Name: Primaire endodermale epitheelcellen Cultuur van de dooierzak membraan van de Japanse kwartel embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Leer primaire endodermale epitheelcellen kweken uit de dooierzak van Japanse kwartel embryo. Deze methode onderzoekt lipidenvervoer en voedingsstofbenutting tijdens de embryonale ontwikkeling van vogels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiering voor de ontwikkeling van het huidige protocol is vooral gesteund door &quot;Doel voor de Top Universiteit Plan &#39;van de National Taiwan University, Taiwan (subsidie ​​ID-104R350144), evenals het ministerie van Wetenschap en Technologie van Taiwan (subsidie ​​ID: MOST 104 -2313-B-002-039-my3). We hebben vooral dank de Center for Biotechnology van de National Taiwan University voor het verstrekken van een dier kamer en laboratoriumruimte voor de huidige studie.

OPMERKING: Deze procedure is een modificatie van een kip model cultuur protocol ontwikkeld door Bauer et al 2013 en Nakazawa et al, 2011 2,9.. 1. Bereid Gezonde embryonale Dag 5 embryo&#39;s uit de Japanse kwartel <ol><li> Plaats 1 mannelijke en 3 vrouwelijke geslachtsrijp Japanse kwartel samen in dezelfde kooi. Supply voer en water ad libitum. Pas het licht in het dier kamer 14 uur licht en 10 uur duisternis. </li><li> Verzamel bevruchte eieren in plastic zakken elke dag in de middag en bewaar ze in een 16 ° C koelkast om de groei van de embryo&#39;s te vertragen. </li><li> Na een voldoende aantal eieren te verzamelen binnen een periode van twee weken, broeden de bevruchte eieren in een 37 ° C incubator met goede ventilatie voor vijf dagen. </li></ol> 2. Bereid Basale Medium en Wash Solutions <ol><li> Gebruik DMEM / F-12 medium (pH 7,2) als groeimedium en aanvullenmet 10% pasgeboren kalf serum (NBCS) en 1% Pen-Strep Ampho. Oplossing (PSA, penicilline, 10 5 eenheden / l, streptomycine 100 mg / l; Amfotericine B, 0,25 mg / l). </li><li> Bereid oplossing fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij een 10x concentratie voor opslag; Gebruik 1x PBS-oplossing (bevattende NaCl, 137,93 mM, KCl, 2,667 mM; KH 2PO 4, 1,471 mM; Na 2 HPO 4 -7H 2 O, 8,06 mM, op pH 7,2) te wassen en bevochtigen dooierzak membraan terwijl scheiden van het endoderm uit eidooier en albumine. </li><li> Gebruik DMEM medium (pH 7,2) te resuspenderen endoderm pellets. </li></ol> 3. Inning van Primary EECS van de Japanse kwartel YSMs <ol><li> Incubeer de verzamelde eieren voor 5 dagen (stap 1,3). Onderzoek de eieren met een ei candler de normale embryonale ontwikkeling te bevestigen. OPMERKING: Op embryonale dag 5 de grens van YSM mesoderm is duidelijk en 3 embryonale lagen minder strak tegen elkaar verbonden, zodat het gemakkelijk te obTain endoderm. Gebruik alleen de eieren met normale capillaire circulatie ontwikkeling YSM collecties. </li><li> Maak de eierschaal voorzichtig met vers water en 75% ethanol. Open de eierschaal uit de lucht cel positie door een schaar, zachtjes schil uit en verzamel de gehele YSM door pincet en plaats in een 10 cm cultuur schotel gevuld met 37 ° C 1x PBS. </li><li> Met behulp van een schaar verwijder het embryo, dooier en eiwit, en voorzichtig wassen YSM met 1x PBS en driemaal plaats YSM in PBS oplossing in een 10 cm kweekschaal. </li><li> Gebruik pincet en een schaar om het ectoderm van YSM verwijderen. Gebruik 2 tang, een om stevig vast te houden de endodermale cellaag, en de andere naar de capillaire mesoderm te houden. </li><li> Onder een microscoop ontleden, uit elkaar trekken en scheiden de endoderm van de rand van het mesoderm in de richting van het embryo. Verzamel de lichtgele endoderm in 50 ml centrifugebuizen behulp van een druppelaar en plaats in 15 ml kweekmedium in een 37 ° C water bad totdat alle weefsel collecties zijn voltooid. </li></ol> 4. Digestie van de Endoderm Slices door Collagenase Spijsvertering <ol><li> Vers ontbinden 6,5 eenheden van type IV collagenase in 10 ml DMEM. </li><li> Centrifugeer de 50 ml buizen (3,4) en 130 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het medium en leg alle endoderm in een 6 cm cultuur schotel met een pipet. Voeg 1 ml collagenase oplossing hiervoor kweekschaal. </li><li> Snijd de vanuit 2 kwartel embryo&#39;s met een paar gebogen schaar tot de grootte van elk segment endoderm ongeveer 2 tot 3 mm. Gebruik een pipet, verzamel alle segmenten in een 50 ml centrifugebuis met 9 ml verse collagenaseoplossing. </li><li> Digereer het weefsel met collagenase gedurende 30 min in een 37 ° C schuddend waterbad bij 175 rpm. Deze gedeeltelijke digestie met collagenase wordt gebruikt om de proliferatie explantatie cel verbeteren. </li><li> Centrifugeren bij 130 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en verwijder voorzichtig de bovenstaande fractie met een pipet. Was de pellet door de suspensie in 20 ml DMEM en verwijder de bovenstaande fractie na 130 xg centrifugeren gedurende 3 minuten. </li><li> Resuspendeer de pellet met 12 ml groeimedium (DMEM / F12 met 10% NBCS en 1% PSA) en zaden voorzichtig en gelijkmatig in een 24-well plaat (elk putje met 500 pi celoplossing). </li><li> Incubeer weefselexplantaten bij 37 ° C in 5% CO2 in lucht gedurende 2 dagen om cellen te laten groeien uit de weefsels. </li><li> Incubeer cellen gedurende nog 2 dagen en karakteriseren van cellevensvatbaarheid door cellevensvatbaarheid testprotocol. 15 LET OP: Levende cellen handhaven van een reducerende omgeving in de cytosol. Resazurin, het actieve bestanddeel, is een niet-toxisch, celpermeabel verbinding die blauw van kleur en vrijwel niet-fluorescerend. Wanneer toegevoegd aan celculturen resazurin wordt gereduceerd tot Resorufin in het cytoplasma van mitochondriale enzymen. Resorufin is rood van kleur en zeer fluorescent. Levensvatbare cellen continu zetten resazurin om resorufin, Incremend de totale fluorescentie en kleur van het kweekmedium omringende cellen. </li><li> Voer endoderm epitheelcellen totale RNA-isolatie, reverse transcriptie en kwantitatieve real-time PCR van merkergen mRNA-expressie zoals beschreven. 16,17 <ol><li> Gebruik reverse transcriptase PCR om mRNA te detecteren SOAT1 (sense: 5&#39;- GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 &#39;; antisense: 5&#39;-ATCTGCACGTGACATGACCA-3&#39;; PCR-product = 168 bp) als een specifieke marker voor EEG-cellen. Gebruik β-actine-mRNA (sense: 5&#39;TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 &#39;; antisense: 5&#39;GTGATGGACTCTGGTGATGG-3&#39;; PCR-product = 151 bp) als een housekeeping gen en interne controle. </li><li> Gebruik gelelektroforese om de productgrootte van RT-qPCR detecteren. Bereid 1% agarose gel en meng 10 pl qPCR product met 2 pl ladingskleurstof. Load 10 pi mengsel in elk putje in de 1% agarosegel, en uitvoeren van de gel door 100V gedurende 30 minuten. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+white+proteins+and+their+potential+use+in+food+processing+or+as+nutraceutical+and+pharmaceutical+agents--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review.</a> Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).</li>
<li>Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+chicken+yolk+sac+acquires+nutrient+transport+competence+by+an+orchestrated+differentiation+process+of+its+endodermal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells.</a> J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).</li>
<li>Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concentration+of+different+lipid+classes+during+late+embryonic+development+in+a+randombred+turkey+population+and+a+subline+selected+for+increased+body+weight+at+sixteen+weeks+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age.</a> Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).</li>
<li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+expression+of+acyl-coenzyme+A%3A+cholesterol+acyltransferase+in+the+yolk+sac+membrane%2C+liver%2C+and+intestine+of+developing+embryos+and+posthatch+turkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys.</a> Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).</li>
<li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ontogeny+of+fatty+acid-binding+protein+in+turkey+%28Meleagridis+gallopavo%29+intestine+and+yolk+sac+membrane+during+embryonic+and+early+posthatch+development%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development.</a> Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).</li>
<li>Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+endodermal+epithelial+cells+on+the+synthesis+of+plasma+LDL+and+HDL+in+the+chick+yolk+sac%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac.</a> Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).</li>
<li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+endodermal+epithelium+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).</li>
<li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+across+endodermal+cells+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).</li>
<li>Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yolk+sac+endoderm+is+the+major+source+of+serum+proteins+and+lipids+and+is+involved+in+the+regulation+of+vascular+integrity+in+early+chick+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development.</a> Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).</li>
<li>Noble, R. C., Cocchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+and+the+neonatal+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism and the neonatal chicken.</a> Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).</li>
<li>Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+esterification+of+cholesterol+in+the+yolk+sac+membrane+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo.</a> Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).</li>
<li>Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+nutrient+transporters+and+digestive+enzymes+in+the+yolk+sac+membrane+and+small+intestine+of+the+developing+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick.</a> Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).</li>
<li>Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+Induction+of+VLDLy+Assembly+in+Egg-Laying+Hens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens.</a> J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).</li>
<li>Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+consumption+of+yolk+granules+during+the+development+of+quail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos.</a> Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22alamarBlue+Cell+Viability+Assay+Protocol%22">alamarBlue Cell Viability Assay Protocol</a>. , Source: 
 <a target="_blank" href="https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4">https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4</a> (2008).</li>
<li>Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Amelioration+of+High-Fat+Diet-Induced+Fatty+Liver+by+Docosahexaenoic+Acid+and+Lysine+Supplementations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations.</a> Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).</li>
<li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+receptor+1+regulates+bone+formation+and+osteoblast+differentiation+by+GSK-3%CE%B2%2F%CE%B2-Catenin+signaling+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice.</a> Bone. 64, 147-154 (2014).</li>
</ol>

Er zijn geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten. We hebben geen financiering ontvangen van enig particulier bedrijf.

Omdat de vorige cultuur systeem slechts beperkt succes, is een betere kweeksysteem nodig. De Japanse kwartel YSM endoderm vereist een behandeling met proteolytische enzymen zoals collagenase aan de cel-cel verbindingen los te maken om betere groei in de ex-vivo explantaten te bereiken. Onze gegevens tonen aan dat het aantal cellen van gedeeltelijke digestie behandeling na zaaien gedurende 2 dagen (figuur 1) groter is dan de onverteerde weefselkweek waren. Daarom is de gedeeltelijke proteolytische digest...

De grotere voedingswaarde bron van het aviaire embryo dooier, bestaande uit 33% lipiden, 17% eiwit en 1% as. 1 tijdens de embryonale ontwikkeling, de dooierzak membraan (YSM) groeit vanuit de embryonale buikholte en geleidelijk omvat de dooier oppervlak. Beginnend bij de embryonale dag 2, wordt genexpressie geassocieerd met de vetstofwisseling en angiogenese geleidelijk verhoogd in YSM, en de YSM ontwikkelt zich langzaam villus-achtige projecties. 8,9 Deze projecties te verhogen absorptie van dooier voedingsstoffen naar de embryonale ontwikkeling te ondersteunen. De YSM is een extra-embryonale weefsel dat drie kiem lagen, endoderm, mesoderm en ectoderm bevat. 14 De dooierzak ectoderm kijkt uit op het eiwit en banden met de vitelline membraan om voorzichtig te dekken de dooierzak. De endodermale epitheelcellen worden direct geconfronteerd met de richting van de eidooier en dienen als nutriëntenbenutting portals. 6 Zoals de YSM uitbreidt, endodermale epitheliale cellen (EECS) kan worden gedeeld door shape en functionaliteit in twee groepen, het gebied vitelline en omgeving vasculosa. 7 Area vitelline bestaat uit endodermale cellen en is ver van het embryo; gebied vasculosa bestaat uit mesodermale cellen en dekt gedifferentieerde EECS met bloedvaten en bindweefsel. Door embryonale dag 5 wordt de dooier volledig onder ectoderm en endoderm van YSM en de vasculaire gebied snel gegroeid. De YSM absorbeert, opnieuw samenstelt en releases lipiden (als-dooier afgeleid zeer low density lipoprotein) en eiwitten in de embryonale bloedsomloop. 9, 2 Daarom is een primaire Japanse kwartel embryonale endodermale epitheelcel kweeksysteem opgericht we, om de mechanismen van lipide bestuderen gebruik in YSM tijdens aviaire embryonale ontwikkeling. Lipiden zoals triglyceriden, lecithine, fosfolipiden en cholesterol ester (CE) zijn de primaire energiebronnen voor aviaire embryo&#39;s. In de vroege stadia van ontwikkeling, dooier lipiden composed van slechts 1,3% CE en het stijgt tot 10-15% op de middellange termijn van aviaire embryonale ontwikkeling 3, is 11. Cholesterol ester gesynthetiseerd uit cholesterol door sterol O-acyltransferase 1 (SOAT1) in aviaire embryo YSM. 4 De opslag vorm van cholesterol is CE, wordt CE uitgevoerd in lipoproteïnen, en lipoproteïnen worden door het verkeer getransporteerd naar weefsels. 13 Een week voor luik is er een snelle groei van aviaire embryo&#39;s. Ongeveer 68% van de resterende inhoud lipide in de dooier wordt geabsorbeerd tijdens deze fase. 10 Het mechanisme waarmee lipiden dooier gebruikt kan worden verduidelijkt door EEG onderzoeksmodel. Een kip EEG cultuurprotocol opgericht om dit onderzoek doel te bereiken. 2, 9 Vanwege de lage slagingspercentage weefsel explantaten een verbeterde celcultuur procedure EEG nodig is om de functie van bepaalde enzymen en eiwitten te bestuderen in het mediëren nutriëntenbenutting door aviaire embryo tijdens de ontwikkeling.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>12800-017 10 X 1 L</td><td>Voor het wassen van de EECs pellets</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>12400-024 10 X 1 L</td><td>Als basaal medium bij het kweken van EECs</td></tr><tr><td>NBCS</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>16010-159</td><td>Als aanvullend serum bij het kweken van EECs</td></tr><tr><td>Pen-Strep Ampho. Oplossing</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>03-033-1B 100 ml</td><td>Voor het verminderen van mogelijke infectie</td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>17104-019 1 g</td><td>Collagenase is een protease met specificiteit voor de binding tussen een neutraal aminozuur (X) en glycine in de sequentie Pro-XGly-Pro. Als protease voor het dissociëren van cellen uit primair weefsel.</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>FALCON&reg;</td><td>REF-353047</td><td>Voor het hechten en uitbreiden van EECs</td></tr><tr><td>50 ml PP centrifuge tubes</td><td>Corning&reg; CentriStarTM</td><td>430829</td><td>Voor transport van membranen en enzymdigeratie</td></tr><tr><td>50 ml Conical bottomed Tube met Cap</td><td>PRO TECH</td><td>CT-50-PL-TW</td><td>Voor transport van membranen en enzymdigeratie</td></tr><tr><td>Reciproke schudbaad</td><td>DEAGLE</td><td>SB302</td><td>Voor betere enzymatische digeratie van membranen</td></tr></tbody></table>

primaire endodermale epitheelcellen cultuur van de dooierzak membraan van de japanse kwartel embryo

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Wij vestigden een endodermale epitheliale celcultuur model (EEG) voor het bestuderen van de functie van bepaalde enzymen en eiwitten in het bemiddelen nutriëntenbenutting door aviaire embryo&#39;s tijdens de ontwikkeling. Bevruchte Japanse kwartel eieren werden bij 37 ° C gedurende 5 dagen en dan dooierzak membranen (YSM) werden verzameld om de EEG-cultuur op te zetten. We isoleerden embryonale endoderm laag uit YSM, en gesneden het membraan in 2-3 mm gesneden en gedeeltelijk gedigereerd met collagenase voor het zaaien in 24-well kweekplaten. De EECS vermenigvuldigen uit het weefsel en zijn klaar voor celcultuur studies. We vonden dat de EECS had typische kenmerken van YSM in vivo, bijvoorbeeld, accumulatie van lipide druppeltjes, expressie van sterol O-acyltransferase en lipoproteïne lipase. De gedeeltelijke spijsvertering behandeling aanzienlijk toegenomen de succesvolle tarief van EEG-cultuur. Gebruik makend van de EECS, hebben we aangetoond dat de expressie van SOAT1 werd gereguleerd door de cAMP dependent proteïne kinase A gerelateerde route. Deze primaire Japanse kwartel EEG kweeksysteem is een nuttig instrument om embryonale lipide transport te bestuderen en om de rol van genen die betrokken zijn bij de bemiddeling nutriëntenbenutting in YSM tijdens aviaire embryonale ontwikkeling te verduidelijken.

Met het oog op het doel van de oprichting van een consistente en bruikbare cel model te bereiken, moeten we uit te breiden en het stabiliseren van de proliferatie snelheid en prestaties van aviaire EECS. We vergeleken directe incubatie van het endoderm zonder enzymdigestie met endoderm gedeeltelijk gedigereerd met proteolytische enzymen, zoals collagenase of collagenase plus 0,6 U Dispase. Dispase een amino-endopeptidase dat het N-terminale peptide bindingen van niet-polaire aminozuurres...

Om het mechanisme van lipidenbeschikbaarheid in dooierzakmembranen tijdens de late stadia van embryonale ontwikkeling van vogels te bestuderen, hebben we een primaire Japanse kwartelembryonale endoderm epitheliale celkweeksysteem opgezet.

Primaire endodermale epitheelcellen Cultuur van de dooierzak membraan van de Japanse kwartel embryo

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Het algemene doel van deze ex vivo explantprocedure is het verbeteren van de collectie en het uitbreiden van de toepassing van aviaire endodermale epitheelcellen om de functie van enzymen en eiwitten bij de bemiddeling van nutriëntenbenutting door aviaire embryo's te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de benutting van lipiden tijdens de aviaire embryogenese, zoals de wijze waarop dooierlipiden worden verpakt en van de dooier naar het embryo worden getransporteerd tijdens de latere stadia van de ontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we succesvol functionele endodermale epitheelcellen uit het dooierzakkniemeest van de Japanse kwinteldoost kunnen verkrijgen, die kunnen worden gebruikt als model om de aviaire embryonale ontwikkeling te bestuderen.Begin met het maken van een 10x PBS-oplossing zoals beschreven in het tekstprotocol. Verdun deze stamoplossing een op tien om 1x PBS te bereiden, wat gebruikt zal worden om het membraan van de dooierzak te wassen tijdens de dissectie van het endoderm. Om groeimedium voor endodermale epitheelcellen, of EEC's, te bereiden, wordt DMEM/F-12 eerst aangevuld met 10% newborn calf serum en 1% penicilline streptomycin amfotericine-oplossing.Plaats vervolgens de probe van een pH-meter in het vooraf bereide DMEM. Voeg druppelsgewijs 3normaal HCl toe aan het medium totdat de pH is bijgesteld naar 7,2. Nadat er ongeveer twee dozijn bevruchte k HSE-eieren zijn verzameld, worden deze verticaal in eierhouders geplaatst, zodanig dat de brede, niet taps toelopende uiteinden, waar de luchtkamers zich bevinden, naar boven wijzen.Breng de eieren vervolgens over naar een goed geventileerde incubator die is ingesteld op 37 graden Celsius. Onderzoek de eieren na vijf dagen incubatie met een eierkijker. Als de embryo's zich normaal hebben ontwikkeld, zou er een cirkelvormige structuur van capillaire vaten onder de luchtkamer zichtbaar moeten zijn.Selecteer een ei dat een normale capillaire ontwikkeling vertoont en reinig de schaal met vers water en 75% ethanol. Open vervolgens de eischaal bij de luchtkamer met een schaar. Gebruik een pincet om de inhoud van het ei voorzichtig uit te gieten in een lege kweekschaal van 10 cm.Gebruik vervolgens een schaar om het embryo, de dooier en eventueel albumine los te maken van het dooierzakmembraan, afgekort als YSM. Was het geïsoleerde YSM drie keer in 1x PBS en breng het daarna over naar een nieuwe 10 cm schaal met PBS. Plaats de schaal vervolgens onder een dissectiemicroscoop.Verwijder vervolgens met een schaar alle resten eiwit die grenzen aan de buitenste ectodermlaag van het YSM. Gebruik daarna een pincet om het doorschijnende ectoderm en het rode capillaire structurele mesoderm op te tillen vanaf de rand van het mesoderm op het eigelemmembraan. Pel vervolgens het ectoderm en mesoderm voorzichtig samen af om de onderliggende endodermcellaag te isoleren.Houd vervolgens met één pincet de gele endodermale cellaag van het membraan stevig vast. Pak met een tweede pincet het capillaire mesoderm vast en trek het mesoderm vervolgens weg van de overgangsrand tussen het mesoderm en het endoderm. Knip met een schaar de resterende gele endodermlaag af en breng deze over naar de petri-schaal van zes centimeter gevuld met groeimedium.Overbreng met een pipet het lichtgele endoderm vanuit de kweekschaal van zes centimeter naar een centrifugebuis van 15 mL na de YSM-collectie, en voeg hieraan 15 mL van het eerder bereide groeimedium toe. Plaats de conische buis in een waterbad van 37 °C totdat alle weefselcollecties zijn voltooid. Begin met het oplossen van 6,5 units Type IV collagenase in 10 mL DMEM.Centrifugege daarna de buisjes met endoderm bij 130 ×g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Aspireer na centrifugatie het medium en breng met een pipet alle endodermmonsters over naar een kweekschaal van zes centimeter. Voeg vervolgens één milliliter collageenoplossing toe aan de schaal.Snijd met een gebogen schaar het verzamelde endoderm van vier kwartelsembryo's in plakjes van ongeveer twee tot drie millimeter groot. Verzamel deze plakjes vervolgens in een centrifugebuis van 50 mL die al is gevuld met negen milliliter verse collagenase-oplossing. Om de celproliferatie tijdens de explantfase te verbeteren, wordt de buis geplaatst in een schuddend waterbad dat is ingesteld op 37 °C.Incubeer vervolgens de kegelvormige buis 30 minuten om het weefsel gedeeltelijk te verteren met collagenase. De gedeeltelijke proteolytische digestie is de belangrijkste stap om de opbrengst van cellen uit het endoderm van het dooierzakmembraan te verbeteren. Onze gegevens tonen een significante verbetering van het succespercentage van de celkweek en celproliferatie door de digestieprocedure met collagenase aan.Centrifugeer na de digestie met collagenase het weefsel gedurende drie minuten bij 130 ×g op kamertemperatuur en verwijder vervolgens de supernatant met een pipet. Was het pellet door het opnieuw te suspenderen in 20 mL DMEM. Centrifugeer de buis zoals eerder beschreven, verwijder daarna de supernatant en suspendeer het pellet opnieuw in 12 mL groeimedium.Voeg vervolgens voorzichtig 500 µL van de suspensie toe aan elke put van een 24-wells plaat. Incubeer de endoderm-explantaten vervolgens gedurende twee dagen bij 37 °C in 5% CO2. Gedurende deze periode zullen de cellen uit de weefsels prolifereren.Incubeer de cellen vervolgens nog twee dagen. Onderwerp ze daarna aan een cellevensvatbaarheidsassay en visualiseer de resultaten met een plaatlezer. Voer vervolgens RT-qPCR uit om de expressieniveaus van markers van belang in EEC's te evalueren en controleer de productgrootte van de RT-qPCR via gelelektroforese, zoals beschreven in het tekstprotocol.Vergeleken met onbehandelde explantaten vertoonden die welke gedeeltelijk waren verteerd met collagenase een significant toegenomen celproliferatie, zoals te zien is in deze grafieken en bepaald met een gepaarde t-test, wat het succes van het cultuursysteem aantoont. Om de effecten van andere enzymen te evalueren, werden celviabiliteitsassays uitgevoerd voor weefsels behandeld met collagenase en dispase, of met collagenase alleen. Gedurende de eerste vijf dagen van incubatie was de celgroei in beide condities vergelijkbaar.Echter, van dag zes tot negen prolifereerden alleen collageenase-behandelde EEC's gestaag, wat suggereert dat gedeeltelijke digestie met dit enzym de groei verbetert en bij voorkeur gebruikt moet worden. Wanneer de gekweekte EEC's werden gevisualiseerd, vertoonden zij de adipocyten-achtige kenmerken van grote circulaire lipidedruppels, zoals hier wordt getoond. Dergelijke cellen waren ook positief voor Oil Red O-kleuring, die gewoonlijk wordt gebruikt om adipocyten te identificeren.Ter ondersteuning van deze morfologische gegevens onthulde real-time kwantitatieve PCR dat gekweekte EEC's hoge niveaus van SOAT1 vertonen, een eiwit dat cholesterolester synthetiseert uit cholesterol. Dit suggereert verder dat gekweekte EEC's de juiste fysiologische kenmerken van adipocyten vertonen. Belangrijk is dat wanneer EEC's gedurende 24 uur werden gekweekt en blootgesteld aan IBMX en forskoline, factoren die de spiegels van cyclisch adenosinemonofosfaat, of cAMP, verhogen, beide behandelingen de SOAT1-expressie stimuleerden, wat wijst op mogelijke mechanismen van SOAT1-regulatie en lipidenbenutting in het YSM.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer vier uur worden uitgevoerd, waarbij in die tijd ten minste drie monsters kunnen worden verzameld. Na deze procedure kunnen methoden zoals SOAT1 of andere enzymatische activiteitsassays, evenals soortgelijke visuele bevestigingen, worden uitgevoerd. Dergelijke assays kunnen helpen bij het beantwoorden van aanvullende vragen, zoals op welke wijze bepaalde eiwitten en macronutriënten betrokken zijn bij de latere stadia van de embryonale ontwikkeling.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van embryonale nutriëntenbenutting om het mogelijke mechanisme te onderzoeken waarmee nutriënten worden benut en getransporteerd in een avian embryonaal model. Na het bekijken van deze video zou u moeten hebben geleerd hoe u endodermweefsels verzamelt uit aviane embryo's, en zou u moeten weten hoe u EEC's kweekt voor het bestuderen van embryonaal nutriëntentransport en -benutting met behulp van het aviane model.

primary-endodermal-epithelial-cell-culture-from-yolk-sac-membrane

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze video toont nieuwe cultuur, een methode waarbij kippenembryo's zich buiten het ei gekweekt tot 24 uur. Deze methode stelt je in staat om te studeren vroege ontwikkeling (primitieve streep tot 14 som.), Een periode die overeenkomt met E7-9 in de muis. Toepassingen van deze techniek zijn onder elektroporatie, in situ hybridisatie en immunohistochemie.

Methode voor Cultuur van Early kippenembryo&#39;s ex vivo (Nieuwe Cultuur)

Dit artikel geeft een methode voor het isoleren en kweken van kwartels of kippen...

Isolatie en Cultuur van Aviaire Embryonic Valvulaire Progenitor Cellen

Een benadering voor het analyseren van migratie en de uiteindelijke lot van aviaire neurale lijst cellen in kwartel-chick chimere embryo's wordt beschreven. Deze methode is een eenvoudige en directe techniek voor het opsporen van neurale lijst cellen tijdens migratie en differentiatie die anders moeilijk te onderscheiden binnen een ongemanipuleerde kippenembryo.

Analyse van de neurale lijst migratie en differentiatie door Cross-soorten transplantatie

Dit artikel bevat een bijgewerkte aanpak van de klassieke kwartel-kip chimera systeem te bestuderen van de vorming van het orgel, door het combineren van nieuwe in vitro en in ovo experimentele procedures.

De aanpak in twee stappen om te verkennen van de vroege - en Late-stadia van de vorming van het orgel in de aviaire Model: de zwezerik en de bijschildklier klieren organogenese paradigma

Hier presenteren we een organotypic kweken protocol om te groeien van embryonale kip organen in vitro. Met deze methode kan de ontwikkeling van embryonale kip weefsel worden bestudeerd, met behoud van een hoge mate van controle over de omgeving van de cultuur.

Organotypic cultuur methode om te studeren van de ontwikkeling van embryonale kip weefsels

Dit artikel bevat een methode voor het isoleren van pure embryonale weefsels van kwartel en kip embryo's die kunnen worden samengevoegd tot ex vivo chimeer organen.

Isolatie van embryonale weefsels en vorming van kwartel-kip chimeer organen met behulp van het voorbeeld van de Thymus

Dit protocol beschrijft de isolatie van epitheelcellen uit verschillende anatomische gebieden van het humaan amniotische membraan om hun heterogeniteit en functionele eigenschappen te bepalen voor mogelijke toepassing in klinische en physiopathologische modellen.

In vitro cultuur van epitheelcellen uit verschillende anatomische gebieden van het humaan Amniotische membraan

We beschrijven een eenvoudig protocol voor de ontwikkeling van mucociliarie epitheelorganoïden uit diepe ectoderm cellen geïsoleerd van Xenopus laevis embryo's. De multipotige voorlopers regenereren epitheel bekercelprecursoren en laten live tracking van de initiatie en progressie van de celovergangen op het oppervlak van organoïden toe.

Mucociliary Epithelial Organoids van Xenopus Embryonal Cells: Generatie, Cultuur en High-Resolution Live Imaging

Het chorioallantoic membrane (CAM) van het aviaire embryo is een zeer nuttig en toepasbaar hulpmiddel voor verschillende onderzoeksgebieden. Een speciaal ex ovo model van Japanse kwartel CAM is geschikt voor fotodynamisch behandelonderzoek.

Kwartel Chorioallantoic Membrane - Een hulpmiddel voor fotodynamische diagnose en therapie

Dit veelzijdige protocol beschrijft de isolatie van premigratory neural crest cells (NCC's) door de excisie van craniale neurale plooien van kuikenembryo's. Bij plating en incubatie komen migrerende NCC's tevoorschijn uit neurale vouwexplantaten, waardoor celmorfologie en migratie in een vereenvoudigde 2D-omgeving kunnen worden beoordeeld.

Voorbereiding en morfologische analyse van Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Leer primaire endodermale epitheelcellen kweken uit de dooierzak van Japanse kwartel embryo. Deze methode onderzoekt lipidenvervoer en voedingsstofbenutting tijdens de embryonale ontwikkeling van vogels.

Primaire endodermale epitheelcellen Cultuur van de dooierzak membraan van de Japanse kwartel embryo

Meer video's verkennen