Grootschalige Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) van gezonde en beschadigde hersenen zebravis
25 mei 2016
Grootschalige 2D elektronenmicroscopie (EM), of nanotomy, is de toepassing van EM met nanoschaalresolutie op weefselbreed niveau. Hier beschrijven we een universele methode voor nanotomy toegepast om de larvale hersenen van de zebravis te onderzoeken in gezondheid en bij niet-invasieve hersenletsels.
Het algemene doel van dit grootschalige elektronenmicroscopie- of nanotomy-experiment is om veranderingen van het macromoleculaire niveau tot het weefselniveau te definiëren, in dit geval in de degenererende hersenen van zebravissen. Nanotomy kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de levenswetenschappen. Bijvoorbeeld in neurodegeneratie en in type 1 diabetes onderzoek.
Het belangrijkste voordeel van nanotomy is dat onbevooroordeelde informatie wordt verkregen, variërend van macromoleculen, organellen, cellen tot weefsels. Dit maakt kwantificering en open-access data-sharing mogelijk via nanotomy.org. Hoewel nanotomy inzicht biedt in immuunonderhoud en microglia in de neurodegeneratieve hersenen van zebravissen, wordt het ook toegepast op andere ziektemodellen, inclusief celkweek, muizen en zelfs menselijk weefsel.
Over het algemeen worstelen wetenschappers die nieuw zijn met deze techniek omdat de hoeveelheid data overweldigend is. Dit kan duizend keer meer zijn dan verkregen met traditionele EM.Na het fixeren van zebravislarven volgens het tekstprotocol, snijdt u de larven rostrale tot de achterhersenen om de penetratie van het osmium te vergemakkelijken. Plaats de larven in 1% osmiumtetroxide, 1,5% kaliumferrocyanide, in 0,1 molair natriumcacodylaat en incubeer op ijs gedurende twee uur.
Gebruik vervolgens twee keer gedistilleerd water om de embryo's drie keer gedurende vijf minuten te spoelen. Voordat de monsters worden ingebed, moeten de monsters worden gedehydrateerd in een reeks ethanol. Om de embryo's in te bedden, verwijdert u na het overnacht incuberen in verdunde epoxyhars volgens het tekstprotocol de verdunde hars en vervangt u deze door pure hars.
Incubeer gedurende 30 minuten, vervang vervolgens de hars een tweede keer en incubeer gedurende nog eens 30 minuten. Na het verversen van de hars voor de derde keer, incubeer gedurende drie uur op kamertemperatuur. Vervolgens incubeer gedurende 15 minuten bij 58 graden Celsius.
Eindelijk, incubeer onder lage druk gedurende een uur op kamertemperatuur. Vervolgens, onder een dissectiemicroscoop, gebruik een naald of een tandenstoker om de koppen te oriënteren in commercieel verkrijgbare platte siliconen inbeddingsvormen. Polymeriseer vervolgens de epoxyhars gedurende een nacht bij 58 graden Celsius.
Wanneer het monster volledig is uitgehard, gebruik scheermesjes om overtollig hars van de stub te verwijderen. Gebruik een glazen mes of een diamant histomes op een ultramicrotoom om semidunne larvsecties voor toluidineblauw/basisch fuchsine te snijden om de juiste positionering te detecteren. Breng de semidunne secties over op microscoopglaasjes door ze op te halen met een glazen Pasteur-pipet waarvan de punt is afgesloten door hem in een vlam te smelten.
Droog op een hotplate totdat er geen water meer over is. Plaats vervolgens de monsters in 1% toluidineblauw in water en incubeer de secties op een hotplate gedurende 10 seconden om ze te kleuren. Gebruik vervolgens 05% basisch fuchsine in 1% natriumtetraboraat om de monsters nog eens 10 seconden te kleuren na het gebruik van water om de secties te spoelen.
Bekijk de monsters met een normaal lichtmicroscoop bij 10X tot 40X. Wanneer de juiste plaats of oriëntatie is bereikt, gebruik gemakkelijk herkenbare anatomische structuren, inclusief olfactorische putten, ogen of grijs-witte materie grenzen, om het hersengebied van belang te identificeren tijdens ultradun sneden en om de snedehoek aan te passen wanneer het monster is gekanteld. Ga door met het snijden van de epoxyhars blok met een diamant mes om ultradunne 70 nanometer secties te snijden.
Monteer elke sectie op een enkele sleuf L2 door 1 vorm gebarcodeerde koperen raster om acquisitie ononderbroken door rasterstaven mogelijk te maken. Een vierkante millimeter lijkt misschien klein. Het past net in de opening.
Op deze manier voorkomen we dat rasterstaven ons monster blokkeren. Realiseer dat elk artefact dat in ons monster wordt geïntroduceerd, zal worden geregistreerd in vergelijking met traditionele EM. Contrasteer de monsters met zware metalen volgens het tekstprotocol en bewaar in een rasterbox. Om het monster in de röntgenelektronenmicroscoop, of SEM, te monteren, plaatst u het raster uit de overdrachtsbox met de sectie in de meervoudige rastermonsterhouder en brengt u het over in de kamer van de SEM.
Na het uitlijnen van de detector volgens het tekstprotocol, voor-bestraal het monster door uit te zoomen zodat het te scannen gebied in het beeldvenster past. Zodra de diafragma is veranderd in 120 micrometer en het beeld is onscherp gemaakt, gebruikt u de optie voor gereduceerd gebied scannen om het te scannen gebied zo strak mogelijk te maken. Stel vervolgens de framesnelheid in om het frame in ongeveer een tot twee seconden te scannen.
Zoom vervolgens minimaal 100X in en scan een klein gebied gedurende 10 seconden. Als de helderheid in het gebied nog verandert, blijf voor-bestralen. Wanneer dit gebied de helderheid niet verandert in vergelijking met zijn omgeving, is voor-bestraling voldoende.
Terwijl in focus, selecteer het lichtste gebied of kenmerk en stel de scansnelheid zo in dat details zichtbaar zijn. Pas in de microscoopsoftware de helderheid en contrast aan door de histogram zorgvuldig te bekijken om alle pixels in het dynamische bereik te houden. Doe hetzelfde voor de donkerste gebieden en kenmerken.
Ga terug naar het heldere gebied en controleer opnieuw zodat er enige ruimte aan beide zijden van het histogram is. Voor stappen vier zes tot vier acht, moet de aanpassing van de helderheid en contrast zeer zorgvuldig worden gedaan zodat het hele gebied binnen het dynamische bereik ligt. Zoom uit zodat het te scannen gebied in het beeldvenster past en start het programma voor acquisitie van groot gebied.
Gebruik vervolgens de wizard-optie om een mozaïek in te stellen door een gebied van het scherm te selecteren. Gebruik een pixelgrootte van twee tot vijf nanometer, afhankelijk van welke details nodig zijn, en stel een verblijftijd van drie microseconden in voor scanning transmissie-elektronenmicroscopie, of STEM. Druk op optimaliseren om de microscoopinstellingen te controleren en de be
Overzicht
Dit artikel presenteert een universele methode voor grootschalige 2D elektronenmicroscopie, of nanotomie, toegepast op de larvale hersenen van de zebravis. De techniek wordt gebruikt om de gezondheid van de hersenen en de effecten van niet-invasief hersenletsel te onderzoeken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Elektronenmicroscopie
- Neurodegeneratie
Achtergrond
- Nanotomie biedt resolutie op nanoschaal voor analyse van het gehele weefsel.
- Het maakt onbevooroordeelde gegevensverwerving mogelijk, van macromoleculen tot weefsels.
- Deze methode is toepasbaar op diverse ziektemodellen, waaronder zebravis en menselijke weefsels.
- Uitdagingen omvatten het beheren van de overweldigende hoeveelheid gegenereerde gegevens.
Doel van de studie
- Om veranderingen in de hersenen van de zebravis op macromoleculair en weefselniveau te definiëren.
- Om inzicht te verkrijgen in neurodegeneratie en immuunonderhoud.
- Om open-toegang datadeling via nanotomy.org te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Fixatie en dehydratie van zebravislarven.
- Inbedding in epoxyhars en coupesnijden met een ultramicrotoom.
- Kleuring met toluidineblauw en basis fuchsin voor visualisatie.
- Scanning-elektronenmicroscopie voor gedetailleerde beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle acquisitie van beelden met een hoge resolutie van hersenstructuren van zebravissen.
- Identificatie van anatomische kenmerken die relevant zijn voor neurodegeneratie.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode op diverse biologische monsters.
Conclusies
- Nanotomie is een krachtig instrument voor het bestuderen van de structuur en functie van de hersenen.
- De techniek verdiept het begrip van neurodegeneratieve processen.
- Het biedt een kader voor toekomstig onderzoek in de neurowetenschappen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Grootschalige elektronenmicroscopie (nanotomie) maakt onbevooroordeelde, weefselbrede kwantificering van subcellulaire en moleculaire veranderingen in neurodegeneratieve modellen mogelijk, wat doelwitvalidatie ondersteunt door directe visualisatie van pathologische kenmerken over verschillende celtypen heen. Deze benadering verhoogt het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM)-gegevens te leveren die fenotypische observaties verbinden met ultrastructurele mechanismen. De toepasbaarheid van deze methode op zebravis, menselijke weefsels en ziektemodellen positioneert het als een translationele tool voor risicoreductie om mechanistische inzichten te verkrijgen bij de ontwikkeling van geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door veranderingen op macromoleculair tot weefselniveau in modellen van neurodegeneratie te visualiseren.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele doelwitvalidatie door onbevooroordeelde detectie van microglia-activatie, neuronale stress en subcellulaire pathologie.
- Strategische waarde: Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen en portfolio-triage door het kwantificeren van ultrastructurele biomarkers van ziekteprogressie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door gestandaardiseerde, reproduceerbare EM-datasets te genereren.
- Operationele waarde: Voldoet aan de behoeften voor assay-standaardisatie en kwantitatieve output via tegelgebaseerde imaging en geautomatiseerde stitching-protocollen.
- Strategische waarde: Verbetert de screening-gereedheid en het hergebruik van platforms door open-access datadeling via nanotomy.org voor cross-functionele analyse mogelijk te maken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten en de afstemming van translationele biomarkers door EM-kenmerken te correleren met lichtmicroscopische gegevens in letselmodellen.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door fagocytische microglia en organelveranderingen tijdens degeneratie in realtime vast te leggen.
- Strategische waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door celtype-specifieke reacties op neuronale ablatie te onthullen, inclusief verschuivingen in heterochromatine in ventriculaire kernen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Nanotomy integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetesten in de vroege ontdekkingsfase tot lead-identificatie en preklinische validatie, door kwantitatieve, multischaal structurele gegevens te leveren die inzicht geven in target engagement en het werkingsmechanisme.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing, pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie ondersteunt via onbevooroordeelde imaging van macromoleculaire complexen, organellen en cellulaire fenotypes bij neurodegeneratie.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid, reproduceerbaarheid en kwantitatieve outputs via gestandaardiseerde sectiering, kleuring en STEM-acquisitie met een gedefinieerde pixelgrootte en dwell time.
- Analytics: Benadrukt metingen, read-outs en statistische outputs, zoals de kwantificering van ultrastructurele kenmerken in neuronen, microglia en subcellulaire compartimenten die vergelijking tussen verschillende condities mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming door CLEM-correlatie van fluorescentie-geïmageerde regio's mogelijk te maken met daaropvolgende nanotomie voor nano-anatomische mapping.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek, toepasbaar op zebravissen, menselijke weefsels, vliegenmodellen en celculturen voor longitudinale datamining.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, validatie van targets en vermindering van mechanistische ambiguïteit door directe visualisatie van veranderingen geassocieerd met neurodegeneratie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via grid-gebaseerde sectieering, gecontroleerde STEM-parameters en geautomatiseerde mosaic stitching.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een laat stadium door het identificeren van vroege ultrastructurele biomarkers van pathologie.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantificeerbare, weefselbrede subcellulaire veranderingen in ziektemodellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in monstervoorbereiding voor elektronenmicroscopie, ultramicrotomie en STEM-bediening om artefacten te voorkomen en datakwaliteit te waarborgen.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een scanning EM met externe scangenereator, een diamanten histomes en een grootschalige EM-bestandsviewer voor HTML- of TIFF-export.
- Vereisten voor standaardisatie tussen teams voor fixatie, kleuring, snijhoek en helderheid/contrastinstelling om het dynamisch bereik over datasets te behouden.
- Overwegingen voor adaptatie tussen modelsystemen, zoals het aanpassen van de oriëntatie van de larvale kop, het monteren van grids en kleuringsprotocollen voor zebravissen, menselijk weefsel of vliegenmonsters.
- Praktische beperkingen ondersteund door bronmateriaal, waaronder uitdagingen bij databeheer vanwege datasets op terabyteschaal en de noodzaak van expertise van de operator bij pre-irradiatie en histogramaanpassing.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:10
Larvae Fixation and Embedding
2:38
Sectioning, Contrasting, and Mounting
4:28
Mounting the Sample in the Scanning Electron Microscope and Acquiring Images
6:40
Data Analysis
7:33
Results: Large Scale Scanning Transmission Electron Microscopy of Zebrafish Brain
8:48
Conclusion
