Met behulp van Tomoauto: Een protocol voor High-throughput Automated Cryo-electron tomography
January 30th, 2016
We presenteren een protocol over hoe om high-throughput cryo-electron tomography gebruiken om hoge resolutie in situ structuren van moleculaire machines te bepalen. Het protocol maakt grote hoeveelheden gegevens te verwerken, vermijdt gemeenschappelijke resource bottlenecks en vermindert stilstand, zodat de gebruiker zich concentreren op belangrijke biologische vragen.
Het algemene doel van deze procedure is om gebruikers te helpen een hoogwaardige verzamelings- en verwerkingspijplijn voor cryo-elektronentomografie op te zetten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cryo-elektronentomografie, zoals: hoe ga ik om met gegevens die zijn verzameld met detectieapparatuur van de nieuwste generatie, en verwerk ik een enorme hoeveelheid gegevens die is geproduceerd door geautomatiseerde software voor schuifserieverzamelingen? Het grote voordeel van deze techniek is dat de gebruiker meerdere softwarepakketten op een uniforme manier kan configureren om een efficiënte pijplijn voor geautomatiseerde schuifserieverwerking te vinden, waardoor er meer tijd kan worden besteed aan tomogramanalyse.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in cryo-ET problemen ondervinden omdat er veel vervelende stappen nodig zijn om de enorme hoeveelheden gegevens die door de elektronenmicroscoop worden gegenereerd, te verwerken. We hadden vijf jaar geleden voor het eerst het idee voor deze ontwikkeling toen we handmatig honderden stappen moesten doorlopen om een 3D-reconstructie van een bacterie te krijgen. Raadpleeg vooraf het tekstprotocol over het voorbereiden van Shigella flexneri minicellen.
Bereid vervolgens de elektronenmicroscopie rasters voor zoals uitgelegd door een bestaande JoVE-publicatie en ook gedocumenteerd in het tekstprotocol. Nadat u de EM-fase met de verzameling van minicellen ingeslagen in verglaasd ijs hebt geladen, begint u met het verzamelen van kaarten met lage vergroting voor de schuifserie. Terwijl u de fluorescente scherm bij lage vergroting, ongeveer 2300x, bekijkt, zoekt u rastervierkanten die acceptabel zijn om af te beelden.
Deze locatie moet dun ijs en het onderwerp van belang bevatten zonder verontreinigingen. Pas vervolgens de weergave aan naar het centrum van het rastervierkant en klik op de knop Fasepositie toevoegen om de locatie op te slaan. Herhaal vervolgens het proces totdat alle acceptabele rastervierkanten hun locatie hebben opgeslagen.
De volgende stap begint met het openen van een nieuw montagebestand. In het instellingsdialoogvenster stelt u de X en Y in zodat het hele rastervierkant wordt vastgelegd. Voor een standaard 200 rasters, maak een 10 bij 10 ruimte met een hoge Binning-waarde, zoals acht.
Schakel ook de fase verplaatsen in plaats van de afbeelding verplaatsen optie en de correlaties overslaan die worden gebruikt om stukken uit te lijnen optie. Klik nu in het Navigator-venster op de eerste fasepositie die moet worden verkregen met behulp van de knop Verwerven. Doe dit voor elke fasepositie.
Klik vervolgens onder het Navigator-menu op Verwerven op punten. Schakel in het dialoogvenster dat opent het verkrijgen van kaartbeeld en ruwe eucentriciteit in. Schakel alle andere opties uit.
Klik vervolgens op Doorgaan, en er wordt een montage gemaakt voor elke fasepositie. Ga door met werken met de SerialEM-software. Selecteer in de Navigator de verkregen kaarten en klik op Kaart laden.
Klik vervolgens op Punten toevoegen en selecteer de punten op de kaart waar de schuifserie moet worden verkregen. Klik na het maken van de selecties op Stop met het toevoegen van punten en herhaal het proces met elke verzamelde kaart. Open vervolgens de parameters onder het menu Camera en stel de Focus-, Trial- en Recordmodi in.
De optie om dosisgefractureerde gegevens op te nemen kan van bijzonder belang zijn, en dat kan worden gespecificeerd onder de Record-opties. Selecteer een van de punten in de kaart die momenteel wordt bekeken en schakel de schuifserie-optie in het Navigator-venster in. Kies in het dialoogvenster dat opent de parameters voor de schuifserie.
Herhaal vervolgens het proces van het schakelen van de schuifserie-optie voor elk van de geselecteerde punten op de kaart. Start vervolgens vanuit de Navigator de optie Verwerven op punten. Schakel onder het dialoogvenster de Voorbereidende taken, Uitlijnen naar item, Autofocus en ruwe eucentriciteit in.
Stel vervolgens de primaire taak in om schuifserieën te verwerven en kies de kolomwaarden sluiten bij einde om de kolom te sluiten wanneer alle punten zijn verzameld. Wanneer het proces wordt uitgevoerd, wordt er een schuifserie verzameld op elk punt dat voor schuifserieverzamelingen is ingeschakeld in elke kaart. Met de originele schuifserie, het uitvoerlog van SerialEM en de individuele dosisgefractureerde beelden allemaal in de huidige werkmap, voert u in een terminal de volgende opdracht uit om het door de straal veroorzaakte bewegingsartefact te verwijderen.
Ga door met het uitlijnen en reconstrueren van de schuifserie. Typ de tomoauto-opdracht in de terminal als volgt. Voeg aan de opdracht de bestandsnaam van de schuifserie toe die moet worden verwerkt, gevolgd door de diameter van de referentie in nanometer.
Als CTF-verwerking niet wenselijk is, laat u de optie eenvoudigweg weg in de opdracht. Deze opdracht is het belangrijkste gebruik van tomoauto, waardoor gebruikers alle processen die betrokken zijn bij het uitlijnen van een schuifserie, die oorspronkelijk handmatige gebruikersinterventie vereisten, in één opdracht kunnen uitvoeren, waardoor gebruikers snel batchverwerking kunnen scripten. Bekijk nu met de 3dmod-opdracht de uitgelijnde schuifserie op eventuele flagrante fouten.
Hier is filename de naam van de schuifserie zonder achtervoegsel. Inspecteer vervolgens de geschatte CTF met de hier getoonde opdracht. Nogmaals, filename is de naam van de schuifserie zonder achtervoegsel.
Controleer ook in het uitvoerlog geproduceerd door de tomoauto-opdracht de resterende fout van de uitlijning. Dit is een kwantitatief maat voor de algehele kwaliteit van de uitlijning. Als de uitlijning acceptabel is, gaat u verder met het berekenen van de reconstructie.
Deze opdracht is ingesteld om de CTF te corrigeren en de referentiemarkeringen die zijn gebruikt voor uitlijning uit de schuifserie te wissen. Gebruik deze opdracht om de visuele inspectie over te slaan en direct door te gaan naar de reconstructie. Tomoauto heeft veel toegankelijke opties.
Een in het bijzonder is de mogelijkheid om lokale configuraties op te nem
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een high-throughput cryo-elektron tomografie methode voor het bepalen van hoge resolutie in situ structuren van moleculaire machines. Het stroomlijnt de gegevensverwerking, minimaliseert knelpunten en vermindert resource-downtime, waardoor onderzoekers zich kunnen concentreren op belangrijke biologische vragen.
Belangrijkste Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Cryo-elektron tomografie
- Moleculair biologie
- Structureel biologie
Achtergrond
- High-throughput verzamelen en verwerkingspijplijn voor cryo-elektron tomografie.
- Uitdagingen bij het omgaan met gegevens van nieuwe generatie detectoren.
- Behoefte aan efficiënte verwerking van grote datasets uit geautomatiseerde tilt-series verzamelen.
- Historische context van handmatige gegevensverwerking in cryo-ET.
Doel van Studie
- Om een stroomlijnd protocol voor cryo-elektron tomografie te vestigen.
- Om geautomatiseerde verwerking van tilt-series gegevens te faciliteren.
- Om de efficiëntie van tomogram analyse te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- High-throughput cryo-elektron tomografie protocol.
- Configuratie van meerdere softwarepakketten voor gegevensverwerking.
- Geautomatiseerde tilt-series verzamelen technieken.
- Voorbereiding van Shigella flexneri minicellen voor analyse.
Belangrijkste Resultaten
- Vermindering van vervelende stappen vereist voor gegevensverwerking.
- Verbeterde efficiëntie in het verwerken van grote datasets.
- Verbeterde focus op biologische vragen door middel van een stroomlijnde workflow.
- Succesvolle toepassing van het protocol in het genereren van 3D reconstructies.
Conclusies
- Het protocol vereenvoudigt het cryo-elektron tomografie proces aanzienlijk.
- Het stelt onderzoekers in staat om meer tijd door te brengen op analyse in plaats van gegevensverwerking.
- Toekomstige toepassingen kunnen ons begrip van moleculaire machines verder verbeteren.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput cryo-electron tomography addresses the bottleneck in structural biology data processing, enabling rapid generation of 3D macromolecular complexes in native cellular contexts. By automating tilt-series collection and alignment, the method reduces manual intervention and accelerates target validation workflows in early discovery. This supports predictive confidence in mechanistic de-risking for antimicrobial and virulence target programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables visualization of intact macromolecular machines like type III secretion systems in near-native states for functional target interrogation.
- Operational Value: Reduces time spent on manual data handling, allowing scientists to focus on biological hypothesis testing rather than processing bottlenecks.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces sub-tomogram averages that improve contrast and resolution for reliable structural phenotyping of drug targets.
- Operational Value: Standardizes data collection and processing via tomoauto, enabling reproducible outputs across large datasets for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides 3D reconstructions at ~2.7 nm resolution to support mechanistic understanding of virulence complexes in disease-relevant systems.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by generating quantifiable structural data for target prioritization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by delivering high-resolution structural insights on macromolecular complexes in situ.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing macromolecular assemblies in native cellular environments.
- Screening: Enables assay standardization through automated tilt-series processing and quantitative alignment quality metrics.
- Analytics: Delivers residual error measurements from tomoauto output logs as objective indicators of alignment quality for data-driven decisions.
- Translational Research: Connects structural data to preclinical advancement by resolving complexes in mutant or conditioned states for structure-guided design.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, configurable pipeline via local configuration files in tomoauto for consistent application across diverse targets and datasets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through high-resolution in situ imaging.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability, allowing nearly 100 tilt-series per day and alignment in ~20 minutes per series.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable structural data early in the discovery pipeline, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on resolvable structural states and complex dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-electron microscopy, SerialEM operation, and tomoauto command-line processing.
- Dependent on 300kV cryo-TEM with direct detection camera and computational infrastructure for tilt-series alignment and reconstruction.
- Necessitates cross-team standardization of grid preparation, data naming, and local configuration files for consistent processing.
- Involves adaptation considerations for varying ice thickness, sample contamination, and fiducial marker labeling across model systems.
- Includes practical limitations such as alignment success rates of 80–90% for collected tilt-series, requiring manual rescue for failed cases.
