Identificatie van kinesine-1 Cargos Met behulp van fluorescentiemicroscopie

Het algemene doel van deze methodologie is om de Kinesin-1-cargo's te identificeren met behulp van fluorescentiemicroscopie. Deze methode helpt ons om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van moleculaire motoren, zoals welke lading wordt vervoerd door kinesins en myosines. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de dominante negatieve KIF5B-mutanten ons kunnen helpen deze lading visueel te identificeren met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Om te beginnen, voor levende cel- of indirecte fluorescentie-beeldvorming bij 40X of lager, voed 0,2 tot 0,3 miljoen HeLa-cellen in één milliliter compleet medium in elke put van een zes-puttenplaat. Laat de cellen groeien bij 37 graden Celsius met vijf procent koolstofdioxide. Voor indirecte immunofluorescentiestudies met vergrotingen boven de 40X, gebruik in een bioveiligheidskast om besmetting te voorkomen, absoluut alcohol om dekglasjes te wassen en zet ze verticaal in de putjes van een zes-puttenplaat om te drogen.

Wanneer de dekglazen drogen, leg ze dan in de putjes en zaai 0,2 tot 0,3 miljoen cellen in één milliliter compleet DMEM in elke put van de plaat. Kweek de cellen een nacht lang. De volgende dag, gebruik binnen een bioveiligheidskast, 0,1 milliliter transfectiemedium om 0,6 microgram van een tdTomato-getagd wild type of motorloos KIF5B-expressieplasmide met of zonder een plasmide dat een kandidaat-cargo-eiwit tot expressie brengt, te verdunnen.

In een andere microcentrifugebuis van 1,6 milliliter, voeg 1,8 microliter van het transfectiereagens toe aan 0,1 milliliter transfectiemedium. Bewaar vervolgens vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 0,1 milliliter van het verdunde transfectiereagens toe aan de verdunde DNA-monsters.

Keer de buizen om om de inhoud te mengen en centrifugeer vijf seconden. Bewaar vervolgens de monsters gedurende 45 minuten op kamertemperatuur. Tijdens de incubatieperiode voor de vorming van het transfectiecomplex, gebruik PBS om de cellen drie keer te wassen.

Voeg vervolgens 0,8 milliliter voorverwarmd transfectiemedium toe aan elke put en plaats de platen terug in de incubator. Nadat het verdunde transfectiereagens gedurende 45 minuten is bewaard, voeg 0,2 milliliter van de oplossing druppelsgewijs toe aan elke put van de plaat. Wieg de zes-puttenplaat voorzichtig vijf seconden en plaats deze terug in de 37 graden Celsius incubator gedurende zes tot acht uur.

Gebruik vervolgens compleet DMEM om het medium te vervangen. Om levende celbeeldvorming uit te voeren na een extra incubatie van 16 uur, voeg de DNA-intercaleringskleuring Hoechst 33342 toe aan het medium tot een eindconcentratie van 1 micromolar en bewaar de cellen gedurende 10 minuten op 37 graden Celsius. Gebruik vervolgens, met behulp van een 40X objectief, de cellen om de expressie van fluorescente eiwitten te onderzoeken.

Om indirecte immunofluorescentie uit te voeren op cellen die zijn behandeld met transfectiereagens:Na het voorbereiden van paraformaldehyde volgens het tekstprotocol, gebruik PBS op kamertemperatuur om de cellen te wassen door de zes-puttenplaat vijf seconden te schudden. Voeg één milliliter vers bereid 4% paraformaldehyde en PBS per put toe en bewaar gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Was vervolgens de cellen eenmaal met PBS door de plaat te schudden en gooi de oplossing weg.

Voeg vervolgens één milliliter van 0,1% Triton-X 100 in PBS toe aan elke put en bewaar gedurende 30 minuten op kamertemperatuur om de cellen te permeabiliseren. Was vervolgens de cellen vier keer met PBS, gooi de oplossing weg na elke wasbeurt. Voeg primaire antilichamen toe en bewaar de cellen gedurende vier uur op kamertemperatuur met schudden.

Na de incubatie, was de cellen vier keer met PBS door de plaat te schudden. Voeg vervolgens één milliliter van fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam toe en bewaar in het donker op kamertemperatuur met schudden gedurende twee uur. Was de cellen vervolgens vier keer met PBS en voeg één milliliter DAPI toe en bewaar in het donker op kamertemperatuur gedurende tien minuten.

Als u dekglazen met de monsters gebruikt, breng 10 microliter montageoplossing aan op het centrum van de microscoopplaat en monteer een dekglaasje boven de montageoplossing. Bewaar vervolgens in het donker op kamertemperatuur gedurende een nacht. Gebruik de volgende dag nagellak om de randen af te dichten en bewaar in het donker in een afzuigkap gedurende een nacht.

Gebruik voor fluorescentiemicroscopie een 40X objectief met de filtersets voor DAPI, CFP, FITC en Cy3, indien van toepassing. Zoals hier aangetoond, leek exogenelijk tot expressie gebrachte wildtype KIFB homogeen in het cytoplasma, terwijl c-MYC voornamelijk in de kern verscheen. De motorloze KIF5B-mutant vormde echter aggregaten in het cytoplasma en dit leidde tot de aggregatie van c-MYC.

Bovendien induceerde de motorloze KIF5B ook de aggregatie van de endogene c-MYC en de transcriptiefactor p53, wat aangeeft dat c-MYC en p53 beide de lading zijn van Kinesin-1 en dat KIF5B de subcellulaire lokalisatie van beide endogene eiwitten reguleert. Deze figuur illustreert dat de beweging van transcriptiefactoren door KIF5B specifiek lijkt te zijn, omdat de expressie van de motorloze KIF5B-mutant de subcellulaire lokalisatie van c-Fos niet beïnvloedde of ervoor zorgde dat deze aggregeerde. Deze gegevens onthullen dat de methode die in deze video wordt gedemonstreerd, de hoge specificiteit van de identificatie van Kinesin-1-cargo's mogelijk maakt.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de kinesins het meest geschikt zijn voor cellen met veel cytoplasma, zodat aggregatie in het cytoplasma gemakkelijk kan worden waargenomen. Na deze ontwikkeling heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van moleculaire motoren om soortgelijke dominante negatieve mutanten van andere kinesins en myosines te construeren om hun specifieke ladingen te identificeren. Na het bekijken van deze video,