Name: Synthese van gouden nanodeeltjes geïntegreerde Photo-responsieve liposomen en waardering van hun Microbel Cavitatie bij Pulse Laser Excitatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Leer de synthese van lichtresponsieve liposomen met gouden nanodeeltjes voor gerichte medicijnafgifte. Deze methode onthult het mechanisme van laser-gecontroleerde afgifte via microbelcavitatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Tier-1 wetenschappelijk onderzoek fondsen door Singapore Ministerie van Onderwijs (RG 64/12 tot CX) en NTU-Northwestern Institute of nanogeneeskunde.

1. Voorbereiding <ol><li> Schone 100 ml rondbodem kolven gebruikt koningswater (1 deel geconcentreerd salpeterzuur (HNO3) en 3 delen geconcentreerd zoutzuur (HCl)) en was de kolven met DI water. Autoclaaf kolven en droog ze in een hete luchtoven bij 100 ° C gedurende 15 minuten. Wikkel en opslaan van de steriele kolven tot gebruik. </li><li> Steriliseren in de hand gehouden mini-extruder set met behulp van 70% ethanol. </li><li> Schakel de rotatieverdamper en de temperatuur van het waterbad en de koeltoren bij 37 ° C en 4 ° C respectievelijk. </li><li> Bereid 60 mM voorraadoplossing calceïne door het oplossen van 374 mg van calceïne in 10 ml van 0,1 mM fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,4). Op pH 7,4 onder toepassing van 1 M natriumhydroxideoplossing (NaOH). </li></ol> 2. Bereiding van liposomen <ol><li> Verwijder de lipiden (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPPC), 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholijn (mppc) en 1, 2-distearoyl- sn glycero-3-phosphoethanol-amine N - [carboxy (polyethyleen glycol) -2000] (ammoniumzout) (DSPE-PEG2000)) uit diepvriezer (-20 ° C) en ontdooien ze tot KT. </li><li> Weeg 15,9 mg DPPC, 1,3 mg mppc, en 2,8 mg DSPE-PEG2000. Lossen ze samen in 2 ml chloroform. </li><li> Breng de chloroformoplossing de steriele rondbodemkolf en damp het oplosmiddel met de roterende verdamper onder verlaagde druk, om een ​​dunne, droge lipide laag. </li><li> Hydrateren lipidelaag bij 45 ° C met 2 ml waterige oplossing gedurende 30 min met 1,95 ml 60 mM calceïne bereid in stap 1,4 en 50 pl Au NP (3,36 x 10 16 deeltjes / ml). </li><li> Verwarm het verwarmingsblok bij 45 ° C. Plaats een 200 nm polycarbonaat membraanfilter tussen de filter ondersteunt en de montage van de mini-extruder set. Controleer de eventuele lekkage met DI-water. </li><li> Vul een van de spuiten met 1 ml liposoomoplossing van stap 2,4 en extruder; koperde het monster door de oplossing op de spuit aan de andere kant van het assembleren mini-extruder. Herhaal 11 keer. </li><li> Voer het gesynthetiseerde liposomen door een PD-10 ontzoutingskolom de vrije Au NPs, lipiden en calceïne met behulp PBS als elutiemiddel volgens het protocol van de fabrikant te verwijderen. </li><li> Bewaar de monsters in steriele buizen bij 4 ° C en gebruik in 2 dagen. </li></ol> 3. calceïneafgifte van liposomen met Airconditioning <ol><li> Bereken de lipide molariteit van de voorraad oplossing door optelling van de molariteiten van DPPC, mppc en DSPE-PEG2000 in stap 2.2. Verdun het liposoom voorraadoplossing tot 5 mM lipide concentratie middels 0,1 mM PBS-buffer (pH 7,4). Breng de monsters naar een centrifugebuis (2 ml). </li><li> Plaats de buis in een warmwaterbad, en de temperatuur geleidelijk op 25 tot 70 ° C. Verhoog de temperatuur met een snelheid van 1 ° C / min in. </li><li> Verzamel fracties (10 ul) bij verschillende temperaturen punten (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 en 70 ° C). </li><li> Voeg 10 ul van 2% Triton X-100 tot 2 ml aliquot van liposomale oplossing van de liposomen verteren 10 minuten bij kamertemperatuur en volledige afgifte van calceïne bereiken. </li><li> Transfer 200 ul van de liposomale oplossing aan elk putje in de 96-well microplaat en meet de fluorescentie-intensiteit van de verzamelde monsters met fluorescentie- microplaat reader. De excitatie en emissie golflengten van calceïne zijn 480 en 515 nm respectievelijk. </li><li> Neemt de fluorescentie-intensiteit van het Triton X-100 behandelde monsters 100% afgifte, wordt het percentage van de afgegeven calceïne op elk tijdstip, met de formule: <img alt="Formule 1" src="/files/ftp_upload/53619/53619formula1.jpg" /> Ft is de fluorescentie-intensiteit van de oplossing op een bepaald tijdstip. F i en F x zijn de genormaliseerde eerste en laatste fluorescentie-intensiteiten van de oplossing respectievelijk. </li></ol> 4. Calceïne Releasen van liposomen met gepulste laser <ol><li> Transfer 100 ul liposoom oplossing voor een kwarts cuvet en plaats deze in een cuvettehouder. Gebruik een gepulste Nd: YAG laser met een pulsduur van 6 nsec bij golflengte 532 nm als lichtbron. Gebruik de volgende Laser Parameters - Herhaling tarief: 1 Hz; Laser energiedichtheid: 1 mJ / cm2; Beam diameter: 0,5 mm. </li><li> Leid de gecollimeerde laserstraal door de cuvet zodanig dat het licht door de liposoom-oplossing en het verzamelen van monsters na verschillende pulsen. </li><li> Voeg 10 ul van 2% Triton X-100 tot 2 ml aliquot van liposomale oplossing van de liposomen verteren 10 minuten bij kamertemperatuur en volledige afgifte van calceïne bereiken. </li><li> Gezien calceïne is gevoelig voor licht en tijdens de laser experiment kan worden gebleekt, vooraf meten van de blekende werking van gepulste laser op calceïne oplossing om de gegevens te normaliseren van liposoom release. <ol><li> In het bijzonder bloot calceïne-oplossing (60 mm) gepulste laser wiste frequentie van 1 Hz voor het variëren pulstal (0, 25, 50 en 100). Meet de fluorescentie-intensiteit calceïne met excitatie en emissie golflengten van 480 en 515 nm respectievelijk voor en na laserbelichting. </li><li> Bereken de hoeveelheid blekende (fluorescentie-intensiteit van calceïne voor laserbelichting / fluorescentie-intensiteit van calceïne na het specifieke aantal pulsen). Met deze factor aan de waarden verkregen van liposoommonsters normaliseren door vermenigvuldiging van de fluorescentie-intensiteit van de liposomen met de factor. </li></ol></li><li> Meet de fluorescentie-intensiteit van de verzamelde monster met behulp van een fluorescentie microplaat reader bij excitatie en emissie golflengten 480 en 515 nm respectievelijk. </li><li> Neemt de fluorescentie-intensiteit van het Triton X-100 behandelde monsters 100% afgifte, wordt het percentage van de afgegeven calceïne bij elke puls, met gebruik van de formule: <img alt="Formule 1" src="/files/ftp_upload/53619/53619formula1.jpg" /> i en F x zijn de genormaliseerde eerste en laatste fluorescentie-intensiteiten van de oplossing respectievelijk. </li></ol> 5. drukmeting Impulsen <ol><li> Plaats 100 ul van het monster op een microscopisch preparaat en stel de focus van de laser op het monster. </li><li> Dompel een naald hydrofoon (1 mm diameter en 450 nV / Pa gevoeligheid) in de oplossing. Let op: De hydrofoon mag niet worden verlicht door het laserlicht om de schade te voorkomen. </li><li> Bestralen van het monster met de gepulste laser met variërende puls nummers (0-100) en pulsenergie (20-160 uJ / puls). </li><li> Noteer de druk signalen met een digitale oscilloscoop. </li></ol>

<ol><li>McCoy, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+drug+delivery+from+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Triggered drug delivery from biomaterials.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).</li>
<li>Yavuz, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanocages+covered+by+smart+polymers+for+controlled+release+with+near-infrared+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light.</a> Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).</li>
<li>Gohy, J. F., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-responsive+block+copolymer+micelles%3A+design+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior.</a> Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).</li>
<li>Lovell, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphysome+nanovesicles+generated+by+porphyrin+bilayers+for+use+as+multimodal+biophotonic+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents.</a> Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).</li>
<li>Needham, D., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+testing+of+a+new+temperature-sensitive+drug+delivery+system+for+the+treatment+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).</li>
<li>Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+drug+delivery+and+hyperthermia%3A+the+materials+design+and+preclinical+and+clinical+testing+of+low+temperature-sensitive+liposomes+used+in+combination+with+mild+hyperthermia+in+the+treatment+of+local+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Nanomed.+J%22%5BJournal%5D)">Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer.</a> Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).</li>
<li>Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+exposure+in+animals+can+be+visualized+in+the+skin+and+analysed+via+skin+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy.</a> Nat. Commun. 5, 3796(2014).</li>
<li>Paasonen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+enable+selective+light-induced+contents+release+from+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes.</a> J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).</li>
<li>Wu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remotely+Triggered+Liposome+Release+by+Near-Infrared+Light+Absorption+via+Hollow+Gold+Nanoshells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).</li>
<li>Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Selective+Light-Induced+Release+from+Plasmon+Resonant+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes.</a> Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).</li>
<li>Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-IR+Remote+Release+from+Assemblies+of+Liposomes+and+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).</li>
<li>Mills, J. K., Needham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolipid+incorporation+in+dipalmitoylphosphatidylcholine+bilayer+membranes+enhances+the+ion+permeability+and+drug+release+rates+at+the+membrane+phase+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).</li>
<li>Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+Photothermal+Conversion+Efficiencies+of+Plasmonically+Heated+Gold+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles.</a> J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).</li>
<li>Chongsiriwatana, N., Barron, A. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChongsiriwatana%2C+N+%22Antimicrobial+Peptides%22">Antimicrobial Peptides</a>. Giuliani, A., Rinaldi, A. C. 618, Humana Press. 171-182 (2010).</li>
<li>Egerev, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+signals+generated+by+laser-irradiated+metal+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles.</a> Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).</li>
<li>González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+size-dependent+photoacoustic+effect+on+gold+nanoparticles+by+laser-induced+nanobubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles.</a> Appl. Phys. Lett. 96, 174104(2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflict worden verklaard.

Dunne film hydratatie is de gebruikelijke werkwijze voor het bereiden van liposomen. Organische oplosmiddelen (chloroform in dit geval) werd eerst gebruikt om de lipiden op te lossen en daarna verwijderd in een rotatieverdamper bij 37 ° C om een ​​lipide dunne film op de kolf genereren. Deze lipide film werd gehydrateerd met een waterige oplossing die 60 mM calceïne en 5 nm Au NP. Tijdens het hydratatieproces, werd de temperatuur gehandhaafd rond 50 ° C en de kolf werd voortdurend geroerd door omzwenken. De sleutel in d...

De mogelijkheid om geneesmiddelafgifte te activeren met behulp van externe stimuli is een aantrekkelijke manier om de drugs te leveren in ruimtelijk, temporal- en dosering gecontroleerde mode met maximale specificiteit en minimale bijwerkingen. Uit een breed scala van exogene stimuli-responsieve systemen (licht, magnetisch veld, echografie, microgolfstraling), licht-geactiveerd platforms zijn aantrekkelijk vanwege hun niet-invasieve, eenvoud en flexibiliteit in de klinieken. 1 Uitgebreid onderzoek in het afgelopen decennium heeft verstrekt een verscheidenheid van platform technologieën, zoals nabij-infrarood licht verantwoordelijk goud (Au) nanocages bekleed met slimme polymeren, 2 foto-labiele, polymere nanodeeltjes (NP) geconjugeerd met drugs, 3 en zelf-geassembleerde porphysome nanovesicles. 4 echter deze technologieën nog in de preklinische stadia van ontwikkeling, en vereisen een duidelijk begrip en optimalisatie van parameters die bij het proces van het initiëren en controllen van de geneesmiddelafgifte. Een van de eenvoudigste en gemakkelijk toegankelijke werkwijzen voor het bereiden van een dergelijk systeem is Au NPs integreren met thermisch-gevoelige liposomen 5,6, die beide zijn overal verkrijgbaar in de markt en zijn uitgebreid onderzocht in preklinische en klinische proeven ook. Ondanks de beperking van bindweefselmassages activering van Au NPs hun plasmonische golflengte, in vergelijking met nabij-infrarood-geactiveerde Au nanostructuren (bijvoorbeeld nanocages) Dit systeem heeft nog steeds grote belofte bij toediening in kleine dieren of topische afgifte bij mensen. 7 Er zijn een aantal vroege pogingen in het combineren van Au NP&#39;s met liposomen voor lichte geactiveerd release. 8-11 Terwijl de meeste van hen richten zich op de nieuwheid van materialen, moet de toegankelijkheid en schaalbaarheid problemen die moeten worden aangepakt. Bovendien, de verslagen over de mechanismen vrijlating gebruik van deze nanocarriers zijn nog beperkt. Hierin de fabricage van fotogevoeligliposomen, tegelijk geladen met drugs en hydrofiele Au NP is beschreven. Calceïne wordt gebruikt als een modelverbinding de inkapselefficiëntie en het afgifteprofiel van het systeem te evalueren. Bovendien, in dit systeem, lichtabsorptie door Au NP verdwijnt de omringende micro in de vorm van warmte, wat resulteert in een verhoging van de lokale temperatuur. Lucht microbellen ontstaan ​​tijdens de laser verwarmen en veroorzaken mechanische verbreking van liposomen (figuur 1). Het mechanisme van microbellen cavitatie wordt bevestigd door hydrofoon metingen.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, US)</td><td>850355P</td><td>Poeder, Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfocholine (MPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, US)</td><td>855675P</td><td>Poeder, Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanol-amine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout) (DSPE-PEG2000)</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, US)</td><td>880120P</td><td>Poeder, Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Goud Nanodeeltjes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>752568-100mL</td><td>5&nbsp;nm deeltjes, gestabiliseerd bij 0.1&nbsp;mM PBS</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875-10g</td><td>60&nbsp;mM, pH 7.4 (aangepast met behulp van NaOH)</td></tr><tr><td>fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>0.1 mM, pH 7.4</td></tr><tr><td>Dubbel gedestilleerd water</td><td>Millipore Milli-DI waterzuiveringssysteem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X100&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma, Life Sciences</td><td>X-100</td><td>Om de liposomen te verstoren om de totale inkapsling te berekenen</td></tr><tr><td>Rotavapor&nbsp;&nbsp;</td><td>Buchi (Zwitserland)</td><td>R 210</td><td>Gebruikt voor Liposoom voorbereiding</td></tr><tr><td>Verwarmingsbad</td><td>Buchi (Zwitserland)</td><td>B 491</td><td>Gebruikt voor Liposoom voorbereiding</td></tr><tr><td>Vacuümregelaar&nbsp;&nbsp;</td><td>Buchi (Zwitserland)</td><td>V-850</td><td>Gebruikt voor Liposoom voorbereiding</td></tr><tr><td>Vacuümpomp</td><td>Buchi (Zwitserland)</td><td>V-700</td><td>Gebruikt voor Liposoom voorbereiding</td></tr><tr><td>Recirculatiebad met temperatuurregelaar</td><td>Polyscience</td><td></td><td>Gebruikt voor Liposoom voorbereiding</td></tr><tr><td>Mini-extruder-assemblage met verwarmingsblok&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, US)</td><td>610000</td><td>Gebruikt voor het extruderen van liposomen</td></tr><tr><td>Spuiten, 1.000 &#956;l</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, US)</td><td>610017</td><td>Gebruikt voor het extruderen van liposomen</td></tr><tr><td>Polycarbonaat filtermembraan, 200&nbsp;nm</td><td>Whatmann</td><td>800281</td><td>Gebruikt voor het extruderen van liposomen</td></tr><tr><td>Filterondersteuning</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, US)</td><td>610014</td><td>Gebruikt voor het extruderen van liposomen</td></tr><tr><td>PD 10 Desalting kolommen, Sephadex G-25 medium</td><td>GE Healthcare, Life sciences</td><td>17-0851-01</td><td>Gebruikt om de liposomen te zuiveren</td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma Laboratorium Centrifuges</td><td>3K30</td><td>Gebruikt om de liposomale oplossing te concentreren&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Sigma</td><td>19777-H</td><td>Gebruikt om de liposomale oplossing te concentreren&nbsp;</td></tr><tr><td>Zetaizer&nbsp;&nbsp;</td><td>Nano ZS Malvern</td><td></td><td>Gebruikt voor de bepaling van liposomengrootte en zetapotentiaal</td></tr><tr><td>UV-Visibele Spectrofotometer</td><td>Shimadzu</td><td>UV-2450</td><td>Gebruikt om de absorptie van de monsters te meten</td></tr><tr><td>Fluorescent Spectrofluorometer&nbsp;&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M5</td><td>Gebruikt om de fluorescentie-emissie van de monsters te meten</td></tr><tr><td>Nd:YAG Laser</td><td>NewWave Research</td><td></td><td>532 nm; Maximale vermogen: 17&nbsp;mJ; Breedte: 406&nbsp;nsec; Gebruikt voor bemonsteringsbestraling</td></tr><tr><td>HNR Hydrofoon</td><td>ONDA</td><td>HNR-1000</td><td>1 mm diameter en 450 nV/Pa gevoeligheid, Eigenlijk werkfrequentiebereik: 0.25-10&nbsp;MHz; Kalibratie: 50&nbsp;mV/Bar; Gebruikt om de akoestische signalen te meten</td></tr><tr><td>Digitaal Oscilloscoop</td><td>LECORY - Wave Runner 64Xi-A</td><td></td><td>Frequentie: 600 MHz; Max monster snelheid: 10&nbsp;Gs/sec (bij twee kanalen); Gebruikt om de gemeten akoestische signalen te registreren</td></tr></tbody></table>

synthese van gouden nanodeeltjes geïntegreerde photo-responsieve liposomen en waardering van hun microbel cavitatie bij pulse laser excitatie

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Foto-responsieve nanodeeltjes (NPs) hebben aanzienlijke aandacht gekregen vanwege hun potentieel om ruimtelijke, temporele en doseringscontrole te bieden over de afgifte van medicijnen. Echter, de meeste relevante technologieën bevinden zich nog steeds in de ontwikkelingsfase en zijn niet verkrijgbaar voor klinieken. Hier beschrijven we een gemakkelijke fabricage van deze foto-responsieve NPs met commercieel verkrijgbare gouden NPs en thermo-responsieve liposomen. Calcein wordt gebruikt als modelgeneesmiddel om de inkapselingsefficiëntie en het afgifte-kinetisch profiel bij warmte-/lichtstimulatie te evalueren. Ten slotte laten we zien dat deze foto-getriggerde afgifte te wijten is aan de membraanverstoring veroorzaakt door microbubbelcavitatie, die kan worden gemeten met een hydrofoon.

Liposomen werden bereid met een gebruikelijke dunne film hydratatie techniek DPPC, mppc en DSPE-PEG2000 in een molaire verhouding van 86: 10: 4 en 7,95: 0,65. 1,39 mg / ml 12 De grootte van Au NP is cruciaal voor het licht bepalen omzettingsrendement naar warmte in de volgende laserexcitatie experiment. Kleiner de grootte van Au NP, hoe hoger het overdrachtselement efficiency. 13 Aldus 5 nm Au NP, de kleinste monsters van de leverancier voor het inkapselen gekozen. ...

Dit protocol beschrijft een eenvoudige bereidingswijze voor goud nanodeeltjes geïntegreerde foto-responsief liposomen met de commercieel verkrijgbare materialen. Het toont ook aan hoe de microbellen cavitatie proces van de gesynthetiseerde liposomen te meten bij de behandeling van gepulste laser.

Synthese van gouden nanodeeltjes geïntegreerde Photo-responsieve liposomen en waardering van hun Microbel Cavitatie bij Pulse Laser Excitatie

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Het algemene doel van dit protocol is om de synthese van lichtgevoelige liposomen te demonstreren en het mechanisme voor de lichtgestuurde afgifte van geneesmiddelen uit deze liposomen te onthullen. Deze methode helpt bij het beantwoorden van kernvragen over de figuurlijke lichtrespons van liposomen voor geneesmiddelentoediening, waarbij de belangrijkste uitdagingen liggen in de synthese van de liposomen en het verbeteren van de mate van gecontroleerde afgifte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoudige synthese van lichtgevoelige liposomen met commercieel beschikbare materialen.De implicatie van deze technologie strekt zich uit tot therapie voor oppervlakkig weefsel. Het gebruik van minimaal invasieve procedures, evenals een onderdeel van het laserapparaat, zal het technologieplatform toegankelijker maken voor patiënten. Naast het bieden van inzichten in hoogwaardige zorg en nauwkeurige geneesmiddelentoediening, kan ons systeem ook worden toegepast op andere systemen, zoals kleine dieren en het slijmvliesstelsel via geleide lasers.Reinig eerst een ronde kolf van 100 milliliter met koningwater. Na het wassen met gedeïoniseerd water en autoclaveren, droogt u de kolf in een warmteoven bij 100 graden Celsius gedurende 15 minuten. Verpak en bewaar vervolgens de steriele kolf tot gebruik.Steriliseer een handmatige mini-extruder set met 70%Ethanol. Zet vervolgens de rotatieverdamper aan en stel de temperatuur van het warme waterbad en de koeltoren in op respectievelijk 37 en 4 graad Celsius. Bereid een 60 millimolaire Calcium-stockoplossing voor door 374 milligram Calceïne op te lossen in 10 milliliters 0,1 millimolaire fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS.Stel de pH bij naar 7,4 met een een molaire natriumhydroxidolossing. Haal de lipiden uit de vriezer en laat ze ontdooien tot kamertemperatuur. Zodra de lipiden zijn ontdooid, los je 15,9 milligram DPPC, 1,3 milligram MPPC en 2,8 milligram DSPE-PEG2000 op in twee milliliters chloroform.Nadat de chloroformoplossing naar een steriele rondbodelfles is overgebracht, wordt het oplosmiddel met de rotatieverdamper onder verminderde druk verdampt om een dunne, droge lipidenlaag te vormen. Hydrateer vervolgens de lipidenlaag gedurende 30 minuten bij 45 °C met twee milliliters van de waterige oplossing, bestaande uit 1,95 milliliters van de eerder bereide 60 millimolaire calciumoplossing en 50 µL goudnanodeeltjes. Verwarm een warmteblok vooraf tot 45 °C.Plaats een polycarbonaat membraanfilter van 200 nanometer tussen de filtersteunen en assembleer de mini-extruder set. Controleer vervolgens op potentiële lekkage met gedeïoniseerd water. Vul één van de spuiten met één milliliter van de eerder bereide liposoomoplossing en extrudeer het monster door de oplossing door de spuit aan het andere uiteinde van de geassembleerde mini-extruder te persen.Nadat de vorige stap 11 keer is herhaald, worden de gesynthetiseerde liposomen door een PD-10 ontzoutingskolom geleid om de vrije goudnanodeeltjes, lipiden en Calceïne te verwijderen, waarbij PBS als eluent wordt gebruikt volgens het protocol van de fabrikant. Bewaar de monsters na afloop in steriele buisjes bij vier graden Celsius. Bereken op dit punt de lipide molariteit van de stockoplossing door de molariteiten van DPPC, MPPC en DSPE-PEG2000 bij elkaar op te tellen.Verdun de liposoom-stamoplossing tot een lipidenconcentratie van 5 millimolair met behulp van 0,1 millimolair PBS en breng de monsters vervolgens over in centrifugebuisjes van 2 milliliters. Plaats de buisjes daarna in een warmwaterbad en verhoog de temperatuur geleidelijk van 25 naar 70 graden Celsius. Neem aliquoten van 10 microliter af bij verschillende temperatuurpunten.Voeg 10 µL van twee procent Triton X-100 toe aan een aliquot van 2 mL liposomale oplossing om de liposomen 10 minuten bij kamertemperatuur te laten lyseren en een volledige vrijgave van calceïne te bewerkstelligen. Draag vervolgens 200 µL van de liposomale oplossing over naar elke put van een 96-wells microplaat. Meet de fluorescentie-intensiteit van de verzamelde monsters met een fluorescentie microplaatlezer.Bereken het percentage vrijgekomen Calcein op elk tijdstip met behulp van de volgende formule, waarbij de fluorescentie-intensiteit van de met triton x-100 behandelde monsters wordt beschouwd als 100 procent vrijgave: Overbreng 100 µL van de Liposoomoplossing naar een kwartscuvette en plaats de cuvette in een cuvettehouder. Leid de gecollimeerde laserstraal door de cuvette zodat het licht door de Liposoomoplossing gaat. Neem vervolgens aliquoten na diverse pulsen.Voeg hierna 10 µL 2% triton x-100 toe aan een aliquoot van 2 mL liposomale oplossing om de liposomen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur af te breken en een volledige vrijgave van calceïne te bereiken. Om het bleaching-effect van de laser op de calceïne-oplossing vooraf te meten, wordt de oplossing blootgesteld aan een laser met een frequentie van 1 Hz voor variërende aantallen pulsen. Meet de fluorescentie-intensiteit van calceïne met excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 480 en 515 nm vóór en na blootstelling aan de laser.Nadat de hoeveelheden bleking zijn berekend, dient deze factor te worden gebruikt om de waarden verkregen uit de liposoommonsters te normaliseren door de fluorescentie-intensiteit van de liposomen met de factor te vermenigvuldigen. Meet vervolgens de fluorescentie-intensiteit van het verzamelde monster met een fluorescentie microplate-reader bij excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 480 en 515 nanometer. Bereken het percentage vrijgekomen calceïne bij elk pulsnummer, waarbij de fluorescentie-intensiteit van de met triton x-100 behandelde monsters wordt beschouwd als 100 procent vrijgave.Plaats 100 µL van het monster op een objectglas en stel vervolgens de focus van de laser in op het monster. De laser wordt handmatig door het monster geleid, waardoor het essentieel is om ervoor te zorgen dat het brandpunt van de straal zich volledig binnen het monster bevindt en niet op het objectglas, om fouten in latere experimenten te voorkomen. Dompel daarna een naaldhydrofoon in de oplossing.De punt van de hydrofoon wordt in het monster ondergedompeld op voldoende afstand van het brandpunt van de laser. Dit wordt gedaan om laser-geïnduceerde beschadigingen aan de hydrofoon te voorkomen. Bestraal het monster met de pulslaser met variërende aantallen pulsen en pulsenergie.Registreer tot slot de druksignalen met een digitale oscilloscoop. Er is geen significant verschil waargenomen in het vrijgavepercentage voor de liposomen met en zonder goudnanodeeltjes. De liposomen bleven bij fysiologische temperatuur bijna intact, met een lekpercentage van minder dan 10 procent, met of zonder goudnanodeeltjes.Wanneer de temperatuur werd verhoogd naar 42 °C, werd 60 tot 80 procent van het ingekapselde Calcein binnen twee minuten uit de liposomen vrijgegeven. Liposomen met goudnanodeeltjes gaven het ingekapselde Calcein vrij bij excitatie, waarbij de hoeveelheid vrijgegeven Calcein toenam naarmate het aantal pulsen toenam. De akoestische signalen geregistreerd voor de goudnanodeeltjes, de liposomen met goudnanodeeltjes en de liposomen zonder goudnanodeeltjes worden hier getoond: De drukimpuls bevat zowel positieve als negatieve fasen en suggereert dat er microbubbels in de oplossing ontstaan en uiteenvallen.Zoals verwacht nam de amplitude van het akoestische signaal geleidelijk toe bij een toenemende laserenergie, wat waarschijnlijk te wijten is aan de verhoogde intensiteit van de oscillatie van de deeltjes als gevolg van de daaropvolgende thermo-elastische expansie en contractie. Zodra de methode onder knie is, kan de fabricage van liposomen binnen 3 uur worden voltooid, mits al het glaswerk en de apparatuur vooraf zijn voorbereid. Bij het uitvoeren van de lasergestuurde afgifte is het belangrijk om erop te letten dat de laserstraal volledig op het monster is gefocust om verlies van laserenergie te voorkomen.Na deze procedure kunnen andere experimenten worden uitgevoerd, zoals in vitro en in vivo lasergestuurde afgifte, om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de manier waarop fysiologische omstandigheden de lasergestuurde afgifte beïnvloeden. Na deze ontwikkeling zal deze techniek waardevol zijn in het vakgebied van de reactiviteit om de afgifte aan de huid, ogen en slijmvliezen te onderzoeken, te lokaliseren en te beheersen.

synthesis-gold-nanoparticle-integrated-photo-responsive-liposomes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We tonen de voorbereiding en bespreken de haalbaarheid van cellulaire voertuigen die gouden nanostaven bevatten voor de foto-akoestische beeldvorming van kanker.

Voorbereiding en Fotoakoestisch Analyse van Cellular Voertuigen die goud nanorods

Verzadigbare en omgekeerde verzadigingsverstrooiing werden ontdekt in geïsoleerde plasmonische deeltjes en toegepast als een nieuwe niet-blekende contrastmethode in superresolutiemicroscopie. Hier worden de experimentele procedures voor het detecteren en extraheren van niet-lineaire verstrooiing in detail uitgelegd, evenals hoe de resolutie kan worden verbeterd met behulp van verzadigd excimitatiemicroscopie.

Meting van Verstrooiing lineariteiten van een Single Plasmonische Nanodeeltje

Hier presenteren we een betrouwbare methode om de incorporatie van nanodeeltjes in een polymeer gastheermatrix te monitoren via zwellingscapsulering. We laten zien dat de oppervlakteconcentratie van cadmiumselenide kwantumdots nauwkeurig kan worden gevisualiseerd door middel van dwarsdoorsnede fluorescentiebeeldvorming.

Uitgebreide analyse van de samenstelling van nanodeeltjes-polymeer Composites Met behulp van Direct Fluorescence Imaging

Beschrijven we een methode voor de synthese van biocompatibel 10-nm gouden nanodeeltjes, matiemaatschappij door poly-ethyleen-glycol coating op het oppervlak. Deze deeltjes kunnen worden gebruikt in vitro en in vivo voor het leveren van therapeutics nanoschaal cellulaire en extracellulaire ruimten die zijn moeilijk toegankelijk met conventionele nanoparticle maten.

Synthese van matiemaatschappij 10-nm polymeer beklede gouddeeltjes voor endotheel Targeting en Drug Delivery

Dit protocol blijkt de controleerbaar nucleatie van cavitatie in gel fantomen, door middel van gelijktijdige blootstelling aan zowel de nabij-infrarood gepulste laser licht en de hoge intensiteit geconcentreerd ultrageluid (HIFU). De activiteit van cavitatie kan vervolgens worden gebruikt voor het verbeteren van de beeldvorming en/of therapeutische toepassingen van HIFU.

Beheersbare nucleatie van cavitatie van Enterprise gouden nanodeeltjes voor het verbeteren van hoge intensiteit gericht echografie toepassingen

Een betrouwbare en gemakkelijk reproduceerbare methode voor de voorbereiding van functionalizable, nabij-infrarood uitzendende fotoluminescente goudnanoclusters en hun directe detectie in HeLa-cellen door stromingscytometrie en confocale laserscanningmicroscopie wordt beschreven.

Synthese van near-infrared emitting gold nanoclusters voor biologische toepassingen

Het hier beschreven protocol heeft tot doel de hydrodynamische diameter van bolvormige nanodeeltjes, meer bepaald gouden nanodeeltjes, in waterige media te meten door middel van Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). Dit laatste omvat het volgen van de beweging van deeltjes als gevolg van Browniaanse beweging en het implementeren van de Stokes-Einstein-vergelijking om de hydrodynamische diameter te verkrijgen.

Nanodeeltjes tracking analyse van gouden nanodeeltjes in waterige media door middel van een interlaboratorium vergelijking

Dit werk schetst een protocol om dynamische, niet-invasieve monitoring van warmteoverdracht van laserbestraalde gouden nanodeeltjes naar tBLMs te bereiken. Het systeem combineert impedantiespectroscopie voor de real-time meting van geleidingsveranderingen over de tBLMs, met een horizontaal gerichte laserstraal die gouden nanodeeltjesverlichting aandrijft, voor warmteproductie.

Vastgebonden dubbellaagse lipidembranen om de warmteoverdracht tussen gouden nanodeeltjes en lipidembranen te bewaken

Een protocol voor het synthetiseren van ~12 nm diameter gouden nanodeeltjes (Au nanodeeltjes) in een organisch oplosmiddel wordt gepresenteerd. De gouden nanodeeltjes zijn afgedekt met oleylamine liganden om agglomeratie te voorkomen. De gouden nanodeeltjes zijn oplosbaar in organische oplosmiddelen zoals tolueen.

Gouden nanodeeltjessynthese

De gepresenteerde protocollen kunnen worden gebruikt om de respons van fluorescerend gelabelde microbubbels te karakteriseren die zijn ontworpen voor toepassingen met echografie-geactiveerde medicijnafgifte, inclusief hun activeringsmechanismen en hun bio-effecten. Dit artikel behandelt een reeks in vitro en in vivo microscopietechnieken die worden uitgevoerd om de relevante lengte en tijdschalen vast te leggen.

Multi-timescale microscopiemethoden voor de karakterisering van fluorescerend gelabelde microbubbels voor echografie-getriggerde medicijnafgifte

Ultrasnelle laserablatie in vloeistof is een nauwkeurige en veelzijdige techniek voor het synthetiseren van nanomaterialen (nanodeeltjes [NP's] en nanostructuren [NS's]) in vloeistof/luchtomgevingen. De laser-geablateerde nanomaterialen kunnen worden gefunctionaliseerd met Raman-actieve moleculen om het Raman-signaal van analyten die op of in de buurt van de NS's/NP's worden geplaatst te versterken.

Ultrasnelle lasergeablateerde nanodeeltjes en nanostructuren voor op het oppervlak verbeterde Raman-verstrooiingsgebaseerde detectietoepassingen

Leer de synthese van lichtresponsieve liposomen met gouden nanodeeltjes voor gerichte medicijnafgifte. Deze methode onthult het mechanisme van laser-gecontroleerde afgifte via microbelcavitatie.

Synthese van gouden nanodeeltjes geïntegreerde Photo-responsieve liposomen en waardering van hun Microbel Cavitatie bij Pulse Laser Excitatie (Video) | JoVE Journal

Synthese van gouden nanodeeltjes geïntegreerde Photo-responsieve liposomen en waardering van hun Microbel Cavitatie bij Pulse Laser Excitatie

Meer video's verkennen