Name: Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de Enterococcus spp. En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Leer een duplex digitale PCR-methode voor gelijktijdige kwantificering van Enterococcus spp. en de HF183-marker in recreatiewater. Deze techniek elimineert standaardkrommen en verbetert de nauwkeurigheid van waterkwaliteitsmonitoring.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs hebben geen erkentelijkheden.

1. Assay Mengsel Voorbereiding <ol><li> Maak 100 micromol / l voorraad concentraties voor alle primers in moleculair-biologische kwaliteit water en sondes in TE pH 8 buffer [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3]. Opmerking: Probes voor de twee doelen worden fluorescent gelabeld met verschillende fluoroforen 7, zoals aangegeven in de lijst van materialen / Equipment. </li><li> Bereid master mix door het mengen, per reactie gepland, 12 pi digitale PCR-mix (2x voorraad, zie lijst van materialen / Equipment), 0,216 ul elke voorwaartse en achterwaartse primer, 0,06 ui elke fluorescente probe, en 5,016 ul nuclease vrij water (uiteindelijke concentratie : 900 nM van elke primer, 250 nM elke probe). Pipet op en neer ten minste 10 keer te mengen terwijl het nemen van de nodige voorzichtigheid luchtbellen te introduceren in de oplossing. </li><li> Pipet 18 ul master mix (uit stap 1.2) in een gewone PCR-buis of plaat, het mengen in 6 pl DNA-template (gewonnen zoals beschreven Previously 13) assay mengsel druppel generatie te maken. Als het uitvoeren van monsters in tweevoud, pipet 36 pi master mix en 12 pl DNA-template in elk putje. Laat de overeenkomstige repliceren putten leeg op het bord. Inclusief positieve controles (zie lijst van materialen / Equipment) en geen template controles (NTC) (dwz met moleculair-biologische kwaliteit water gebruikt als de template). Let op: de positieve controle is nodig om te zorgen voor de test is goed werkt en de NTC is noodzakelijk om te zorgen dat er geen verontreiniging in de plaat en de tl-basislijn later in data-analyse. Eerste keer dat gebruikers wordt aangeraden om zowel onverdund en verdund DNA-monsters te gebruiken. </li></ol> 2. Droplet Generation en PCR Plate Setup <ol><li> Meng de test mengsels door pipetteren neer op ongeveer 15 keer met behulp van een multichannel pipet. Zorg ervoor dat de pipet tip blijft binnen vloeistof te voorkomen dat overtollige luchtbellen in het mengsel. </li><li> insert patroon 1 (met 8 putten) in een witte patroonhouder en klik op de patroonhouder dicht. Cartridge 1 is nu stevig op zijn plaats en kan niet losraken van de houder tijdens het genereren van druppels. Met behulp van een multichannel pipet voorzichtig overdracht 20 ul van assay mengsel in de middelste stand van de cassette gemarkeerd als &#39;Sample&#39; zonder dat er luchtbellen. </li><li> Pipet in 70 pl droplet generation olie aan de linkerkant van de cassette (gemarkeerd &quot;Olie&quot;). </li><li> Cartridgedeksel met een pakking zorg ervoor dat de pakking vlak en gelijkmatig gehouden door de 4 ticks naar de rand van de cartridge. Op de groene verlichte knop op de druppelgenerator te openen en plaats de cartridge. Druk nogmaals op groen verlichte knop om de generator te sluiten. Let op: Als de deur sluit, wordt de knop grijs wordt weergegeven, kan de deur niet worden heropend en druppel generatie begint onmiddellijk voortgezet gedurende ongeveer 1 minuut. </li><li> Als het doen van meer dan 8 reacties, plaats cartridge 2 in een tweedewitte patroonhouder en bereid op dezelfde wijze als cartridge 1 terwijl de druppel generatie huidige totale insteltijd bespaart. </li><li> Open de druppel generator deur toen de schemerige verlichte toets wordt groen aangeeft voltooiing van druppel generatie. Verwijder de witte patroonhouder met patroon 1, opzij te zetten, en plaats cartridge 2 op de druppel generator. </li><li> Verwijder de pakking van cartridge 1 en gooi. Voorzichtig de totale (ongeveer 40 pl) van druppels gegenereerd brengen van de derde kolom van de patroon (gemerkt &#39;druppeltjes) op een uiteindelijke PCR plaat (bij kamertemperatuur gehouden) voor de temperatuurcycli. Let op: niet unclick de witte patroonhouder als de actie kan de nieuw gegenereerde druppels breken; alleen de patroonhouder openen nadat de druppeltjes zijn overgedragen aan de uiteindelijke plaat. </li><li> Herhaal stap 2,1-2,7 voor extra monsters. </li><li> Wanneer alle druppels zijn in de laatste PCR-plaat, plaats een te doorboren isfolie deksel op de top van het bord en leg deze op een bord sealer. Stel de sealer tot 180 ° C, druk op &#39;Play&#39; op de sealer en laat afdichting voor 10 sec. </li></ol> 3. Thermische Fietsen en Droplet Reading <ol><li> Plaats de verzegelde plaat op de thermische cycler, die verenigbaar is met de uiteindelijke PCR-plaat gebruikt in stap 2,7 en een temperatuur ramping snelheid van 2,0 ° C / sec. </li><li> Run thermische programma als volgt: 10 min bij 95 ° C, gevolgd door 40 cycli van 30 sec bij 94 ° C en 60 sec bij 60 ° C, gevolgd door een 10 minuten houden op 98 ° C (optioneel: Eindhandhavingstijd bij 4 of 15 ° C). </li><li> Na voltooiing van de wielersport, de overdracht van de plaat naar een Droplet Reader voor automatische meting van de fluorescentie in elke druppel in elk putje. Alternatief bewaar de plaat bij 4 ° C gedurende maximaal 3 dagen vóór droplet lezen. Zorg ervoor dat de druppels op kamertemperatuur zijn voordat u verder gaat met het lezen. <ol><li> Open de bijbehorende software te installeren de druppel lezen. Inhet menu default &#39;Setup&#39; bevat een schematische weergave van een lege plaat met 96 putjes, dubbelklikt u op goed A1 naar het menu met drie secties te openen: &#39;Sample,&#39; &#39;Assay 1&#39; en &#39;Assay 2. &quot; </li><li> In de sectie &#39;Sample&#39; typt u het monster-ID in het vak &#39;Naam&#39; en druk op enter of vink het vakje rechts gemarkeerd als &#39;Toepassen.&#39; Klik vervolgens op de drop down menu met het label &#39;Experiment&#39; en kies &#39;RED&#39; (zeldzame gebeurtenis detectie) en klik op Enter. </li><li> Ga naar de sectie aangeduid &#39;Assay 1. &quot; In de rubriek &#39;Name&#39; invullen van de test (bv Enterococcus) en klik op Enter. In het vak onder het label &#39;Type&#39; klikt u op het drop down menu en kies &quot;Channel 1 Unknown &#39;en klik op Enter. </li><li> Ga naar de sectie aangeduid &#39;Assay 2. &quot; In de rubriek &#39;Name&#39; invullen van de test (bijv HF183) en klik op Enter. In het vak onder het label &#39;Type&#39; klikt u op het drop down menu eend Kies &#39;Channel 2 Unknown&#39; en klik op Enter. Alle informatie van Stappen 3.3.2 tot en met 3.3.4 is nu aanwezig in goed A1. </li><li> Naam alle volgende putjes bevattende druppeltjes. Om de totale setup-tijd te besparen, klikt u op &#39;Shift&#39; of &#39;Ctrl&#39; om meerdere bronnen tegelijk te kiezen. </li><li> Wanneer de digitale weergave van de plaat weerspiegelt de fysieke plaat, druk op &#39;OK&#39; in de rechterbenedenhoek van het menu. In het nieuwe menu dat op de top van de plaat schematisch weergegeven, onder de rubriek &#39;Template&#39; kies &#39;Opslaan als&#39; en de naam en sla de plaat. </li><li> Aan de linkerkant van het scherm klikt u op &#39;Run&#39; en kies de juiste Dye is gevestigd in het venster pop-out &quot;Run Options&quot;. Het verzamelen van gegevens initieert en wordt weergegeven in real-time in de software. </li></ol></li></ol> 4. Data Analysis and Reporting <ol><li> Wanneer de lezer klaar is en een doos verschijnt onder vermelding van &#39;Run Complete&#39;, klikt u op &#39;OK&#39;. Opmerking: De zachteware geeft de definitieve gegevens bestand onder de rubriek &#39;Analyze&#39; van de software. In deze visie, de software heeft alle putjes in de plaat geselecteerd en wordt standaard de &#39;2D Amplitude&#39; data plot. </li><li> Controleer de scheiding tussen de positieve en negatieve druppels. Zorg ervoor dat de fluorescentie in alle druppels in de NTC putten zijn in de buurt van de basislijn. </li><li> Klik op de knop &#39;Events&#39;. Aan de rechterkant van de gepresenteerde histogram op het vak met de naam &#39;Total&#39; en het vak met de naam &quot;single&quot; aan de onderkant van het totale aantal aanvaarde druppels per goed weer te geven. Exclusief eventuele putjes die &lt;10.000 druppeltjes 7 door de Ctrl-toets ingedrukt en klik op de put (s) te worden uitgesloten. </li><li> Klik op de knop aangeduid als &quot;1D amplitude om de fluorescerende grenswaarde van ongeveer één standaardafwijking (500-700 fluorescentie-eenheden) boven de negatieve druppels in NTC putjes beide doelen. Aan de zeer linkerkant van het scherm under de &#39;Auto Analyze&#39; toont twee drempel knoppen, kiest u het pictogram om de juiste die een stevige roze horizontale lijn die door het heeft. </li><li> Klik in het vak aan de linkerkant van &#39;Set Threshold&#39; onder elk van de amplitude grafieken en voer de juiste fluorescentie-drempelwaarden. Het doelwit concentraties in exemplaar per ul reactie worden dan automatisch berekend. Opmerking: De drempelwaarden hoeven niet identiek voor de verschillende doelen omvat. </li><li> Exporteer de resultaten in een CSV-bestand door te klikken op de knop &#39;Export&#39; in de linker bovenhoek op het scherm 1D Amplitude. In het CSV-bestand, vermenigvuldig de geëxporteerde doelconcentratie met 4 om te zetten van een kopie van het doel (23S-gen van Enterococcus spp. Of de HF183 marker) per ul reactie te kopiëren van target per pl DNA-template. </li></ol>

<ol><li>Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/">http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/</a> (2012).</li>
<li>Boehm, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+forty-one+microbial+source+tracking+methods%3A+A+twenty-seven+lab+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).</li>
<li>Layton, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+human+fecal+anaerobe-associated+PCR-based+assays+in+a+multi-laboratory+method+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platform%2C+reference+material%2C+and+quantification+model+on+enumeration+of+Enterococcus+by+quantitative+PCR+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods.</a> Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).</li>
<li>Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPN+estimation+of+qPCR+target+sequence+recoveries+from+whole+cell+calibrator+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples.</a> J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Digital+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
<li>Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+for+simultaneous+quantification+of+general+and+human-associated+fecal+indicators+for+water+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment.</a> Water Res. 70, 337-349 (2015).</li>
<li>Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Digital+PCR+for+Absolute+DNA+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification.</a> Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).</li>
<li>Whale, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microfluidic+digital+PCR+and+conventional+quantitative+PCR+for+measuring+copy+number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation.</a> Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+food+and+feed+aamples+with+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR.</a> PLoS One. 8 (5), e62583(2013).</li>
<li>Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf">http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf</a> (2012).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+molecular+community+analysis+methods+for+discerning+fecal+sources+and+human+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste.</a> Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Er zijn een paar kritische stappen in het protocol. Ten eerste, het mengen van de proefmengsels kan moeilijk zijn omdat de master mix viskeuzer dan conventionele qPCR mastermengsels. Eenvoudige vortexen kan leiden tot onvoldoende menging, wat leidt tot niet-uniforme verdeling van DNA templates in de proefmengsels en vervolgens in de druppeltjes. Het mengen-by-pipetteertechniek beschreven in het protocol moet worden gevolgd om nauwkeurige dPCR kwantificering te verzekeren. Ten tweede is het belangrijk ervoor te zorgen dr...

Kwantitatieve PCR (qPCR) methoden zijn op grote schaal gebruikt voor recreatieve monitoring van de waterkwaliteit en microbiële bron tracking-toepassingen, omdat ze sneller, flexibeler en specifiek in vergelijking met de traditionele cultuur-gebaseerde methoden. Bijgevolg qPCR wordt aanbevolen voor de verwezenlijking van snelle water monitoringsresultaten voor algemene fecale indicatoren zoals Enterococcus spp. In het herziene USEPA recreatiewater kwaliteitscriteria 1. Vele qPCR assays zijn ontwikkeld en gevalideerd voor het identificeren van bronnen van fecale verontreiniging aard in water 2. Een daarvan is de HF183 marker assays zijn de meest vaak gebruikt voor het identificeren van menselijke fecale verontreiniging geassocieerde 3. Toch kan qPCR resultaten vaak een vertekend beeld geven, omdat ze vertrouwen op de standaard curves voor de kwantificering. qPCR kwantificeert onbekende concentraties van het doel in monsters door interpolatie van hun kwantificering cyclus (Cq) uit een standaard curve die een lineair verband tussen Cq en logaritmische hoeveelheid van een reeks serieel verdunde standaarden beschrijft. Gebrek aan betrouwbare en consistente standaard referentiemateriaal kan dus sterk vertekening qPCR resultaten. Studies toonden aan dat qPCR resultaten verschilden ca. ½ log behulp standaarden van verschillende leveranciers 4 en 2 maal met verschillende batches van standaarden van dezelfde leverancier 5. Digitale PCR (dPCR) technologie kwantificeert een onbekend monster door het tellen van de frequentie van treffers bij grote aantallen miniatuur PCRs die worden gegenereerd door het verdelen van een bulk qPCR in duizenden of miljoenen uniform nanoliter of picoliter 6 reacties. Het wordt aangeduid als druppel digitale PCR (dwz dit artikel) of kamer digitale PCR, respectievelijk, indien de schotten in water-in-olie druppeltjes (dwz dit artikel) of kleine kamers op een chip. Een hogere concentratie van het monster zal resulteren in aanwezigheid van doel DNA(Vandaar positieve PCR) in een groter deel van de scheidingswanden, een relatie benaderd door Poisson verdeling. Als zodanig worden de binaire resultaten (positieve of negatieve PCR) genoteerd en de frequentie van positieve druppels wordt gebruikt om onbekende monster concentraties berekenen direct via Poisson benadering, waardoor de noodzaak voor een standaardkromme zoals in qPCR. Dit binaire aard van digitale PCR kwantificering biedt extra voordelen ten opzichte van qPCR 7. Omdat vertraagde versterking nog steeds een positieve PCR kan opleveren, dPCR kwantificering is robuuster tegen remming die amplificatie-efficiëntie vermindert. Evenzo is dPCR kwantificering niet beïnvloed door variabiliteit in Cq waarden volgens qPCR, leidt tot een hogere nauwkeurigheid van dPCR opzichte qPCR 8-10. Bovendien, de partitionering proces zorgt voor een zeer kleine hoeveelheid doel-DNA aanwezig in elke druppel effectief minimaliseren substraatcompetitie (in amplification van verschillende DNA-targets) die gemeenschappelijk belemmeringen voor het bereiken van dubbelzijdig afdrukken (dwz een test meet gelijktijdig twee DNA-doelen) in qPCR zijn. Als zodanig, of run in duplex of simplex (dwz één doelstelling wordt gemeten in een enkele test) dPCR produceert bijna niet te onderscheiden kwantificering van beide doelen 7,11. Het doel van de digitale PCR (EntHF183 dPCR) in dit artikel is om gelijktijdige directe kwantificering van de algemene fecal indicator Enterococcus spp verkrijgen. En de menselijke fecale geassocieerd HF183 marker met verbeterde nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en robuustheid tegen remming tov de qPCR tegenhangers. Deze test is met succes gebruikt voor het kwantificeren van fecale besmetting in milieu- zoet water, zeewater, en diverse fecaal materiaal 7, maar kan ook worden toegepast op andere vormen van water en afvalwater. Deze test houdt grote belofte voor het analyseren van sedimenten en bodems te wijten aan hets hoge tolerantie voor remming, maar verder onderzoek nodig is vanwege de complexiteit van de inhibitor mengt in dit soort monsters.

<table><tbody><tr><td>Low Bind Microtubes</td><td>Costar</td><td>3207</td><td>Voor opslag van reagentia, monsters/productie van master mixes</td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>FisherSci</td><td>BP2484-50</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8 buffer</td><td>FisherSci</td><td>BP2473-100</td><td></td></tr><tr><td>Hardshell 96 Well Plate</td><td>BioRad</td><td>HSP-9601</td><td>Voor initiële master mix en monsterinoculatie</td></tr><tr><td>Aluminum Sealing Film</td><td>BioRad</td><td>359-0133</td><td>Om monstersplaat te verzegelen</td></tr><tr><td>Droplet Generator</td><td>BioRad</td><td>186-3002</td><td></td></tr><tr><td>Droplet Generation Oil</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartridge Holder</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>Gasket</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>20 &#956;l pipet tips</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>Voor het overbrengen van monster/master mix naar cartridge</td></tr><tr><td>200 &#956;l pipet tips</td><td>Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>Voor het overbrengen van druppels naar de uiteindelijke Twin.Tec plaat</td></tr><tr><td>Twin.Tec 96 Well Plate</td><td>Eppendorf</td><td>951020320</td><td>Voor thermisch cycliseren en lezen van de uiteindelijke druppels</td></tr><tr><td>Pierceable Heat Seal Foil</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td>Om Twin.Tec plaat te verzegelen voor thermische cyclisering</td></tr><tr><td>PX1 PCR Plate Sealer</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Thermalcycler</td><td>BioRad</td><td>CFX96 en C1000</td><td>Alleen de thermische cycliser is nodig, geen optica</td></tr><tr><td>QX100 Droplet Reader</td><td>BioRad</td><td>186-3001</td><td></td></tr><tr><td>Droplet Reader Oil</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>Droplet PCR Supermix&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3024</td><td>d.w.z. de digitale PCR-mix in manuscript</td></tr><tr><td>QuantaSoft software (v1.3.2)</td><td>Quantasoft&nbsp;</td><td>QX100&nbsp;</td><td>Voor het bekijken, analyseren en exporteren van ddPCR-gegevens</td></tr><tr><td>Entero Forward Primer (Ent F1A)</td><td>Operon</td><td>GAGAAATTCCAAACGAACTTG</td><td>Alternatieve leverancier kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Entero Reverse Primer (Ent R1)</td><td>Operon</td><td>CAGTGCTCTACCTCCATCATT</td><td>Alternatieve leverancier kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Entero Probe (GPL813TQ)</td><td>Operon</td><td>[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]</td><td>Alternatieve leverancier kan worden gebruikt, maar de florofoor moet FAM zijn</td></tr><tr><td>HF183 Forward Primer (HF183-1)</td><td>Operon</td><td>ATCATGAGTTCACATGTCCG</td><td>Alternatieve leverancier kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>HF183 Reverse Primer (BthetR1)</td><td>Operon</td><td>CGTAGGAGTTTGGACCGTGT</td><td>Alternatieve leverancier kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>HF183 Probe (BthetP1)</td><td>Operon</td><td>[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]</td><td>Alternatieve leverancier kan worden gebruikt, maar de florofoor moet HEX zijn (indien VIC wordt gebruikt, moet de juiste matric-compensatie worden gekozen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Positieve controle</td><td></td><td></td><td>Mengsel van E. faecalis genomisch DNA en HF183 standaardplasmide (besteld bij IDT). Voor gedetailleerde methoden voor het kweken van E. faecalis en sequenties van de bestelde HF183-plasmide, zie Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercieel verkrijgbare Enterococcus DNA-standaarden (ATCC 29212Q-FZ) kunnen ook worden gebruikt in de positieve controle in plaats van laboratorium-bereid E. faecalis genomisch DNA.</td></tr></tbody></table>

een duplex digitale pcr test voor gelijktijdige kwantificering van de<em&gt; enterococcus spp.</em&gt; en de human fecal-geassocieerde hf183 marker in waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR-test (EntHF183 dPCR) voor gelijktijdige kwantificering van Enterococcus spp. En het menselijk fecal-geassocieerde HF183 marker. De EntHF183 duplex dPCR (aangeduid als EntHF183 dPCR hierop) test gebruikt dezelfde primer en probe sequenties zijn gepubliceerd individuele kwantitatieve PCR (qPCR) tegenhangers. Ook worden dezelfde waterfiltratie en DNA extractie procedures uitgevoerd voorafgaand aan qPCR vóór loopt dPCR gevolgd. De duplex dPCR assay heeft verscheidene voordelen boven de qPCR assays. Het belangrijkste is de dPCR test overbodig uitvoeren van een standaardcurve en dus de bijbehorende voorspanning en variabiliteit, door directe kwantificering van de doelen. Bovendien, terwijl dubbelzijdig (dwz gelijktijdige kwantificering) Enterococcus en HF183 in qPCR vaak leidt tot ernstige onderschatting van de minder overvloedig doelwit in een monster, dPCR consistent kwantificering van beide doelstellingen slijpenhaar afzonderlijk of gelijktijdig gekwantificeerd in hetzelfde reactievat. De dPCR assay kan ook PCR remmerconcentraties die 1:59 orden van grootte hoger dan die getolereerd door qPCR worden geduld. Deze voordelen maken het EntHF183 dPCR assay bijzonder aantrekkelijk omdat het tegelijkertijd zorgt voor een nauwkeurige en reproduceerbare gegevens over algemene en humaan-geassocieerde fecale verontreiniging aard in water zonder de noodzaak om twee afzonderlijke qPCR assays werking. Ondanks de voordelen ten opzichte qPCR, de bovenste grens van de kwantificering dPCR assay met de huidige instrumentatie ongeveer vier orden van grootte lager dan die welke door qPCR. Bijgevolg is verdunning noodzakelijk voor het meten van hoge concentraties doelorganismen zoals typisch waargenomen na rioolwater morsen.

Een goede EntHF183 duplex dPCR run zou moeten resulteren in een relatief hoog aantal aanvaarde druppels (ca. 10,000-17,000) en de relatief grote verschil (ca. 5000) tussen de fluorescentie waarden voor de negatieve en positieve druppeltjes 7. Ongebruikelijk lage aantal druppels geeft waarschijnlijk problemen bij de opwekking proces druppel, en een cutoff van 10.000 druppels wordt gesuggereerd op basis van empirische gegevens uit de druppel dPCR systeem dat wo...

Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR test die kan worden gebruikt om tegelijkertijd kwantificeren Enterococcus spp. En HF183 genetische merkers als indicatoren van algemene en menselijke-geassocieerde fecale besmetting in recreatiewater.

Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Het algemene doel van deze Duplex Digital PCR-assay is het gelijktijdig kwantificeren van algemene en mensgerelateerde fecale verontreiniging in wateren. Deze assay kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen bij de monitoring van de kwaliteit van recreatiewater, zoals de hoeveelheid algemene fecale indicatoren, oftewel Enterococcus, en belangrijker nog, de menselijke fecale HF183-marker in het water.Het belangrijkste voordeel van deze assay is dat het twee targets in één reactie kwantificeert en, vergeleken met qPCR, de noodzaak voor het draaien van standaardcurven en daarmee de bijbehorende bias en variabiliteit wegneemt. De procedure zal worden gedemonstreerd door Meredith Raith, onze Senior Research Technician. Om met deze procedure te beginnen, bereidt u eerst stockconcentraties van 100 Micromole per liter voor voor alle primers in Molecular Grade Water en probes in TEPH 8 Buffer, zoals beschreven in de protocoltekst.Bereid vervolgens een Master Mix voor door geschikte hoeveelheden Digital PCR-mix, forward- en reverse-primers, de fluorescerende probe en Nuclease-Free Water te mengen. Pipetteer ten minste 10 keer op en neer om te mengen, waarbij u voorzichtig bent om geen lu

a-duplex-digital-pcr-assay-for-simultaneous-quantification

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

We beschrijven een multiplex methode voor de detectie van micro-organismen in een monster met behulp van oligonucleotide-coupled fluorescerende kralen. Amplicon van alle organismen in een monster is gehybridiseerd met een panel van probe-gekoppelde kralen. Een Luminex of Bio-Plex instrument wordt gebruikt om elke kraal voor kraal type en hybridisatie-signaal zoekopdracht.

Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

Dit protocol beschrijft het gebruik van een tangentiële stroming holle-fiber ultrafiltratie monsterconcentratie en een warmte dissociatie als andere stappen voor het detecteren van...

Een aangepaste EPA-methode 1623, dat tangentiële Flow holle-vezel ultrafiltratie en warmte Dissociatie stappen gebruikt om te detecteren op waterbasis<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; En<em&gt; Giardia spp.</em

In this video, we demonstrate the duplex digital PCR (ddPCR) technique — a modification of the traditional PCR technique that is useful in detecting two different genetic markers simultaneously. A single PCR reaction is partitioned into nanoliter-sized emulsified droplets that are independently amplified, and the detection of differently colored fluorescence amplification signals from the fraction of droplets is used to compute the initial concentration of the target sequences.

Duplex Digital PCR for Simultaneous Quantification of Dual Genetic Markers

Een qPCR assay is ontwikkeld voor detectie van Escherichia coli O157: H7 gericht op een unieke genetische merker, Z3276. De qPCR werd gecombineerd met propidium monoazide (PMA) behandeling voor live cell detectie. Dit protocol is gewijzigd en aangepast om een ​​96-well plaat formaat voor eenvoudige en consistente behandeling van talrijke monsters...

Detectie van Levende<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 cellen door PMA-qPCR

Een protocol dat geïntegreerde concentratie, verrijking en eindpuntkleurmeting voor de detectie van door voedsel overgedragen ziekteverwekkers in grote volumes landbouwwater presenteert, wordt hier gepresenteerd. Het water wordt gefilterd door middel van Modified Moore Swabs (MMS), verrijkt met selectieve of niet-selectieve media, en de detectie wordt uitgevoerd met behulp van op papier gebaseerde analytische apparaten (µPAD) ingebed met bacteriële-indicatieve kleurmetingssubstraten.

Colorimetrische Papier-gebaseerde detectie van<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. En<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Van grote volumes of Agricultural Water

Hier presenteren we een procedure om enterovirus en norovirus in milieu- en drinkwater te kwantificeren met behulp van reverse transcriptie-kwantitatieve PCR. De gemiddelde virusterugwinning uit grondwater met deze gestandaardiseerde procedure van EPA-methode 1615 was 20% voor poliovirus en 30% voor muur-norovirus.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR

Het algemene doel van dit protocol is voor het synthetiseren van functionele nanosensors voor de portable, kosteneffectief en snelle detectie van specifiek gericht pathogene bacteriën door een combinatie van magnetische ontspanning en fluorescentie emissie modaliteiten.

Foodborne Pathogen Screening met behulp van Magneto-belichting fluorescerende Nanosensor: Snelle detectie van E. Coli O157:H7

Milieu-DNA-tests vereisen een rigoureus ontwerp, testen, optimalisatie en validatie voordat het verzamelen van veldgegevens kan beginnen. Hier presenteren we een protocol om gebruikers door elke stap te nemen bij het ontwerpen van een soortspecifieke, op sondes gebaseerde qPCR-test voor de detectie en kwantificering van dna van een doelsoort uit milieumonsters.

Ontwikkeling en testen van soortspecifieke kwantitatieve PCR-tests voor milieu-DNA-toepassingen

Dit protocol beschrijft hoe je een continuous-flow-polymeraseketensysteem bouwt op basis van een microfluïdische chip en hoe je een capillair elektroforesesysteem bouwt in het lab. Het presenteert een eenvoudige methode voor de analyse van nucleïnezuren in het laboratorium.

Amplificatie van Escherichia coli in een Continuous-Flow-PCR microfluïdische chip en de detectie ervan met een capillair elektroforesesysteem

Leer een duplex digitale PCR-methode voor gelijktijdige kwantificering van Enterococcus spp. en de HF183-marker in recreatiewater. Deze techniek elimineert standaardkrommen en verbetert de nauwkeurigheid van waterkwaliteitsmonitoring.

Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de Enterococcus spp. En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters (Video) | JoVE Journal

Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de

Meer video's verkennen