-Faag gemedieerde Levering van gerichte sRNA Constructen voor het neerslaan van Gene Expression

Het algemene doel van deze procedure is om genen van belang neer te slaan in een groeiende populatie van E.coli. Gen-knockdowns worden vaak gebruikt om fundamentele vragen over genfunctie te onderzoeken. Deze methoden kunnen ook toepassing hebben in de synthetische biologie.

Bijvoorbeeld, in het dempen van ongewenste genen zoals virulentiefactoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden uitgevoerd in batchculturen van E.coli zonder voorafgaande genetische modificatie, met resultaten die na een paar uur waarneembaar zijn. Om te beginnen, gebruik makend van een plasmide met een sRNA-expressiecassette ontworpen volgens het tekstprotocol, voer plaatsgerichte mutagenese uit op de sequentie door eerst de 24-basenpaar gidssequentie in de expressiecassette te identificeren.

Ontwerp en synthetiseer voorwaartse en achterwaartse primers met korte regio's van homologie naar de bestaande sRNA-cassette, flankerend de nieuwe 24-basenpaar gidssequentie. Bereid een vijf milliliter cultuur van E.coli in LB en antibiotica voor met de sjabloon sRNA-expressie-fagemied. Laat de cellen overnacht groeien bij 37 graden Celsius met schudden.

Na extractie en zuivering van de sjabloon sRNA-fagemied uit de cultuur, bereid twee PCR-reacties voor, met 10 tot 50 keer de aanbevolen hoeveelheid DNA-sjabloon voor de sRNA-fagemied en hoge fideliteit polymerase. Bereid een reactie voor met de voorwaartse en een met de achterwaartse primer. Na gebruik van standaard PCR-condities om de reacties uit te voeren, combineer de twee reacties in een microcentrifugebuisje.

Vervolgens anneerd de producten door te verwarmen tot 98 graden Celsius in een kokend waterbad. Zet onmiddellijk de warmtebron uit en laat het bad gedurende de volgende een tot twee uur langzaam terugkeren naar kamertemperatuur. Om de ongemuteerde sjabloon sRNA te elimineren, voeg een microliter van DpnI restrictie-enzym toe aan het mengsel, en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende een uur, of gedurende de tijd aanbevolen door de fabrikant voor volledige vertering.

Transformeer vervolgens chemisch competente E.coli-cellen met één tot vijf microliter van het geanneerde PCR-product. Isoleer vervolgens enkele kolonies door selectief te plateren op LB-platen met antibiotica. Om de incorporatie van de juiste gidssequentie te verifiëren met kolonie PCR.

Gebruik een 200 microliter pipettip om een kleine hoeveelheid cellen van een enkele getransformeerde kolonie te verzamelen. Voeg de verzamelde cellen toe aan 50 microliter nuclease-vrij water in een microcentrifugebuisje en meng door pipettering. Vervolgens, met een tafeltop thermocycler, of een kokend waterbad, lyseert de cellen door te verwarmen tot 95 graden Celsius gedurende twee minuten.

Gebruik een microliter van de lyzeerde cellen als DNA-sjabloon, voer PCR uit volgens de hier getoonde omstandigheden. Na verificatie van de juiste gidssequentie, inoculeert u een vijf milliliter cultuur met de juiste sRNA-kloon, en laat de cellen overnacht groeien. De volgende dag, bereid een glycerol stock voor door 750 microliter van de overnacht cultuur te combineren met 250 microliter van 60% glycerol in een cryotube met schroefdop.

Om M13-verpakte fagemied-stocks voor te bereiden, bereid een vijf milliliter overnacht cultuur van E.coli voor, dragend de sRNA-expressie-fagemied. Bereid ook een vijf milliliter overnacht cultuur van E.coli voor, dragend het M13KO7 helperplasmide. De volgende dag, na zuivering van het DNA, co-transformeer chemisch competente E.coli met één microliter van zowel de sRNA-expressie-fagemied als het helperplasmide.

Plateer op LB-agar met antibiotica om beide constructen te selecteren. Fagemied-expressie is een grote fitheidslast voor de cellen en kan resulteren in verlaagde transformatie-efficiëntie. Het kan noodzakelijk zijn om het plasmide in twee opeenvolgende transformatie-stappen te introduceren.

Na incubatie van de getransformeerde cellen overnacht bij 37 graden Celsius, bereid een 10 milliliter cultuur voor van een enkele kolonie van de co-getransformeerde stam. De volgende ochtend, centrifugeer de cultuur bij 3300 x g gedurende 10 minuten. Verzamel het supernatant en filter door een 0.2 micron filter.

Bewaar het verpakte fagemied-filtraat bij vier graden Celsius. Na het voorbereiden van F+doelcellen, volgens het tekstprotocol, inoculeert u een enkele kolonie in een vijf milliliter cultuur van LB-medium met antibiotica, en laat overnacht groeien bij 37 graden Celsius met schudden. De volgende dag, gebruik vijf milliliter selectief LB-medium om de F+doelcellen een op honderd te verdunnen, en blijf incuberen.

Kweek de cellen gedurende ongeveer twee uur tot een OD600 van 0.3 is verkregen, wat logfase groei aangeeft. Cellen die gericht zijn op demping, moeten zich in exponentiële fase bevinden wanneer expressie van de F-pilus voor efficiënte fagemied-infectie wordt gedempt. Voeg een een op honderd verhouding van M13-verpakte fagemieds toe aan de doelcellen om een bijna 99% infectie van de doelpopulatie te bereiken.

Laat de infectie gedurende 30 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius met schudden doorgaan. Bepaal vervolgens het sRNA-silencing-fenotype naar wens. Volgens het protocol gedemonstreerd in deze video, werd de sRNA-silencing-cassette van plasmide pAB.

001 gewijzigd om mKate2 te targeten. Deze figuur toont dat de E.coli-stam geïnfecteerd met de anti-mKate2 fagemied geen detecteerbare mKate2-fluorescentie boven achtergrond vertoonde. Deze stam drukte echter GFP uit, wat duidt op succesvolle opname van de fagemied.

In dit experiment werd een E.coli-stam met een chromosomaal geïntegreerde chlooramfenicol acetyltransferase, of CAT-gen, geïnfecteerd met een fagemied die CAT targette, en sRNA-silencing van chlooramfenicol-resistentie werd getest. Cellen waarin de fagemied CAT targette, vertoonden verminderde overleving bij lage chlooramfenicol-concentraties, en bijna 99% doding bij hogere concentraties