Primaire endodermale epitheelcellen Cultuur van de dooierzak membraan van de Japanse kwartel embryo

Het algemene doel van deze ex vivo explantprocedure is het verbeteren van de collectie en het uitbreiden van de toepassing van aviaire endodermale epitheelcellen om de functie van enzymen en eiwitten bij de bemiddeling van nutriëntenbenutting door aviaire embryo's te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de benutting van lipiden tijdens de aviaire embryogenese, zoals de wijze waarop dooierlipiden worden verpakt en van de dooier naar het embryo worden getransporteerd tijdens de latere stadia van de ontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we succesvol functionele endodermale epitheelcellen uit het dooierzakkniemeest van de Japanse kwinteldoost kunnen verkrijgen, die kunnen worden gebruikt als model om de aviaire embryonale ontwikkeling te bestuderen.

Begin met het maken van een 10x PBS-oplossing zoals beschreven in het tekstprotocol. Verdun deze stamoplossing een op tien om 1x PBS te bereiden, wat gebruikt zal worden om het membraan van de dooierzak te wassen tijdens de dissectie van het endoderm. Om groeimedium voor endodermale epitheelcellen, of EEC's, te bereiden, wordt DMEM/F-12 eerst aangevuld met 10% newborn calf serum en 1% penicilline streptomycin amfotericine-oplossing.

Plaats vervolgens de probe van een pH-meter in het vooraf bereide DMEM. Voeg druppelsgewijs 3normaal HCl toe aan het medium totdat de pH is bijgesteld naar 7,2. Nadat er ongeveer twee dozijn bevruchte k HSE-eieren zijn verzameld, worden deze verticaal in eierhouders geplaatst, zodanig dat de brede, niet taps toelopende uiteinden, waar de luchtkamers zich bevinden, naar boven wijzen.

Breng de eieren vervolgens over naar een goed geventileerde incubator die is ingesteld op 37 graden Celsius. Onderzoek de eieren na vijf dagen incubatie met een eierkijker. Als de embryo's zich normaal hebben ontwikkeld, zou er een cirkelvormige structuur van capillaire vaten onder de luchtkamer zichtbaar moeten zijn.

Selecteer een ei dat een normale capillaire ontwikkeling vertoont en reinig de schaal met vers water en 75% ethanol. Open vervolgens de eischaal bij de luchtkamer met een schaar. Gebruik een pincet om de inhoud van het ei voorzichtig uit te gieten in een lege kweekschaal van 10 cm.

Gebruik vervolgens een schaar om het embryo, de dooier en eventueel albumine los te maken van het dooierzakmembraan, afgekort als YSM. Was het geïsoleerde YSM drie keer in 1x PBS en breng het daarna over naar een nieuwe 10 cm schaal met PBS. Plaats de schaal vervolgens onder een dissectiemicroscoop.

Verwijder vervolgens met een schaar alle resten eiwit die grenzen aan de buitenste ectodermlaag van het YSM. Gebruik daarna een pincet om het doorschijnende ectoderm en het rode capillaire structurele mesoderm op te tillen vanaf de rand van het mesoderm op het eigelemmembraan. Pel vervolgens het ectoderm en mesoderm voorzichtig samen af om de onderliggende endodermcellaag te isoleren.

Houd vervolgens met één pincet de gele endodermale cellaag van het membraan stevig vast. Pak met een tweede pincet het capillaire mesoderm vast en trek het mesoderm vervolgens weg van de overgangsrand tussen het mesoderm en het endoderm. Knip met een schaar de resterende gele endodermlaag af en breng deze over naar de petri-schaal van zes centimeter gevuld met groeimedium.

Overbreng met een pipet het lichtgele endoderm vanuit de kweekschaal van zes centimeter naar een centrifugebuis van 15 mL na de YSM-collectie, en voeg hieraan 15 mL van het eerder bereide groeimedium toe. Plaats de conische buis in een waterbad van 37 °C totdat alle weefselcollecties zijn voltooid. Begin met het oplossen van 6,5 units Type IV collagenase in 10 mL DMEM.

Centrifugege daarna de buisjes met endoderm bij 130 ×g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Aspireer na centrifugatie het medium en breng met een pipet alle endodermmonsters over naar een kweekschaal van zes centimeter. Voeg vervolgens één milliliter collageenoplossing toe aan de schaal.

Snijd met een gebogen schaar het verzamelde endoderm van vier kwartelsembryo's in plakjes van ongeveer twee tot drie millimeter groot. Verzamel deze plakjes vervolgens in een centrifugebuis van 50 mL die al is gevuld met negen milliliter verse collagenase-oplossing. Om de celproliferatie tijdens de explantfase te verbeteren, wordt de buis geplaatst in een schuddend waterbad dat is ingesteld op 37 °C.

Incubeer vervolgens de kegelvormige buis 30 minuten om het weefsel gedeeltelijk te verteren met collagenase. De gedeeltelijke proteolytische digestie is de belangrijkste stap om de opbrengst van cellen uit het endoderm van het dooierzakmembraan te verbeteren. Onze gegevens tonen een significante verbetering van het succespercentage van de celkweek en celproliferatie door de digestieprocedure met collagenase aan.

Centrifugeer na de digestie met collagenase het weefsel gedurende drie minuten bij 130 ×g op kamertemperatuur en verwijder vervolgens de supernatant met een pipet. Was het pellet door het opnieuw te suspenderen in 20 mL DMEM. Centrifugeer de buis zoals eerder beschreven, verwijder daarna de supernatant en suspendeer het pellet opnieuw in 12 mL groeimedium.

Voeg vervolgens voorzichtig 500 µL van de suspensie toe aan elke put van een 24-wells plaat. Incubeer de endoderm-explantaten vervolgens gedurende twee dagen bij 37 °C in 5% CO2. Gedurende deze periode zullen de cellen uit de weefsels prolifereren.

Incubeer de cellen vervolgens nog twee dagen. Onderwerp ze daarna aan een cellevensvatbaarheidsassay en visualiseer de resultaten met een plaatlezer. Voer vervolgens RT-qPCR uit om de expressieniveaus van markers van belang in EEC's te evalueren en controleer de productgrootte van de RT-qPCR via gelelektroforese, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Vergeleken met onbehandelde explantaten vertoonden die welke gedeeltelijk waren verteerd met collagenase een significant toegenomen celproliferatie, zoals te zien is in deze grafieken en bepaald met een gepaarde t-test, wat het succes van het cultuursysteem aantoont. Om de effecten van andere enzymen te evalueren, werden celviabiliteitsassays uitgevoerd voor weefsels behandeld met collagenase en dispase, of met collagenase alleen. Gedurende de eerste vijf dagen van incubatie was de celgroei in beide condities vergelijkbaar.

Echter, van dag zes tot negen prolifereerden alleen collageenase-behandelde EEC's gestaag, wat suggereert dat gedeeltelijke digestie met dit enzym de groei verbetert en bij voorkeur gebruikt moet worden. Wanneer de gekweekte EEC's werden gevisualiseerd, vertoonden zij de adipocyten-achtige kenmerken van grote circulaire lipidedruppels, zoals hier wordt getoond. Dergelijke cellen waren ook positief voor Oil Red O-kleuring, die gewoonlijk wordt gebruikt om adipocyten te identificeren.

Ter ondersteuning van deze morfologische gegevens onthulde real-time kwantitatieve PCR dat gekweekte EEC's hoge niveaus van SOAT1 vertonen, een eiwit dat cholesterolester synthetiseert uit cholesterol. Dit suggereert verder dat gekweekte EEC's de juiste fysiologische kenmerken van adipocyten vertonen. Belangrijk is dat wanneer EEC's gedurende 24 uur werden gekweekt en blootgesteld aan IBMX en forskoline, factoren die de spiegels van cyclisch adenosinemonofosfaat, of cAMP, verhogen, beide behandelingen de SOAT1-expressie stimuleerden, wat wijst op mogelijke mechanismen van SOAT1-regulatie en lipidenbenutting in het YSM.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer vier uur worden uitgevoerd, waarbij in die tijd ten minste drie monsters kunnen worden verzameld. Na deze procedure kunnen methoden zoals SOAT1 of andere enzymatische activiteitsassays, evenals soortgelijke visuele bevestigingen, worden uitgevoerd. Dergelijke assays kunnen helpen bij het beantwoorden van aanvullende vragen, zoals op welke wijze bepaalde eiwitten en macronutriënten betrokken zijn bij de latere stadia van de embryonale ontwikkeling.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van embryonale nutriëntenbenutting om het mogelijke mechanisme te onderzoeken waarmee nutriënten worden benut en getransporteerd in een avian embryonaal model. Na het bekijken van deze video zou u moeten hebben geleerd hoe u endodermweefsels verzamelt uit aviane embryo's, en zou u moeten weten hoe u EEC's kweekt voor het bestuderen van embryonaal nutriëntentransport en -benutting met behulp van het aviane model.