Damid-seq: Genoom-brede kaart brengen van eiwit-DNA-interacties door High Throughput Sequencing van adenine gemethyleerd DNA-fragmenten
27 januari 2016
We beschrijven hierin een test door het koppelen van DNA adenine methyltransferase identificatie (damid) tot high throughput sequencing (damid-volgende). Deze verbeterde werkwijze een hogere resolutie en een groter dynamisch bereik en maakt analyse damid-seq data in combinatie met andere high throughput sequentiebepaling gegevens zoals ChIP-seq, RNA-seq, etc.
Het algemene doel van dit protocol is om genomische DNA-sequenties geassocieerd met eiwitten van belang in dierlijke cellen te detecteren door middel van high-throughput sequencing. Deze techniek kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in de studie van nucleaire organisatie en transcriptie of regulatie in zoogdiercellen, zoals het identificeren van genomische regio's geassocieerd met de nucleaire amyloïde of met specifieke transcriptiefactoren. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat high-throughput sequencing een hogere resolutie biedt dan het oorspronkelijke DamID-asset, met behulp van DNA-microarrays, en dat deze techniek kruisanalyse mogelijk maakt met onze high-throughput sequencing data.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Brennan Olson, een technicus uit ons laboratorium. Om te beginnen, volg het tekstprotocol om het gen van belang in de DamID-vector te klonen. Genereer vervolgens lentivirale stocks die DamV5 POY en V5-Dam tot expressie brengen met behulp van een lentiviraal expressiesysteem.
Cotransfecteer de DamID-vector met de lentivirale verpakkingsplasmiden volgens de voorwaartse transfectieprocedure in overeenstemming met het protocol van de fabrikant. Zorg ervoor dat u een filtratiestap opneemt met behulp van een nul punt vier vijf micron PVDF-filter. Bereid nu voor om de cellen te infecteren met het lentivirus.
Eén dag van tevoren, breng de adherende cellen over op zes-well platen. Blijf antibiotica gebruiken. Het doel is om de volgende dag 50% confluency te hebben voor de infectie.
De volgende dag, haal de bevroren DamV5 POY en V5-Dam lentivirale supernatanten uit de vriezer en plaats ze in een 37 graden Celsius waterbad om ze te ontdooien. Verwijder op de kweekplaten het groeimedium en vervang het met een halve milliliter vers groeimedium zonder antibiotica. Laad vervolgens de wells met een milliliter ontdooide lentivirus.
Laad twee wells met V5-Dam, twee wells met DamV5 POY en twee wells zonder lentivirus als negatieve controle. Roer de oplossing op de cellen en plaats de plaat terug in de incubator. 24 uur later, vervang de virale suspensies op de cellen met twee milliliter groeimedium zonder antibiotica.
Vervolgens, zet de incubatie nog 48 uur voort. Twee dagen later, voltooi dit proces door het tekstprotocol te volgen om het genomische DNA te isoleren, wat ongeveer een uur zou moeten duren. Vervolgens, versterk de adenine gemethyleerde DNA-fragmenten uit het genomische DNA.
Dit proces duurt ongeveer twee tot drie dagen, en de details worden behandeld in het tekstprotocol. Voor deze procedure, fragmenteer eerst het versterkte adenine gemethyleerde DNA. Voordat u de DNA Fragmentase gebruikt, is het belangrijk om eerst de sterkte te meten om de juiste verteringstijd te bepalen.
Gebruik eventueel beschikbare gezuiverde methyl PCR-producten voor deze diagnostische test. Begin met het opzetten van een master mix bestaande uit zes microgram DNA, 12 microliter 10X Fragmentase buffer, en vul het met water aan tot 114 microliter. Roer vervolgens de Fragmentase stock gedurende drie seconden en voeg zes microliter toe aan de master mix voor een totaal van 120 microliter.
Roer vervolgens de master mix gedurende drie seconden. Vul nu vijf reactiebuisjes met 20 microliter aliquoten van de master mix en incubeer alle zes buisjes bij 37 graden Celsius. Verwijder na vijf minuten één buisje en voeg vijf microliter EDTA toe om de reactie te stoppen.
Doe dit elke 10 minuten totdat alle reactiebuisjes zijn verzameld. Analyseer nu 12,5 microliter van elk buisje, wat overeenkomt met ongeveer een halve microgram DNA, en dezelfde hoeveelheid onverteerd DNA op een agarosegel. Bepaal uit de gel de minimale tijd die nodig is om de meerderheid van de smear te verteren tot ongeveer nul punt twee kilobasen.
Gebruik dit als de maximale verteringstijd. Stel nu de eigenlijke fragmentatie in, zoals de pretest, en stop de verteringen bij zes gelijkmatig verdeelde tijdstippen, inclusief vijf minuten, en bereken de maximale tijd. Na de vertering, verzamel de zes verteringen en zuiver ze met behulp van een PCR-zuiveringskit of solid phase reversible immobilization beads.
Verdun het gezuiverde DNA in ongeveer 15 microliter EB-buffer. De volgende stappen zijn om de uiteinden van het gefragmenteerde DNA te repareren, adenine overhangs toe te voegen, op de sequencing adapters te ligaren en de Y-vormige adapters om te zetten in dubbelstrengs DNA. Deze stappen worden allemaal beschreven in het tekstprotocol en zouden niet meer dan twee dagen moeten duren om te voltooien.
Nadat de sequencing adapters aan het gefragmenteerde DNA zijn gelieerd en de Y-vormige adapters zijn omgezet in dubbelstrengs DNA, selecteer fragmenten van de gewenste grootte. Begin met het voorbereiden van een twee procent agarose gel in TAE, en voeg met voorzorg ethidiumbromide toe tot een eindconcentratie van 500 nanogram per milliliter. Maak genoeg sporen voor alle monsters en twee ladders om omzoomd te worden door lege sporen.
Voeg nu acht microliter laadbuffer toe aan 10 microliter van elk DNA-eluaat en bereid de 1 Kb Plus ladder voor met 6X laadbuffer en water in een verhouding van één tot één tot vier. Laad vervolgens de gelsporen in de volgende volgorde: DNA ladder, DNA eluaten en nogmaals een DNA ladder. Eenmaal geladen, draai de gel aan 120 volt per 60 minuten.
Draag later veiligheidsbrillen en een gezichtsschild om de gel kort te bekijken met UV-licht. Controleer de DNA ladders om te zien of de gel ver genoeg is gelopen zodat drie gelslices kunnen worden uitgesneden tussen 300 en 400 basenparen. Snijd vervolgens de banden tussen 300 en 400 basenparen uit elke rij, altijd met een nieuw mes voor elke rij.
Verwijder zo min mogelijk van de gel om elke gelslice idealiter onder de 100 microliter te maken, en breng deze over naar zijn eigen microfugebuisje. Extraheer vervolgens het DNA uit de gelslices volgens het tekstprotocol. Volg vervolgens het tekstprotocol over hoe de sequencing adapter gemodificeerde fragmenten van het geëxtraheerde DNA te verrijken.
Krijg vervolgens een hoogwaardige analyse van het gezuiverde DNA door een Bioanalyzer, en als he
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe assay die DNA adenine methyltransferase-identificatie (DamID) combineert met high-throughput sequencing (DamID-seq). Deze verbeterde methode biedt een hogere resolutie en een breder dynamisch bereik voor het analyseren van genomische DNA-sequenties die geassocieerd zijn met eiwitten in dierlijke cellen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Genomics
- Moleculaire biologie
- Celbiologie
Achtergrond
- DamID-seq maakt de identificatie mogelijk van genomische regio's die gekoppeld zijn aan specifieke eiwitten.
- Deze techniek overtreft de oorspronkelijke DamID-methode die gebruikmaakte van DNA-microarrays.
- High-throughput sequencing faciliteert cross-analyse met andere typen sequentiedata.
- Het begrijpen van de nucleaire organisatie en transcriptieregulatie is cruciaal in zoogdiercellen.
Doel van de studie
- Om genomische DNA-sequenties te detecteren die geassocieerd zijn met eiwitten van belang.
- Om de resolutie van genomische analyse in dierlijke cellen te verbeteren.
- Om de integratie van DamID-seq-gegevens met andere high-throughput sequencing-datasets mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Kloneren van het gen van belang in de DamID-vector.
- Genereren van lentivirale stocks die DamV5 POY en V5-Dam tot expressie brengen.
- Gebruikmaken van een lentiviraal expressiesysteem voor genlevering.
- Uitvoeren van high-throughput sequencing om de gegevens te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- De methode biedt een hogere resolutie in vergelijking met eerdere technieken.
- Het maakt de identificatie mogelijk van genomische regio's die geassocieerd zijn met nucleaire eiwitten.
- Cross-analyse met andere sequeneringsgegevens vergroot het inzicht in transcriptiefactoren.
- De demonstratie van de procedure door een laboratoriumtechnicus illustreert de praktische toepassing ervan.
Conclusies
- Deze verbeterde DamID-seq-methode is een waardevol instrument voor genomische analyse.
- Het draagt bij aan het begrip van de nucleaire organisatie en genregulatie.
- De integratie van deze techniek met andere datasets opent nieuwe wegen voor onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
DamID-seq biedt een methode met hoge resolutie voor genoombrede mapping van eiwit-DNA-interacties, waardoor een nauwkeurige karakterisering van de nucleaire organisatie en transcriptionele regulatie in zoogdiercellen mogelijk wordt. Door adenine-methyleringsgebaseerde tagging te integreren met high-throughput sequencing, overwint deze techniek de beperkingen van microarray-afhankelijke DamID en ondersteunt het kruisanalyse met andere functionele genomica-datasets, zoals ChIP-seq en RNA-seq. Deze mogelijkheid verbetert de validatie van targets en het mechanistische risicomanagement in de vroege ontdekkingsfase door kwantitatieve, reproduceerbare interactiekaarten te leveren die de hypothese-gedreven selectie van drugtargets informeren.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door genoombrede eiwit-DNA-interacties met hoge precisie en gevoeligheid in kaart te brengen.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare, op amplificatie gebaseerde assay die antilichaam-afhankelijkheid vermijdt en werkt in diverse zoogdiercel-systemen.
- Voorspellende waarde: Genereert kwantitatieve interactieprofielen die ondersteuning bieden bij de beoordeling van target-betrouwbaarheid en de verduidelijking van pathways.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert genoombrede adenine-gemethyleerde fragmentgegevens die geschikt zijn voor normalisatie en vergelijking tussen experimentele condities.
- Operationele waarde: Levert short-read sequencinggegevens die compatibel zijn met standaard bioinformatica-pipelines voor peak calling en differentiële analyse.
- Schaalbaarheid: Maakt gemultiplexte monsterverwerking mogelijk en integratie met andere sequencing-gebaseerde assays voor gecoördineerde workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt vergelijking van eiwit-DNA-interactiekaarten met epigenetische en transcriptionele datasets mogelijk om de functionele relevantie te beoordelen.
- Operationele waarde: Ondersteunt longitudinale studies van nucleaire lamina-geassocieerde domeinen (LADs) en hun dynamiek in ziektemodellen.
- Translationele continuïteit: Faciliteert targetvalidatie op basis van biomarkers door bindingsevents te koppelen aan genexpressie en chromatinetoestanden.
Integratie van Pipeline & Workflow
DamID-seq past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van hypothesen over targets tot de identificatie van leads, en biedt mechanistische inzichten die compound-screening en preklinische validatie ondersteunen. De methode genereert genoombrede bindingsgegevens die kunnen worden geïntegreerd met resultaten van fenotypische screening om targets met een sterke mechanistische rationale te prioriteren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door het identificeren van directe genomische targets van kernproteïnen, transcriptiefactoren of chromatineregulatoren.
- Screening: Levert kwantitatieve, genormaliseerde read-outs (bijv. log2 RPKM-ratio's) die conditievergelijking en hit-validatie in screeningcampagnes mogelijk maken.
- Analytics: Genereert interactiekaarten met een hoge resolutie die geschikt zijn voor peak-detectie, motiefverrijking en correlatie met RNA-seq of ATAC-seq-gegevens.
- Translationeel Onderzoek: Maakt het mogelijk om eiwitbindingsplaatsen af te stemmen op ziekte-geassocieerde genomische varianten of expressie-QTL's wanneer dit wordt ondersteund door aanvullende gegevens.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het in kaart brengen van interacties van kernproteïnen over meerdere targets en cellijnen, waardoor redundante assay-ontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelmechanismen door direct bewijs op genoomniveau te leveren van eiwit-DNA-interacties.
- Operationele waarde: Standardiseert het in kaart brengen van interacties via amplificatiegebaseerde detectie, waardoor variabiliteit geassocieerd met antilichaamgebaseerde methoden wordt verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door biologische onzekerheid bij doelwitvalidatie en routeanalyse te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van doelwitten mogelijk op basis van reproduceerbare, kwantitatieve interactieprofielen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering voor het genereren van DamID-fusieconstructen en lentivirale vectoren.
- Is afhankelijk van toegang tot lentivirale productie, high-throughput sequencing en bio-informaticatools voor fragmentanalyse en peak calling.
- Vereist standaardisatie van infectiecondities, DNA-fragmentatieparameters en grootte-selectie voor reproduceerbare resultaten.
- Omvat optimalisatie van de digestietijd en de selectie van de fragmentgrootte (bijv. 300–400 bp) om een efficiënte library-preparatie te garanderen.
- Beperkt door de dichtheid van GATC-motieven in het genoom, wat de resolutie in AT-rijke of GC-extreme regio's kan beïnvloeden.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Generation and Expression of Fusion Proteins and Free Dam Proteins
3:12
Library Preparation: Fragmentation
5:29
Library Preparation: Size Selection
7:26
Results: Detecting Lamin B1 Binding Regions on the Mouse Chromosome One
8:20
Conclusion
