkrijgen

Leer de CN-GELFrEE-techniek voor het fractioneren van native eiwitsamples met behoud van niet-covalente interacties. Deze methode biedt hoge opbrengst en resolutie voor analyse van eiwitcomplexen.

CN-GELFrEE - Clear Inheems Gel-uitgewassen vloeibare fractie Entrapment elektroforese

Meer video's verkennen