Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de Enterococcus spp. En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters
9 maart 2016
Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR test die kan worden gebruikt om tegelijkertijd kwantificeren Enterococcus spp. En HF183 genetische merkers als indicatoren van algemene en menselijke-geassocieerde fecale besmetting in recreatiewater.
Het algemene doel van deze Duplex Digital PCR Assay is om tegelijkertijd algemene en menselijke geassocieerde fecale besmetting in water te kwantificeren. Deze Assay kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de monitoring van recreatieve waterkwaliteit, zoals hoeveel algemene fecale indicator, d.w.z. Enterococcus en belangrijker nog, menselijke fecale geassocieerde HF183 Marker in het water zit.
Het belangrijkste voordeel van deze Assay is dat het twee doelen in één reactie kwantificeert en vergeleken met qPCR elimineert het de noodzaak voor het uitvoeren van standaardcurven en dus de bijbehorende bias en variabiliteit. Meredith Raith, onze Senior Research Technician, zal de procedure demonstreren. Om deze procedure te beginnen, bereidt u eerst 100 micromol per liter stockconcentraties voor alle primers in moleculair gegradueerde water en sondes in TEPH 8-buffer voor, zoals beschreven in de protocoltekst.
Vervolgens bereidt u een Master Mix voor door geschikte hoeveelheden Digital PCR-mix, voorwaartse en achterwaartse primers, de fluorescerende sonde en Nuclease-Free Water te mengen. Pipetteer minstens 10 keer op en neer om te mengen, terwijl u voorzichtig bent om geen luchtbellen in de oplossing te introduceren. Aangezien dPCR Master Mix viskeuzer is dan conventionele qPCR Master Mix, is het noodzakelijk om pipettingtechniek te gebruiken om een homogene oplossing te creëren.
Dit maakt nauwkeurige dPCR-kwantificering stroomafwaarts mogelijk. Om de Assay Mixture voor Droplet Generation voor het uitvoeren van monsters in duplicaat te maken, pipetteert u 36 microliter van de Master Mix in een reguliere PCR-plaat. Meng in elk van de 36 microliter Master Mixes 12 microliter DNA-sjabloon door de overeenkomstige replicaatputjes leeg te laten op de plaat.
Voeg positieve controles toe om ervoor te zorgen dat de Assay correct draait. Voeg No Template Controls of NTC's toe om ervoor te zorgen dat er geen besmetting binnen de plaat is en om de fluorescerende baseline later voor data-analyse in te stellen. Voordat u de Droplet Generator instelt, meng de Assay Mixtures door de mengsels ongeveer 15 keer op en neer te pipetten met behulp van een multikanaals pipet.
Zorg ervoor dat de pipettetip binnen de vloeistof blijft om luchtbellen in het mengsel te voorkomen. Plaats vervolgens cartridge één met acht putjes in een witte cartridgehouder en klik de cartridgehouder dicht. Cartridge één is nu stevig op zijn plaats en kan niet uit de houder worden losgemaakt tijdens het genereren van druppels.
Gebruik een multikanaals pipet om voorzichtig 20 microliter van de Assay Mixture over te brengen naar de middelste positie van de cartridge gemarkeerd met monster zonder luchtbellen te introduceren. Pipetteer 70 microliter Droplet Generation olie naar de linkerkant van de cartridge gemarkeerd met olie. Bedek de cartridge met een afdichting en zorg ervoor dat de afdichting vlak is en gelijkmatig door de vier klikken naar de rand van de cartridge wordt vastgehouden.
Druk op de groen lichtgevende knop op de Droplet Generator om de deur te openen en plaats de cartridge. Druk opnieuw op de knop om de generator te sluiten. Zodra de deur gesloten is, wordt de groene knop gedimd en kan de deur niet meer worden geopend.
Droplet Generation begint onmiddellijk en duurt ongeveer een minuut. Terwijl de Droplet Generation bezig is, plaatst u cartridge twee in een tweede witte cartridgehouder en bereidt u deze op dezelfde manier voor als voor cartridge één. Wanneer de Droplet Generation voltooid is, wordt de zwak lichtgevende knop groen.
Open de deur van de Droplet Generator, verwijder de witte cartridgehouder met cartridge één en zet deze opzij. Plaats cartridge twee in de Droplet Generator. Verwijder de afdichting van cartridge één en gooi deze weg.
Klik de witte cartridgehouder niet los, omdat de actie de nieuw gegenereerde druppels kan breken. Gebruik een multikanaals pipet ingesteld op 40 microliter, steek de tips in de derde kolom van de cartridge gemarkeerd met druppels onder een hoek van 45 graden en pipetteer langzaam alle druppels naar boven. Breng ze over naar de laatste PCR-plaat door de pipettetip ongeveer halverwege tegen de wand van de put te plaatsen en de druppels langzaam uit te stoten.
Op dezelfde manier, wanneer de Droplet Generation voor cartridge twee voltooid is, verwijdert u de afdichting van cartridge twee en brengt u de gegenereerde druppels over naar de laatste PCR-plaat. Plaats een doorboorbare folieafdekking op de bovenkant van de plaat en plaats deze op een plaatsealer. Stel de sealer in op 180 graden Celsius, druk op play op de sealer en verzegel gedurende 10 seconden.
Om deze procedure te starten, plaatst u de verzegelde laatste PCR-plaat in de thermocycler. Gebruik een thermocycler die compatibel is met de laatste PCR-plaat en met een snelheid van temperatuurafhankelijkheid van twee graden Celsius per seconde. Voer het volgende thermische programma uit: tien minuten bij 95 graden Celsius, gevolgd door 40 cycli van 30 seconden bij 94 graden Celsius en 60 seconden bij 60 graden Celsius, gevolgd door een tien minuten durende wachttijd bij 98 graden Celsius.
Na voltooiing van het cyclus, brengt u de plaat over naar een Droplet Reader voor automatische meting van fluorescenten in elke druppel in elke put. Zorg ervoor dat de druppels op kamertemperatuur zijn voordat u doorgaat met het lezen van druppels. Begin met het openen van de bijbehorende software om het Droplet Reading in te stellen.
In het standaard instellingenmenu dat een schematische weergave van een lege 96-welplaat bevat, dubbelklik op put A1 om het menu te openen met drie secties, Sample, Assay 1 en Assay 2. Typ in de Sample-sectie de Sample ID in het vak gelabeld Naam en vink het vakje aan aan de rechterkant gemarkeerd met Toepassen. Klik vervolgens op het vervolgkeuzemenu gelabeld experiment, kies ROOD voor Rare Event Detection en klik op Enter.
Ga naar de sectie gemarkeerd Assay 1. Vul in de Naam-sectie de Assay in en klik op Enter. Klik in het vak hieronder gelabeld Type op het vervolgkeuzemenu, kies Kanaal 1 Onbekend en klik op Enter.
Ga naar de sectie gemarkeerd Assay 2. Vul in de Naam-sectie de Assay in en klik op Enter. Klik in het vak hieronder gelabeld Type op het vervolgkeuzemenu, kies Kanaal 2
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een Duplex Digital PCR-assay die is ontworpen om zowel algemene als mensgerelateerde fecale verontreiniging in recreatiewater te kwantificeren. De assay richt zich op het meten van Enterococcus spp. en de genetische markers HF183, waardoor een comprehensive aanpak voor waterkwaliteitsmonitoring wordt geboden.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Milieumicrobiologie
- Beoordeling van de waterkwaliteit
- Genetische markeranalyse
Achtergrond
- Recreatiewater kan besmet zijn met fecaliën.
- Enterococcus spp. dient als algemene fecale indicator.
- De HF183-marker is specifiek geassocieerd met menselijke fecale verontreiniging.
- Huidige methoden kunnen onderhevig zijn aan bias en variabiliteit door het gebruik van standaardcurves.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor de simultane kwantificering van fecale indicatoren.
- Om de nauwkeurigheid bij het beoordelen van de waterkwaliteit te verbeteren.
- Om de noodzaak van standaardcurven bij de kwantificering weg te nemen.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een duplex digitale PCR-assay.
- Bereiding van stockconcentraties voor primers en probes.
- Kwantificering van Enterococcus spp. en HF183-markers.
- Vergelijking met traditionele qPCR-methoden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van beide fecale indicatoren in één enkele reactie.
- Vermindering van bias en variabiliteit in vergelijking met qPCR.
- Demonstratie van de effectiviteit van de assay in praktijktoepassingen.
Conclusies
- De Duplex Digital PCR-assay is een betrouwbaar instrument voor het monitoren van de waterkwaliteit.
- Het biedt een efficiëntere methode voor het beoordelen van fecale verontreiniging.
- Deze aanpak kan de bescherming van de volksgezondheid in recreatiewaters verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Nauwkeurige kwantificering van fecale verontreiniging is essentieel voor de beoordeling van de waterveiligheid bij milieumonitoring en de bescherming van de volksgezondheid. De duplex digitale PCR-assay maakt gelijktijdige, onbevooroordeelde meting van algemene en mens-geassocieerde fecale markers mogelijk zonder standaardcurves, wat de betrouwbaarheid van gegevens voor risicobeoordeling verbetert. Dit ondersteunt mechanistische risicoreductie in workflows voor milieusurveillance door kwantitatieve, reproduceerbare resultaten te leveren voor go/no-go-beslissingen in het waterkwaliteitsbeheer.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om hypothesen over fecale contaminatie te onderzoeken via gelijktijdige kwantificatie van Enterococcus spp. en HF183-markers.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak van standaardcurves, waardoor variabiliteit en bias bij de kwantificatie van doelsequenties worden verminderd.
- Voorspellende waarde: Levert consistente metingen van beide doelsequenties, ongeacht of ze individueel of in duplex worden geanalyseerd, wat betrouwbare vergelijkende analyses ondersteunt.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Tolereert concentraties van PCR-remmers die één tot twee grootteordes hoger liggen dan bij qPCR, wat de robuustheid in complexe milieu-monsters verbetert.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van identieke primer/sonde-sequenties en monsterpreparatie als de qPCR-tegenhangers, waardoor naadloze integratie in de workflow mogelijk is.
- Schaalbaarheidswaarde: Genereert digitale eindpuntgegevens die geschikt zijn voor geautomatiseerde analyse en high-throughput screening-applicaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Levert ziekterelevante systeemoutputs door mensgerelateerde fecale contaminatie (HF183) te kwantificeren als biomarker voor risico's voor de volksgezondheid.
- Voorspellend vertrouwen: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door middel van nauwkeurige, reproduceerbare kwantificering over verschillende monstertypes.
- Continuiteitswaarde: Ondersteunt translationele continuïteit van detectie in het milieu tot beoordeling van de impact op de gezondheid.
Integratie van Pipeline en Workflow
De assay past binnen workflows voor milieumonitoring, van monstername tot datainterpretatie, ter ondersteuning van vroege detectie van gevaren en ter informatie voor daaropvolgende mitigatiestrategieën.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot bronnen van fecale contaminatie door middel van dual-target kwantificatie in een enkele reactie.
- Klaarheid van de assay: Levert kwantitatieve resultaten zonder standaardcurves, wat de reproduceerbaarheid verbetert en de actieve laboratoriumtijd vermindert in vergelijking met qPCR.
- Analytica: Biedt absolute kwantificatie in kopieën per µL, waardoor directe vergelijking tussen monsters en condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Verbindt detectie in het milieu met menselijke gezondheidsrisicobeoordeling via HF183 als een menselijke fecale biomarker.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbaar platform voor multiplexe kwantificatie van microbiële targets bij waterkwaliteitsbewaking.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij contaminatiebeoordelingen door bias en variabiliteit van de standaardcurve te elimineren.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via digitale eindpuntmetingen die tolerant zijn voor inhibitoren.
- Strategische waarde: Verbetert de nauwkeurigheid van go/no-go beslissingen bij waterkwaliteitsbeheer door betrouwbare dual-target data te leveren.
- Portfolio-impact: Maakt risicogebaseerde prioritering van saneringsinspanningen mogelijk door nauwkeurig onderscheid te maken tussen humane en algemene contaminatie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de opzet van digitale PCR, druppelgeneratie en fluorescentiegegevensanalyse.
- Vereist compatibele druppelgeneratoren en readersystemen met passende temperatuurregeling.
- Vereist standaardisatie van DNA-extractie en monsterpreparatie over verschillende testlocaties.
- Houdt rekening met beperkingen in het dynamische bereik, waardoor verdunning nodig is voor monsters met een hoge concentratie.
- Omvat praktische beperkingen met betrekking tot de bovenste kwantificeringslimieten in vergelijking met qPCR.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Assay Mixture Preparation
2:24
Droplet Generation and PCR Plate Setup
5:17
Thermal Cycling and Droplet Reading
8:01
Data Analysis and Reporting
9:46
Results: Duplex Digital PCR is a Robust Assay for Simultaneous Quantification of General and Human-associated Fecal Contamination
11:18
Conclusion
