Isolatie en karakterisering van de Muis Antral Eicellen Gebaseerd op Hergroepering van nucleoli chromatine Organization

Het algemene doel van deze procedure is om alle stappen te detailleren die nodig zijn voor het karakteriseren van antrale eicellen van muizen op basis van hun chromatine-organisatie, volgens hun vermogen om een toekomstige embryonale ontwikkeling volledig te ondersteunen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontwikkelingsbiologie, zoals hoe twee verschillende soorten antrale eicellen, SN, met omringde nucleolus, en NSN, niet-omringde nucleolus, die zich in het antrale compartiment van de zoogdier-ovarium bevinden, te onderscheiden en te isoleren. Om de eierstokken te oogsten, begint u met het injecteren van vrouwelijke muizen van drie tot zes weken oud IP met 2,5 internationale eenheden van gonadotrofine uit zwangere merrie-sera.

Twee dagen later, ongeveer een uur voor het oogsten, vult u één steriele Petrischaal met M2-medium en voegt u verschillende druppels van 20 microliter M2-medium toe aan een tweede Petrischaal, waarbij u elke druppel bedekt met 1,5 milliliter minerale olie. Breng vervolgens alle Petrischotels over naar een incubator van 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide om het medium te laten gelijkwaardig worden. Gebruik vervolgens steriele dissectiescharen om een incisie te maken in de huid die de buikwand bedekt, gevolgd door een incisie in het peritoneum van de eerste muis die met hormonen is geïnjecteerd.

Gebruik steriele pincetten om de darmen opzij te schuiven om de eileiders te lokaliseren, die een V-vorm vormen vanaf de blaas. Nadat u de eierstokken onder de nieren hebt gelokaliseerd, grijpt u een eileider en laat u de overeenkomstige eierstok los met een kleine incisie in de onderkant van het weefsel. Herhaal het proces om de andere eierstok te oogsten en plaats vervolgens beide eierstokken in de Petrischaal gevuld met vooraf geëquilibreerd M2-medium.

Voordat u de antrale eicel isoleert, maakt u glazen mondpijpen door beide uiteinden van een glazen Pasteur-pijp te grijpen en de pijp horizontaal over een Bunsen-brandervlam te houden. Wanneer het glas begint te smelten, verwijdert u de pijp van de vlam en trekt u het instrument snel uit elkaar. Gebruik een vingernagel om stevig het overtollige glas dicht bij het smalle punt van de pijp af te knippen om de punt te verkorten en een interne capillaire diameter van ongeveer 100 micron te bereiken.

Het is belangrijk om de juiste pijpdiameter te hebben. Als deze te smal is, blijven de eicellen vastzitten, worden ze gefragmenteerd en gaan ze dood. Verbind vervolgens het ongewijzigde uiteinde van de pijp met een aspiratorbuis.

Breng vervolgens de eierstokken over in de Petrischaal met één milliliter vooraf geëquilibreerd M2-medium en gebruik een steriele insulinenaad om voorzichtig de antrale follikels van de eierstokken te puncteren. Terwijl de eicellen worden vrijgegeven, verzamelt u ze voorzichtig met een mondpijp, zorg ervoor dat u geen follikelcellen of ander weefseldebris zuigt. Pipet vervolgens elke eicel snel door meerdere vooraf geëquilibreerde M2-mediumdruppels om alle cumuluscellen die aan de zona pellucida van de eicellen zijn bevestigd, te verwijderen.

Zodra de eicellen zijn ontdaan, laat u de eicellen voorzichtig op de bodem van afzonderlijke druppels vers geëquilibreerd M2-medium bezinken. Gebruik een mondpijp om de cellen over te brengen naar druppels van 20 microliter Hoechst 33342, verdund in M2-medium, om de eicellen te kleuren. Breng vervolgens de eicellen over in een nieuwe Petrischaal met druppels van vijf microliter M2-medium bedekt met minerale olie, zorg ervoor dat u de eicellen afzonderlijk op de bodem van elke druppel laat bezinken.

Wanneer alle eicellen zijn overgebracht, plaatst u de schaal onder de fluorescentiemicroscoop en citeert u de cellen net lang genoeg om de aanwezigheid of afwezigheid van een ring rond de nucleolus te visualiseren. Zorg ervoor dat de eicellen niet te lang worden blootgesteld, omdat het chromatine kan worden beschadigd en de eicellen kunnen sterven als ze te lang worden blootgesteld. Nadat de SN- en NSN-eicellen zijn geïdentificeerd, sorteert u de cellen in de juiste overeenkomstige Petrischaal in het relevante reagens voor de gewenste downstream-analyse, volgens hun chromatine-organisatie.

Hoechst 33342-kleuring voor chromatine-organisatie is waarschijnlijk de meest cruciale stap van de procedure. Vijf tot tien seconden excitatie zou voldoende moeten zijn om de eicellen te sorteren op basis van de aanwezigheid of afwezigheid van chromatine rond de nucleolus van elke eicel. Zodra deze techniek is beheerst, kan deze in minder dan drie uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om op kamertemperatuur te werken en om te onthouden zowel de eierstokken als de eicellen voorzichtig te behandelen. Na deze procedure kunnen de eicellen worden gebruikt voor in vitro-rijping en in vitro-bevruchting. Na de ontwikkeling van deze techniek heeft dit de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van ontwikkelingsbiologie om een nog openstaande vraag te beantwoorden, namelijk hoe twee soorten antrale eicellen die in de zoogdier-eierstokken aanwezig zijn, te herkennen en te onderscheiden.

Na het bekijken van deze video, zult u een goed begrip hebben van hoe u uw eigen mondpijp kunt maken en gebruiken, hoe u antrale eicellen kunt isoleren en sorteren door middel van Hoechst 33342-kleuring. Vergeet niet dat het werken met dieren en cellen speciale voorzorgsmaatregelen vereist, zoals het dragen van uw persoonlijke beschermingsmiddelen en het gebruik van gesteriliseerde instrumenten.