Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de Enterococcus spp. En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters
March 9th, 2016
Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR test die kan worden gebruikt om tegelijkertijd kwantificeren Enterococcus spp. En HF183 genetische merkers als indicatoren van algemene en menselijke-geassocieerde fecale besmetting in recreatiewater.
Het algemene doel van deze Duplex Digital PCR Assay is om tegelijkertijd algemene en menselijke geassocieerde fecale besmetting in water te kwantificeren. Deze Assay kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de monitoring van recreatieve waterkwaliteit, zoals hoeveel algemene fecale indicator, d.w.z. Enterococcus en belangrijker nog, menselijke fecale geassocieerde HF183 Marker in het water zit.
Het belangrijkste voordeel van deze Assay is dat het twee doelen in één reactie kwantificeert en vergeleken met qPCR elimineert het de noodzaak voor het uitvoeren van standaardcurven en dus de bijbehorende bias en variabiliteit. Meredith Raith, onze Senior Research Technician, zal de procedure demonstreren. Om deze procedure te beginnen, bereidt u eerst 100 micromol per liter stockconcentraties voor alle primers in moleculair gegradueerde water en sondes in TEPH 8-buffer voor, zoals beschreven in de protocoltekst.
Vervolgens bereidt u een Master Mix voor door geschikte hoeveelheden Digital PCR-mix, voorwaartse en achterwaartse primers, de fluorescerende sonde en Nuclease-Free Water te mengen. Pipetteer minstens 10 keer op en neer om te mengen, terwijl u voorzichtig bent om geen luchtbellen in de oplossing te introduceren. Aangezien dPCR Master Mix viskeuzer is dan conventionele qPCR Master Mix, is het noodzakelijk om pipettingtechniek te gebruiken om een homogene oplossing te creëren.
Dit maakt nauwkeurige dPCR-kwantificering stroomafwaarts mogelijk. Om de Assay Mixture voor Droplet Generation voor het uitvoeren van monsters in duplicaat te maken, pipetteert u 36 microliter van de Master Mix in een reguliere PCR-plaat. Meng in elk van de 36 microliter Master Mixes 12 microliter DNA-sjabloon door de overeenkomstige replicaatputjes leeg te laten op de plaat.
Voeg positieve controles toe om ervoor te zorgen dat de Assay correct draait. Voeg No Template Controls of NTC's toe om ervoor te zorgen dat er geen besmetting binnen de plaat is en om de fluorescerende baseline later voor data-analyse in te stellen. Voordat u de Droplet Generator instelt, meng de Assay Mixtures door de mengsels ongeveer 15 keer op en neer te pipetten met behulp van een multikanaals pipet.
Zorg ervoor dat de pipettetip binnen de vloeistof blijft om luchtbellen in het mengsel te voorkomen. Plaats vervolgens cartridge één met acht putjes in een witte cartridgehouder en klik de cartridgehouder dicht. Cartridge één is nu stevig op zijn plaats en kan niet uit de houder worden losgemaakt tijdens het genereren van druppels.
Gebruik een multikanaals pipet om voorzichtig 20 microliter van de Assay Mixture over te brengen naar de middelste positie van de cartridge gemarkeerd met monster zonder luchtbellen te introduceren. Pipetteer 70 microliter Droplet Generation olie naar de linkerkant van de cartridge gemarkeerd met olie. Bedek de cartridge met een afdichting en zorg ervoor dat de afdichting vlak is en gelijkmatig door de vier klikken naar de rand van de cartridge wordt vastgehouden.
Druk op de groen lichtgevende knop op de Droplet Generator om de deur te openen en plaats de cartridge. Druk opnieuw op de knop om de generator te sluiten. Zodra de deur gesloten is, wordt de groene knop gedimd en kan de deur niet meer worden geopend.
Droplet Generation begint onmiddellijk en duurt ongeveer een minuut. Terwijl de Droplet Generation bezig is, plaatst u cartridge twee in een tweede witte cartridgehouder en bereidt u deze op dezelfde manier voor als voor cartridge één. Wanneer de Droplet Generation voltooid is, wordt de zwak lichtgevende knop groen.
Open de deur van de Droplet Generator, verwijder de witte cartridgehouder met cartridge één en zet deze opzij. Plaats cartridge twee in de Droplet Generator. Verwijder de afdichting van cartridge één en gooi deze weg.
Klik de witte cartridgehouder niet los, omdat de actie de nieuw gegenereerde druppels kan breken. Gebruik een multikanaals pipet ingesteld op 40 microliter, steek de tips in de derde kolom van de cartridge gemarkeerd met druppels onder een hoek van 45 graden en pipetteer langzaam alle druppels naar boven. Breng ze over naar de laatste PCR-plaat door de pipettetip ongeveer halverwege tegen de wand van de put te plaatsen en de druppels langzaam uit te stoten.
Op dezelfde manier, wanneer de Droplet Generation voor cartridge twee voltooid is, verwijdert u de afdichting van cartridge twee en brengt u de gegenereerde druppels over naar de laatste PCR-plaat. Plaats een doorboorbare folieafdekking op de bovenkant van de plaat en plaats deze op een plaatsealer. Stel de sealer in op 180 graden Celsius, druk op play op de sealer en verzegel gedurende 10 seconden.
Om deze procedure te starten, plaatst u de verzegelde laatste PCR-plaat in de thermocycler. Gebruik een thermocycler die compatibel is met de laatste PCR-plaat en met een snelheid van temperatuurafhankelijkheid van twee graden Celsius per seconde. Voer het volgende thermische programma uit: tien minuten bij 95 graden Celsius, gevolgd door 40 cycli van 30 seconden bij 94 graden Celsius en 60 seconden bij 60 graden Celsius, gevolgd door een tien minuten durende wachttijd bij 98 graden Celsius.
Na voltooiing van het cyclus, brengt u de plaat over naar een Droplet Reader voor automatische meting van fluorescenten in elke druppel in elke put. Zorg ervoor dat de druppels op kamertemperatuur zijn voordat u doorgaat met het lezen van druppels. Begin met het openen van de bijbehorende software om het Droplet Reading in te stellen.
In het standaard instellingenmenu dat een schematische weergave van een lege 96-welplaat bevat, dubbelklik op put A1 om het menu te openen met drie secties, Sample, Assay 1 en Assay 2. Typ in de Sample-sectie de Sample ID in het vak gelabeld Naam en vink het vakje aan aan de rechterkant gemarkeerd met Toepassen. Klik vervolgens op het vervolgkeuzemenu gelabeld experiment, kies ROOD voor Rare Event Detection en klik op Enter.
Ga naar de sectie gemarkeerd Assay 1. Vul in de Naam-sectie de Assay in en klik op Enter. Klik in het vak hieronder gelabeld Type op het vervolgkeuzemenu, kies Kanaal 1 Onbekend en klik op Enter.
Ga naar de sectie gemarkeerd Assay 2. Vul in de Naam-sectie de Assay in en klik op Enter. Klik in het vak hieronder gelabeld Type op het vervolgkeuzemenu, kies Kanaal 2
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een Duplex Digital PCR Assay die is ontworpen om zowel algemene als menselijke fecale contaminatie in recreatieve wateren te kwantificeren. De assay richt zich op het meten van Enterococcus spp. en de HF183 genetische markers, wat een uitgebreide benadering biedt voor waterkwaliteitsbewaking.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Omgevingsmicrobiologie
- Waterkwaliteitsbeoordeling
- Genetische Marker Analyse
Achtergrond
- Recreatieve wateren kunnen besmet zijn met fecale materie.
- Enterococcus spp. dient als een algemene fecale indicator.
- De HF183 marker is specifiek geassocieerd met menselijke fecale contaminatie.
- Huidige methoden kunnen vooringenomenheid en variabiliteit met zich meebrengen door standaardcurves.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor gelijktijdige kwantificering van fecale indicatoren.
- Om de nauwkeurigheid bij het beoordelen van waterkwaliteit te verbeteren.
- Om de noodzaak voor standaardcurves bij kwantificering te elimineren.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van de Duplex Digital PCR assay.
- Voorbereiding van stockconcentraties voor primers en probes.
- Kwantificering van Enterococcus spp. en HF183 markers.
- Vergelijking met traditionele qPCR methoden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van beide fecale indicatoren in een enkele reactie.
- Vermindering van vooringenomenheid en variabiliteit in vergelijking met qPCR.
- Demonstratie van de effectiviteit van de assay in real-world toepassingen.
Conclusies
- De Duplex Digital PCR assay is een betrouwbare tool voor waterkwaliteitsbewaking.
- Het biedt een efficiëntere methode voor het beoordelen van fecale contaminatie.
- Deze benadering kan de bescherming van de volksgezondheid in recreatieve wateren verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of fecal contamination is critical for water safety assessment in environmental monitoring and public health protection. The duplex digital PCR assay enables simultaneous, bias-free measurement of general and human-associated fecal markers without standard curves, improving data reliability for risk assessment. This supports mechanistic de-risking in environmental surveillance workflows by providing quantitative, reproducible outputs for go/no-go decisions in water quality management.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fecal contamination hypotheses through simultaneous quantification of Enterococcus spp. and HF183 markers.
- Operational Value: Eliminates standard curve requirements, reducing variability and bias in target quantification.
- Predictive Value: Provides consistent measurements of both targets whether assayed individually or in duplex, supporting reliable comparative analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Tolerates PCR inhibitor concentrations one to two orders of magnitude higher than qPCR, enhancing robustness in complex environmental samples.
- Operational Value: Uses identical primer/probe sequences and sample preparation as qPCR counterparts, enabling seamless workflow integration.
- Scalability Value: Generates digital endpoint data suitable for automated analysis and high-throughput screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Delivers disease-relevant system outputs by quantifying human-associated fecal contamination (HF183) as a biomarker for public health risk.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions through accurate, reproducible quantification across sample types.
- Continuity Value: Supports translational continuity from environmental detection to health impact assessment.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within environmental monitoring workflows from sample collection to data interpretation, supporting early hazard detection and informing downstream mitigation strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding fecal contamination sources through dual-target quantification in a single reaction.
- Assay Readiness: Delivers quantitative outputs without standard curves, improving reproducibility and reducing hands-on time compared to qPCR.
- Analytics: Provides absolute quantification in copies per microliter, enabling direct comparison between samples and conditions.
- Translational Research: Connects environmental detection to human health risk assessment via HF183 as a human fecal-associated biomarker.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for multiplex microbial target quantification in water quality surveillance.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in contamination assessment by eliminating standard curve bias and variability.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through digital endpoint measurements tolerant to inhibitors.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision accuracy in water quality management by providing reliable dual-target data.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of remediation efforts through accurate human vs. general contamination discrimination.
Implementation Considerations
- Requires expertise in digital PCR setup, droplet generation, and fluorescence data analysis.
- Needs compatible droplet generator and reader systems with appropriate temperature control.
- Demands standardization of DNA extraction and sample preparation across testing sites.
- Involves consideration of dynamic range limitations requiring dilution for high-concentration samples.
- Involves practical constraints related to upper quantification limits compared to qPCR.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Assay Mixture Preparation
2:24
Droplet Generation and PCR Plate Setup
5:17
Thermal Cycling and Droplet Reading
8:01
Data Analysis and Reporting
9:46
Results: Duplex Digital PCR is a Robust Assay for Simultaneous Quantification of General and Human-associated Fecal Contamination
11:18
Conclusion
