Name: Selectieve Cell Eliminatie van Gemengde 3D Cultuur Met behulp van een Near Infrared Photoimmunotherapy Techniek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Leer hoe u specifieke cellen elimineert uit gemengde 3D-culturen met behulp van near-infrared photoimmunotherapie. Deze methode minimaliseert schade aan omliggende cellen en biedt toepassingen in weefselengineering en regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Research Program van de National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

Opmerking: Het volgende protocol beschrijft de nodige stappen om specifieke cellen met behulp van NIR-PIT elimineren. Controles en andere details over NIR-PIT en de levensvatbaarheid van de cellen kunnen elders 18 worden gevonden. 1. Conjugatie van IR700 om monoklonale antilichamen (mAb) <ol><li> Bereid mAb plaats bij 2-5 mg / ml in 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,6) oplossing. </li><li> Meng 6,8 nmol mAb met 30,8 nmol van 10 mM IR700 in 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,6) in een microcentrifugebuis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, afgedekt met aluminiumfolie. </li><li> Was de PD-10-kolom (zie tabel of Materials / Equipment) met 15 ml PBS, twee keer. Laad het monster van stap 1.2. </li><li> Zuiver het mengsel via de kolom PD-10 door elutie PBS volgens de instructies van de fabrikant. Opmerking: Hier, de elutie was langs de band kleur van IR700. Voor een 300 pi monster PBS elutiefractie ligt typisch tussen 2,5 ml tot 4,4 ml. </li><li> Bepaleneiwitconcentratie met Coomassie kleuring door meting van de absorptie bij 595 nm met een spectrofotometer 9. Het gehalte aan IR700 met absorptie bij 689 nm tot het aantal moleculen geconjugeerd fluorofoor elk mAb molecule 9 bevestigen. Opmerking: Het is belangrijk om een ​​optimale conjugatie aantal IR700 moleculen bepalen 1 mAb met een spectrofotometer. In het algemeen ongeveer 3 IR700 moleculen in 1 mAb molecule is optimaal voor zowel in vitro als in vivo werken. HPLC en SDS-PAGE werkwijzen kunnen worden gebruikt om te bevestigen of de mAb en IR700 of niet gebonden. </li><li> Bewaren bij 4 ° C na het bepalen van de eiwitconcentratie. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Gemengde 3D Cell Culture (Mixed Sferoïde) <ol><li> Breng een steriel water (ongeveer 1 ml) in de plaat reservoir deel van de opknoping druppel platen. </li><li> Bereid verschillende verhoudingen van de celtypen plaats - A431-luc-GFP-cellen en 3T3-cellen RFP -met elk monster dat 5.000 cellen in totaal, gesuspendeerd in 50 ul van cultuur media. Noot: Bereid 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, enz verhouding van celtypen van interesse in kweekmedia afhankelijk van het celtype. </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 5-7 dagen in de 96 putjes opknoping valplaat in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% kooldioxide. Verander het kweekmedium om de 2 dagen. Opmerking: Om de 3D-spheroïde precies, omgaan met de plaat voorzichtig, als druppels bevattende cellen gemakkelijk vallen voor de vorming van 3D-vormen. </li><li> Neem de morfologie en de grootte van de sferoïden met een omgekeerde helderveld microscoop bij 10X - 40X vergroting. Noot: Hoewel het afhankelijk celtypen en de grootte van hangende-druppel voor dat de diameter van de bolvormige ongeveer 400-600 urn na 7 dagen incubatie in de 96 putjes opknoping valplaat. </li></ol> 3. In Vitro NIR-PIT voor Gemengde 3D ​​Cell Culture <ol><li> Wijzig de media van de hanging druppel platen 10 ug / ml antilichaam-conjugaat photoabsorber (APC) bevattende media en incubeer gedurende 6 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% kooldioxide. </li><li> Na 6 uur incubatie, was de bolvormige tweemaal met vers kweekmedium (fenolrood gratis). Voorzichtig de sferoïde te dragen aan een glazen bodem 50 mm schotel met 100 pl vers fenolrood vrije cultuur media met behulp van een steriele 200 ul pipet met de tip afgesneden. Plaats een sferoïde in elk gerecht. </li><li> Observeer de sferoïde met een omgekeerde helderveld microscoop om de verandering van de morfologie detecteren. Om de optische reporters (bijvoorbeeld GFP en RFP) te observeren gebruiken fluorescentiemicroscoop met de volgende filter instellingen: GFP - 469 nm excitatie filter, en 525 nm emissie filter; RFP - 559 nm excitatie filter, en 630 nm emissie filter. </li><li> Plaats de light-emitting diode (LED) boven de glazen bodem schotel voor bestraling. Noot: sferoïden kunnen worden blootgesteld aan NIRlicht hetzij op de microscoop of de laminaire kap. <ol><li> Meet de vermogensdichtheid van de NIR-licht met een optische vermogensmeter 9. Volgens deze meting bestralen NIR-licht via light-emitting diodes (LED&#39;s) die licht uitzenden bij golflengten van 670-710 nm bij 2 J / cm2. Let op: LED-licht kan een maximale diepte van ongeveer 5 inch dringen. Cytotoxische effecten van NIR-PIT alleen afhankelijk is gegeven energie ongeacht vermogensdichtheid en de blootstellingsduur 23. </li></ol></li><li> Na bestraling overdracht van de sferoïde in een hangende druppel nieuwe plaat met 50 ul van vers kweekmedium en incubeer gedurende 1 dag in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% kooldioxide. </li><li> Voorzichtig de sferoïde te dragen aan een glazen bodem schaal met 100 pl vers kweekmedium (fenolrood gratis) met behulp van een steriele 200 ul pipet met de tip afgesneden. Let op de sferoïde met een fluorescentiemicroscoop 1 dag na de NIR-PIT met behulp van filter instellingen beschreven in stap 3.3. <ol><li> Detecteren dode cellen door toevoeging van propidiumjodide aan de media tot een eindconcentratie van 2 ug / ml, of door het verlies van cytoplasmatische GFP-fluorescentie met behulp van een fluorescentiemicroscoop (figuur 2B) 14,18,22. </li></ol></li><li> Herhaal stappen 3.1-3.6 als doelcellen niet volledig geëlimineerd. </li></ol>

<ol><li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).</li>
<li>Birchall, M. A., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%27s+green+shoots+of+disruptive+innovation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering's green shoots of disruptive innovation.</a> Lancet. 6736 (14), 11-12 (2014).</li>
<li>Ben-David, U., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumorigenicity+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (4), 268-277 (2011).</li>
<li>Hanna, J. H., Saha, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+and+cellular+reprogramming%3A+facts%2C+hypotheses%2C+unresolved+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues.</a> Cell. 143 (4), 508-525 (2010).</li>
<li>Lee, M. -O., Moon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pluripotent+stem+cell-derived+teratoma+formation+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (35), 3281-3290 (2013).</li>
<li>Miura, K., Okada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+safety+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).</li>
<li>Tang, C., Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+against+SSEA-5+glycan+on+human+pluripotent+stem+cells+enables+removal+of+teratoma-forming+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (9), 829-834 (2011).</li>
<li>Mitsunaga, M., Ogawa, M., Kosaka, N., Rosenblum, L. T., Choyke, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+-+selective+in+vivo+near+infrared+photoimmunotherapy+targeting+specific+membrane+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Cancer cell - selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules.</a> Nat. Med. 17 (12), 1685-1691 (2011).</li>
<li>Mitsunaga, M., Nakajima, T., Sano, K., Kramer-Marek, G., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+in+vivo+target-specific+cancer+cell+death+after+near+infrared+photoimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immediate in vivo target-specific cancer cell death after near infrared photoimmunotherapy.</a> BMC Cancer. 12 (1), 345(2012).</li>
<li>Nakajima, T., Sano, K., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+in+vivo+acute+necrotic+cancer+cell+death+induced+by+near+infrared+photoimmunotherapy+using+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of in vivo acute necrotic cancer cell death induced by near infrared photoimmunotherapy using fluorescence lifetime imaging.</a> Cancer Res. 72 (18), 4622-4628 (2012).</li>
<li>Sano, K., Mitsunaga, M., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cytotoxic+effects+of+photoimmunotherapy+assessed+by+18F-FDG+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Acute cytotoxic effects of photoimmunotherapy assessed by 18F-FDG PET.</a> J. Nucl. Med. 54 (5), 770-775 (2013).</li>
<li>Sato, K., Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy%3A+Comparative+effectiveness+of+two+monoclonal+antibodies+targeting+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy: Comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor.</a> Mol. Oncol. 8 (3), 620-632 (2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+for+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases.</a> Cancer Lett. 365 (1), 112-121 (2015).</li>
<li>Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+Infrared+Photoimmunotherapy+in+the+Treatment+of+Disseminated+Peritoneal+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer.</a> Mol. Cancer Ther. 14 (8), 141-150 (2014).</li>
<li>Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+of+Gastric+Cancer+Peritoneal+Carcinomatosis+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model.</a> PloS one. 9 (11), 113276(2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+Infrared+Photoimmunotherapy+in+the+Treatment+of+Pleural+Disseminated+NSCLC+Preclinical+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience.</a> Theranostics. 5 (7), 698-709 (2015).</li>
<li>Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cell+elimination+in+vitro+and+in+vivo+from+tissues+and+tumors+using+antibodies+conjugated+with+a+near+infrared+phthalocyanine%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine.</a> RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).</li>
<li>Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+Targeting+Prostate-Specific+Membrane+Antigen%3A+Are+Antibody+Fragments+as+Effective+as+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies.</a> J. Nucl. Med. 56 (1), 140-144 (2014).</li>
<li>Nakajima, T., Sano, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+efficacy+of+Photoimmunotherapy+%28PIT%29+using+a+cocktail+of+antibody+conjugates+in+a+multiple+antigen+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Improving the efficacy of Photoimmunotherapy (PIT) using a cocktail of antibody conjugates in a multiple antigen tumor model.</a> Theranostics. 3 (6), 357-365 (2013).</li>
<li>Shirasu, N., Yamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+antitumor+effect+of+CEA-targeted+photoimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Potent and specific antitumor effect of CEA-targeted photoimmunotherapy.</a> Int J Cancer. 135 (11), 1-14 (2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+prevents+lung+cancer+metastases+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model.</a> Oncotarget. 6 (23), 19747-19758 (2015).</li>
<li>Nakajima, T., Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+conjugate+and+light+dose+on+photo-immunotherapy+induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity.</a> BMC cancer. 14 (1), 389(2014).</li>
<li>Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derive+and+conquer%3A+sourcing+and+differentiating+stem+cells+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7 (2), 131-142 (2008).</li>
<li>Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+cell+and+cytokine+targets+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 10 (2), 77-88 (2014).</li>
<li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We tonen een methode om specifieke cel eliminatie uit een gemengde 3D celkweek zonder schade aan non-target cellen door het gebruik van NIR-PIT. Tot nu toe is er geen praktische methode cel elimineren wanneer het weefsel wordt gevestigd of na transplantatie. Aldus NIR-PIT is een veelbelovende methode om dit te bereiken. Deze techniek kan ook worden gebruikt in vivo 18,22, omdat APC&#39;s vertonen gelijkaardige farmacokinetiek mAb zelf. Het type doelcel kan worden aangepast met diverse APC. V...

Elimineren van specifieke cellen zonder schade aan andere cellen is zeer moeilijk, vooral in gevestigde weefsel en er dringend behoefte aan een cel eliminatiemethode in het veld van tissue engineering. Tegenwoordig is op het gebied van regeneratieve geneeskunde, weefselculturen met embryonale stamcellen (ES), pluripotente stamcellen (PSC), of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) zijn veelbelovende materialen 1-3. Hoewel dit weefselregeneratie is veelbelovend, verontreiniging met ongewenste cellen is een grote zorg. Bovendien is er geen gevaar van tumorvorming na transplantatie 4,5. Hoewel veel studies gericht op deze kwesties specifieke cellen te elimineren, vooral in regeneratieve geneeskunde 6-8, heeft geen praktische methode ontwikkeld. Nabij-infrarood photoimmunotherapy (NIR-PIT) is een behandeling op basis van een antilichaam-photoabsorber conjugate (APC). Een APC bestaat uit een cel-specifiek monoklonaal antilichaam (mAb) en een photoabsorber, IR700. IR700 is een hydrofiel silica-ftalocyanine derivaat en heeft fototoxiciteit niet induceert op zichzelf 9. IR700 covalent geconjugeerd met het antilichaam via amide resten op de zijketen van lysine moleculen. De APC bindt doelmoleculen op de celmembraan en induceert bijna onmiddellijk celnecrose na blootstelling aan NIR licht bij 690 nm. Tijdens de blootstelling aan NIR-licht, het cellulaire membraan scheurt leidend tot celdood 9-14. NIR-PIT heeft bewezen effectief met meerdere antilichamen of antilichaamfragmenten, waaronder anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mesothelin, anti-GPC3 en anti-CEA 15 zijn - 21. Daarom kan NIR-PIT worden gebruikt tegen diverse doelmoleculen. Bovendien NIR-PIT is een goed gecontroleerde behandeling die selectieve behandeling van specifieke regio maakt door het op de NIR-light bestraling 18,22. Hier presenteren we een methode specifieke cel eliminatie middels NIR-PIT van gemengde 3D kweken.

<table><tbody><tr><td>IRDye 700DX Ester Infrared Dye</td><td>LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)</td><td>929-70011</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 column (PD-10)&nbsp;</td><td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (bradford) Plus protein assay</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)</td><td>PI-23200</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates</td><td>3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)</td><td>HDP1096-8</td><td></td></tr><tr><td>Optical power meter</td><td>Thorlabs (Newton, NJ, USA)</td><td>PM100</td><td></td></tr><tr><td>LED: L690-66-60</td><td>Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)</td><td>L690-66-60</td><td></td></tr><tr><td>Vectibix (panitumumab)</td><td>Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35&nbsp;mm glass bottom dish, dish size 35&nbsp;mm, well size 10&nbsp;mm</td><td>Cellvis (Mountain View, CA, USA)</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr></tbody></table>

selectieve cell eliminatie van gemengde 3d cultuur met behulp van een near infrared photoimmunotherapy techniek

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recente ontwikkelingen in weefselengineering bieden innovatieve oplossingen voor vele ziekten. Bijvoorbeeld, weefselengineering met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) is een nieuwe methode in de regeneratieve geneeskunde. Hoewel deze weefselregeneratie veelbelovend is, is besmetting met ongewenste cellen tijdens weefselculturen een grote zorg. Bovendien is er een veiligheidsprobleem met betrekking tot tumorigeniteit na transplantatie. Daarom is er een dringende behoefte aan het elimineren van specifieke cellen zonder andere cellen te beschadigen die beschermd moeten worden, vooral in gevestigd weefsel. Hier presenteren we een methode voor specifieke celverwijdering uit een gemengde 3D-celcultuur in vitro met nabij-infrarood foto-immunotherapie (NIR-PIT) zonder niet-doelgerichte cellen te beschadigen. Deze techniek maakt de eliminatie van specifieke cellen uit gemengde celculturen of weefsels mogelijk.

Optisch bewaken van het effect van NIR-PIT, de A431-cellijn, die EGFR tot overexpressie werd genetisch gemodificeerd om ook GFP en luciferase (A431-luc-GFP) uit te drukken. Als niet-doelwit van NIR-PIT, werd de Balb / 3T3-cellijn optisch aangepast om RFP (3T3-RFP) uit te drukken. De APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), werd gesynthetiseerd. Gemengde sferoïden, die zijn samengesteld uit verschillende verhoudingen van cellen (A431-luc-GFP en 3T3-RFP) werden vervaardigd volgens dit protocol ...

Specifieke cellen elimineren zonder andere cellen te beschadigen is uiterst moeilijk, vooral in gevestigd weefsel, maar er is een dringende behoefte aan een methode voor cel-eliminatie op het gebied van weefselengineering. Hier presenteren we een methode voor specifieke cel-eliminatie uit een gemengde 3D-celcultuur met behulp van nabij-infrarood foto-immunotherapie (NIR-PIT).

Selectieve Cell Eliminatie van Gemengde 3D Cultuur Met behulp van een Near Infrared Photoimmunotherapy Techniek

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om de eliminatie van specifieke cellen van belang uit een gemengde 3D-celcultuur aan te tonen met behulp van nabij-infrarode foto-immunotherapie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van tissue-engineering over regeneratieve geneeskunde. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden ingezet tegen een verscheidenheid aan doelmoleculen en dat de behandeling kan worden beperkt tot specifieke laesies van belang.Op deze manier kunnen de bijwerkingen worden geminimaliseerd. Voor de conjugatie van IR700 aan monoklonale antilichamen worden de betreffende antilichamen samen met IR700 in natriumfosfaat in een microcentrifugebuis gedurende één uur bij kamertemperatuur geïncubeerd, afgedekt met aluminiumfolie. Na afloop van de incubatie wordt een PD10-kolom twee keer gewassen met 15 milliliter PBS.Laad vervolgens de antilichaamoplossing op de kolom en zuiver het mengsel door PBS-elutie volgens de instructies van de fabrikant. Om het aantal fluoro-4-moleculen te bevestigen dat aan elk monoklonaal antilichaammolecuul is gekoppeld, gebruikt u een spectrofotometer om de proteïneconcentratie van het monoklonale antilichaam te bepalen. Bewaar het conjugaat vervolgens bij 4-degree Celsius.Om de gemengde 3D-celcultuur voor te bereiden, voegt u 1 milliliter steriel water toe aan het reservoirgedeelte van een 96-well hanging drop plate. Zaai vervolgens verschillende ratio's van de betreffende celtypen in het juiste celkweekmedium, met ten minste 5 000 cellen per 50 microliters medium per well, gedurende vijf tot zeven dagen in een bevochtigde incubator bij 37-degree Celsius en 5%carbon dioxide. Versjes het kweekmedium elke twee dagen en observeer dagelijks de morfologie en grootte van de sferoiden met een inverted bright-field microscoop bij een vergroting van 10 tot 40 keer.Wanneer de sferoïden een diameter van 400 tot 600 micron hebben bereikt, wordt het medium in de hanging drop plate vervangen door medium dat antilichaam-fotoabsorber-conjugaat bevat, waarna de plaat gedurende zes uur terug in de incubator wordt geplaatst. Aan het einde van de incubatie worden de sferoïden twee keer gewassen met vers cultuurmedium zonder fenolrood. Gebruik vervolgens een 200-microliter pipetpunt met een afgeknipt uiteinde om elke sferoïde afzonderlijk over te brengen naar individuele glazen bodemschalen van 50 millimeter die 100 microliter vers cultuurmedium zonder fenolrood per schaal bevatten.Gebruik de omgekeerde microscoop om veranderingen in de morfologie van de sferoïden waar te nemen. Om de sferoïden te bestralen, plaatst u een lichtemitterende diode op een hoogte van maximaal 5 inches boven de schaaltjes met glazen bodem. Gebruik een optische vermogensmeter om de emissie van een golflengte van 670 tot 710 nanometer bij 2 joules per centimeter squared te bevestigen.Breng de sferoïden na de NIR-infraroodfoto-immunotherapie voor één dag over naar een nieuwe hanging-drop-plaat met 50 µL vers kweekmedium per putje in de celkweekincubator. Breng de sferoïden vervolgens met een andere 200-µL pipetpunt met afgeknipt uiteinde voorzichtig over naar nieuwe glazen bodemschaaltjes die 100 µL fenolroodvrij kweekmedium bevatten, en beoordeel de expressie van de optische reporter onder de fluorescentiemicroscoop. Detecteer tot slot de dode cellen door propidiumjodide aan het medium toe te voegen.Of door het verlies van cytoplasmatische GFP-fluorescentie. In dit representatieve experiment werden gemengde sferoïden, bestaande uit verschillende ratio's A431-luc-GFP- en 3T3-RFP-cellen, klaargemaakt zoals zojuist gedemonstreerd. Vervolgens werd herhaalde NIR-infrarood foto-immunotherapie uitgevoerd met incubatie van panitumumab-IR700, zoals geïllustreerd.En de eliminatie van de doelcellen werd gemonitord door de fluorescentie- en luciferaseactiviteiten binnen de hanging drop-culturen te beoordelen. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in één uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat lichtenergie afneemt volgens de kwadratenwet.

selective-cell-elimination-from-mixed-3d-culture-using-near-infrared

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video demonstrates an in-situ fluorescence multispectral imaging technique to analyze different subpopulations of infiltrating T cells in tumor tissue. A renal cell carcinoma tissue cryosection is treated with antibodies to label CD8+ T cells that express specific inhibitory receptors and exhibit an immunotherapy-resistant phenotype. The labeled section is visualized using a multispectral microscope to identify the distinct CD8+ T cell subpopulations.

Multiplexed Immunofluorescence Imaging to Analyze Immunotherapy-Resistant T Cell Subpopulations

This video demonstrates a near-infrared photoimmunotherapy technique to treat lung cancer in an engineered mouse model exhibiting luciferase-expressing tumor cells. Upon injecting an antibody-photosensitizer conjugate (APC) that binds to specific antigens on the tumor cells, the mouse is exposed to near-infrared radiation, inducing photochemical changes in the APC and leading to necrotic death of the bound tumor cells. The effectiveness of the treatment is monitored by injecting luciferin, a...

A Near-Infrared Photoimmunotherapy Technique to Treat Lung Cancer in a Murine Model

This video demonstrates a technique for selectively removing specific cells from a mixed 3D cell culture through near-infrared photoimmunotherapy. In this method, targeted cells are accurately identified using an antibody conjugated with an NIR photoabsorber. Subsequent irradiation with infrared light induces cell death, effectively eliminating the targeted cells from the 3D culture.

Near-Infrared Photoimmunotherapy for Targeted Cell Elimination in Mixed 3D Cultures

Dit protocol beschrijft de aanpasbare oppervlaktefunctionalisering van het desthiobiotine, streptavidine en APTES systeem om specifieke celtypen van belang te isoleren. Daarnaast behandelt dit manuscript de toepassingen, optimalisatie en verificatie van dit proces.

Een werkwijze van gerichte Cell Isolation via Glasoppervlak functionalisering

Fotodynamische therapie (PDT) is een medische procedure waarbij de broedtijd van een exogenously toegepaste fotosensitizer (PS) gevolgd door zichtbaar licht photoactivation te induceren van apoptose. We presenteren een in vitro PDT protocol ontworpen om te simuleren van PDT die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de verschillen in PS incubatie en licht behandeling parameters.

Een benadering In Vitro Fotodynamische therapie

Nabij-infrarood foto-immuuntherapie (NIR-PIT) is een opkomende kankertherapeutische strategie die gebruik maakt van een antilichaam-fotoabsorber (IR700Dye) conjugaat en NIR-licht om kankercellen te vernietigen. Hier presenteren we een methode om het antitumoreffect van NIR-PIT te evalueren in een muismodel van pleurale gedissemineerde longkanker en maligne pleuraal mesothelioom met behulp van bioluminescentie beeldvorming.

Nabij-infrarood foto-immuuntherapie voor muismodellen van pleurale verspreiding

Het chorioallantoic membrane (CAM) van het aviaire embryo is een zeer nuttig en toepasbaar hulpmiddel voor verschillende onderzoeksgebieden. Een speciaal ex ovo model van Japanse kwartel CAM is geschikt voor fotodynamisch behandelonderzoek.

Kwartel Chorioallantoic Membrane - Een hulpmiddel voor fotodynamische diagnose en therapie

Hier beschrijven we een nieuw, eenvoudig en goedkoop apparaat om met succes in vitro fotodynamische therapie (PDT) -testen uit te voeren met behulp van tweedimensionale HeLa-celcultuur en verteporfine als een fotosensitizer.

Een in-house gebouwd en licht-emitting-diode-gebaseerd fotodynamisch therapie-apparaat voor het verbeteren van verteporfine cytotoxiciteit in een 2D-celcultuurmodel

Dit protocol presenteert een reeks experimenten die zijn aangenomen voor de evaluatie van fotoschakelbare antikankerpeptiden, die kunnen worden gebruikt bij de preklinische screening van dergelijke verbindingen. Dit omvat cytotoxiciteitsbeoordeling in 2D- en 3D-celculturen, de evaluatie van  ex vivo (modelweefsel) foto-isomerisatie-efficiëntie en in vivo werkzaamheid.

In vitro en in vivo evaluatie van fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen - potentiële kandidaat-geneesmiddelen voor fotofarmacologie van kanker

De implementatie van een goedkope, veelzijdige fotobestralingstechniek met de handmatige IBEX-methode zorgt voor een optimale beeldvorming van menselijk weefsel met aanzienlijke natuurlijke autofluorescentie. Dit protocol beschrijft hoe gemultiplexte beelden van hele dia's kunnen worden verkregen uit gearchiveerde klinische monsters met behulp van een omgekeerde microscoop, algemeen verkrijgbare reagentia en open-source software voor beelduitlijning en -verwerking.

Geoptimaliseerde workflow voor iteratief bleken breidt multiplexiteitsbeeldvorming van sterk autofluorescerende klinische monsters uit

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde in vitro. workflow voor consistente meting van natuurlijke, chimere antigeenreceptor-gemedieerde en antistofafhankelijke cytotoxiciteit van menselijke natuurlijke moordenaars met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie.

Kwantificatie van NK-cel cytotoxiciteit versterkt door chimerische antigeenreceptoren en therapeutische antilichamen met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie

Leer hoe u specifieke cellen elimineert uit gemengde 3D-culturen met behulp van near-infrared photoimmunotherapie. Deze methode minimaliseert schade aan omliggende cellen en biedt toepassingen in weefselengineering en regeneratieve geneeskunde.

Selectieve Cell Eliminatie van Gemengde 3D Cultuur Met behulp van een Near Infrared Photoimmunotherapy Techniek

Meer video's verkennen