Het bijhouden van cellen in GFP-transgene zebravis Met behulp van de photoconvertible PSmOrange System

Het algemene doel van de PSmOrange fotoconversietechnologie is om cellen in het levende dier tijdens embryonale ontwikkeling en ziekte te volgen. Deze methode kan cruciale vragen in de ontwikkelingsbiologie beantwoorden, zoals het onthullen van de oorsprong van cellen die zich ontwikkelen tot weefsels en organen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden toegepast in GFP transgene achtergrond.

Deze methode kan ook worden toegepast in verschillende onderzoeksgebieden, zoals regeneratie, tumorprogressie en invasie. Na het genereren en inbedden van PSmOrange en GFP-expresserende embryo's volgens het tekstprotocol, plaatst u het embryo onder de confocale microscoop en gebruikt u het 20x luchtobjectief en 488 en 561 nanometer lasers om het specimen te scannen om een gebied te identificeren om te fotoconveren. Om het PSmOrange-eiwit vóór fotoconversie te detecteren, gebruikt u de 561 nanometer laser op 0,74 milliwatt vermogen gemeten op het focusvlak boven het objectief en past u het laservermogen indien nodig aan.

Pas de zoomfactoren aan om het gebied van belang te markeren en verminder de beeldacquisitietijd en fototoxiciteit. Gebruik de 488 en 561 nanometer lasers in sequentiële modus en een Z-stap tussen 1,0 en 2,0 micrometer om een Z-stack te verkrijgen die de structuren van belang dekt. Pas de lijngemiddelde en scanfrequentie aan om de beeldkwaliteit te optimaliseren.

Scan vervolgens het monster en selecteer het gebied van belang, of ROI-tool, om het gebied te markeren dat moet worden fotogeconverteerd voordat u het ROI als stimulatiegebied vaststelt. Selecteer de fotoactivatie-bleken module, vink het vakje aan om de 488 nanometer laser te activeren, stel vervolgens de 488 nanometer laser in op 80% en de scansnelheid op 0,5 seconden per frame. Open vervolgens het fotoconversiehulpprogramma en klik op 'Toevoegen' om het fotoconversieprotocol op te geven.

In het acquisitiestimulatiemenu stelt u Fase Een in op acquisitie en in het loopmenu geeft u het aantal beelden op dat vóór fotoconversie moet worden verkregen. Stel Fase Twee in op stimulatie en voer het aantal stimulatie-evenementen in dat moet worden uitgevoerd. Pas Fase Drie aan zoals beschreven voor Fase Een.

Optioneel voegt u een wachtfase in na Fase Twee door de tijd in te voeren die moet worden gewacht voordat de laatste ronde van beeldacquisitie wordt uitgevoerd. Zodra de parameters zijn ingesteld, past u de stimulatie-instelling toe en voert u de fotoconversie uit. Microscopische instellingen zijn cruciaal voor PSmOrange fotoconversie.

Om een succesvolle fotoconversie te garanderen, wordt het embryo direct na het experiment afgebeeld om het fotogeconverteerde PSmOrange-eiwit te detecteren. Als de conversie niet succesvol was, wordt de procedure herhaald. Gebruik de 488, 561 en 640 nanometer lasers, en stel de 640 nanometer laser in op hoog vermogen, tot 4,5 milliwatt, om een laatste z-stack te verkrijgen met de zojuist beschreven instellingen.

Om het embryo te demonteren, verwijdert u de kamer van de microscoop en gebruikt u een pincet om het embryo uit de agarose te verwijderen. Breng het embryo over in een nieuw gesteriliseerde plastic petrischaal of gesteriliseerde 6-well plate, bevattende 0,2 millimolair PTU in E3. Incubeer het embryo bij 28 graden Celsius tot de gewenste ontwikkelingsfase. Om het lot van fotogeconverteerde PSmOrange-eiwit-expresserende cellen te analyseren, inbedt u het embryo opnieuw volgens het tekstprotocol.

Scan onder de confocale microscoop het specimen om fotogeconverteerde cellen in de GFP transgene structuur van belang te identificeren. Gebruik de 488, 561 en 640 nanometer lasers om een z-stack te verkrijgen met een vaste stack van 1 tot 2 micrometer in sequentiële modus die de structuren dekt. Gebruik Image J Fiji-software om cellen te identificeren die GFP en het fotogeconverteerde eiwit co-expresseren.

Dupliqueer de originele stack, gebruik de Gaussiaanse waas plugin en de beeldcalculator om de gladde stacks van de originele af te trekken. Pas specifieke drempels toe op de groene en verre rode kanalen om de fotogeconverteerde cellen te markeren. Gebruik vervolgens de Analyse Deeltjes tool om de drempelgebieden in het groene kanaal te detecteren met een geschikte instelling.

Herhaal deze stap voor het verre rode kanaal. Open de beeldcalculator plugin om de co-lokaliserende cellen te detecteren. Geef de overlappende ROI's in het groen of het verre rode kanaal in geel weer met behulp van de Analyse Deeltjes tool.

Gebruik de NIS-Elements software om 3D-gegevensevaluatie uit te voeren en de stack in 3D weer te geven met behulp van de optie Volumeweergave tonen. Gebruik vervolgens de grafische interface om de groene, rode en verre rode kanalen te selecteren, pas de helderheid en het contrast aan en knip de 3D-stack bij om het fotogeconverteerde gebied te markeren. Hier wordt een voorbeeld van het PSmOrange fotoconversiesysteem in zebravis transgene FOXD3 drijvende hoofd GFP-embryo's getoond.

Op 26 uur na bevruchting werden twee celclusters in het voorste deel van de pijnappelklier fotogeconverteerd en onmiddellijk afgebeeld. Het eiwit werd gedetecteerd met een 640 nanometer verre rode laser, maar niet met een 561 nanometer laser. In deze cellen was de GFP-expressie aanvankelijk verminderd door fotobleken.

Op 52 HPF werden GFP en H2B PSmOrange gedetecteerd in de fotogeconverteerde H2B PSmOrange-eiwit-expresserende cellen. Enkele van deze cellen vormden de parapineal aan de linkerkant van de hersenen. Dit resultaat is consistent met eerdere rapporten over de parapineal celoorsprong in de voorste pijnappelklier en toont de toepasbaarheid van de PSmOrange-techniek in het levende GFP transgene werveldierde embryo.

Volgens deze procedure kan de celtracking-analyse worden uitgevoerd in genetisch gemanipuleerde embryo's om aanvullende vragen te beantwoorden over de moleculaire hiërarchieën die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van de cel.