Name: Isolatie van Infiltrating leukocyten uit Mouse huid met behulp van enzymatische Digest en Gradient Scheiding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-25T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Leer de isolatie van huidinfiltrerende leukocyten uit muizenhuid met enzymatische digestie en dichtheidsgradiëntscheiding. Deze methode ondersteunt onderzoek naar huidpathologieën zoals atopische dermatitis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 naar DC), de Nationale Vulvodynia Association (award naar DC) en Macalester College dit werk ondersteund. CB kreeg een beurs van de Macalester College Beckman Leerlingen Program, gefinancierd door de Arnold en Mabel Beckman Stichting. BTF en TM worden ondersteund door JDRF 2-2011-662. Wij danken Dr. Jason Schenkel en Dr. Juliana Lewis voor technisch advies, en alle huidige en voormalige leden van de Chatterjea lab voor hun hulp en steun.

Let op: 8-12 weken oude vrouwelijke ND4 Zwitserse Webster muizen conventioneel gehuisvest met vrije toegang tot voedsel en water, werden gebruikt voor deze studies Het experimentele protocol gebruikt (B13S1) werd goedgekeurd door Macalester College IACUC.. 1. Sensibilisering en Challenge met Oxazolon <ol><li> Dag 0 <ol><li> Bereid anesthesie kamer door toevoeging van 3 ml isofluraan absorberende handdoeken geplaatst onder maas onderaan een 4 L deksel glazen pot. Voor de ND4 vrouwelijke muizen die hier gebruikt, de tijd in de kamer is 30-60 seconden totdat het onderwerp voldoende wordt verdoofd; optimaliseren verdoving administratie van de muizenstam gebruikt. </li><li> Shave terug elke verdoofde muis en flankeren met een dier tondeuse. </li></ol></li><li> Dag 1 <ol><li> Voeg een oplossing van 4-ethoxymethyleen-2-fenyl-2-oxazolin-5-on (Ox) in absolute ethanol 2% en incubeer bij 50 ° C gedurende 15 min op een roterende plaat in een incubator. </li><li> Kort verdovenmuizen, waarbij isofluraan anesthesie zoals beschreven in 1.1.1 en 100 gl 2% Ox toepassing op de geschoren rug in verschillende standaard toepassingen van ongeveer 20 pl elk. Wacht 5-10 seconden tussen seriële applicaties voor de oplossing te drogen. </li><li> Zorg om te voorkomen dat het morsen van de 2% Ox oplossing anders dan de rug regio, en wacht tot de oplossing te drogen tussen applicaties. </li></ol></li><li> Dagen 5-7 <ol><li> Voeg een oplossing van 1% (Ox) in absolute ethanol en incubeer bij 50 ° C gedurende 15 min op een roterende plaat in een incubator. </li><li> Voorzichtig maar stevig immobiliseren van de muis op het nekvel en staartbasis met buik omhoog en hals enigszins naar beneden gekanteld (vergelijkbaar met een greep voor een intraperitoneale injectie) en 100 gl 1% Ox toepassing op de geschoren flank in verschillende standaard toepassingen en de tijd om de huid daarna droog als hierboven beschreven. </li><li> Bij controlemuizen Breng 100 pi absolute ethanol voertuig op de geschoren flank. </li></ol></li></ol> 2. Flank Skin Harvest <ol><li> Euthanaseren muizen met behulp van kooldioxide inademing, en zorgvuldig accijnzen het gewenste gebied van de flank huid (~ 25 mm x 25 mm van de huid) met 10 cm chirurgische schaar. </li><li> Met behulp van een schone, scherp chirurgisch mes, schraap het overtollige vet en bindweefsel van de flank huid. </li><li> Plaats 3 stukken flank huid 3 muizen in een 50 ml conische buis met 10 ml HBSS RT [met fenolrood, zonder calcium of magnesium, 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1- piperazineethaansulfonzuur (HEPES) en 10% foetaal runderserum (FBS)]. </li></ol> 3. Pre-vergisting Tissue Wassen <ol><li> Plaats buis met huidfragmenten op een roterende plaat voor 30 minuten in een droge niet-vergaste incubator gehandhaafd bij 37 ° C. </li><li> Vortex krachtig gedurende 10 seconden aan het einde van de incubatieperiode. </li><li> Zeef de inhoud van de buis door een 70 umzeef om de wasbuffer weggooien en het verzamelen van het weefsel. Eén zeef kan gedurende de gehele procedure opnieuw worden gebruikt bij een biologische behandelgroep. </li><li> Met behulp van een pincet, overdracht van de flank huid van de zeef in een nieuwe 50 ml conische buis met 10 ml vers, RT HBSS medium (bevattende EDTA, HEPES en FBS zoals hierboven beschreven). </li><li> Met een 12,5 cm paar chirurgische schaar ontleden ondergedompeld in de buis, blad voor elk stuk huid flank zodat de gemiddelde stukje weefsel is ongeveer 2,2 mm x 2,2 mm gebied. </li><li> Plaats buis met huidfragmenten op een roterende plaat voor 30 minuten in een droge niet-vergaste incubator gehandhaafd bij 37 ° C. </li><li> Vortex krachtig gedurende 10 seconden aan het einde van de incubatie </li></ol> 4. Collagenase Spijsvertering van de Huid <ol><li> Zeef de inhoud van de buis door een 70 urn zeef, opnemen en overbrengen flank huid stukjes in een nieuwe 50 ml conische buis met 10 ml fresh, RT HBSS medium aangevuld met 0,7 mg / ml collagenase D. </li><li> Plaats buis met digestiemedium en huidfragmenten op een roterende plaat 30 minuten in een droge niet-vergaste incubator gehandhaafd bij 37 ° C. </li><li> Vortex inhoud van de buis krachtig gedurende 10 seconden aan het einde van de incubatie. </li><li> Inhoud filter van de buis door een 70 urn zeef in een nieuwe 50 ml conische buis; houdt de doorstroom met het gedigereerde weefsel en de zeef en gooi flankeren huid vuil. </li><li> Was de doorstroom in 50 ml HBSS media gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 350 g en decanteer het supernatant. </li></ol> 5. dichtheidsgradiëntcentrifugatie <ol><li> Met behulp van een serologische pipet 3 ml RT 67% dichtheidsgradiënt centrifugatie media in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een nieuwe 15 ml conische buis voor elk monster. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 5 ml 44% RT dichtheidsgradiëntcentrifugatie media in HBSS met fenolrood. </li><li> Gently laag 5 ml van de 44% dichtheidsgradiënt centrifugatie medium dat de cellen bovenop de 67% dichtheidsgradiënt centrifugatie mediavoorbeeld behulp van een serologische pipet. Zorg ervoor dat u de pipet op de laagste snelheid in te stellen, en zet de pipet langs de wand van de conische buis. Wees voorzichtig niet te schudden, verstoren, of omkeren het verloop. </li><li> Stel versnelling naar de laagste stand, los van de rem, en centrifuge de helling bij 931 xg gedurende 20 min bij RT ervoor te zorgen dat de centrifuge in balans is. </li><li> Na het centrifugeren, verwijder voorzichtig de gradiënt van de centrifuge, en voorzichtig te vervoeren naar het lab bank houden de buis rechtop. Met behulp van een 5 ml plastic transferpipet, verwijder de cellaag op het grensvlak van de 44% en 67% dichtheidsgradiënt centrifugatie media overgebracht in een nieuwe 15 ml conische buis. Als de interface niet zichtbaar is, verwijdert u ongeveer 2 ml vloeistof bij de 67% -44% grens. </li><li> Vul het conische buis met cellen van de intece met 2% FBS in 1X ijskoude PBS, centrifuge cellen gedurende 5 min bij 350 xg en decanteer het supernatant. Opmerking: Dit is de eerste keer dat de cellen kunnen worden gekoeld / bewaard koud omdat digestie stappen bij 37 ° C en dichtheidgradiëntcentrifugatie media stappen bij KT. Cellen kunnen worden gesuspendeerd in een 1: 1 trypaanblauw verdunning en telt en de levensvatbaarheid van inlichtingen zijn te verkrijgen op dit punt. </li></ol> 6. blokkeren en kleuring voor Flowcytometrische Analyse <ol><li> Blok FcyRII / III receptoren op cellen die niet-specifiek antilichaam kleuring te voorkomen. Voor de hier beschreven experimenten, maak mastermengsels antilichaam in PBS met 2% FBS met 1: 100 verdunning van het ongeconjugeerde antilichaam tegen CD16 / 32 (2.4G2) te binden en blokkeren FcyRII / III-receptoren. </li><li> Incubate geblokkeerd cellen met geschikte mastermengsels van antilichamen tegen CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14) en Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5) en Brilliant Violet 510 levende / dode vlek dode cellen te identificeren. Gebruik alle antilichamen, hetzij op de verdunning aanbevolen door de fabrikanten of eerder geoptimaliseerd door onderzoekers. Voor de hier beschreven experimenten, gebruik maken van alle antilichamen bij 1: 100 verdunning. </li><li> Was de cellen en resuspendeer in 50 pl 1X PBS kleuring buffer met 2% FBS. Houd op ijs tot fluorescentie gegevens kunnen worden verkregen op een flowcytometer. Opmerking: Het is belangrijk om schadevergoeding parameters vooraf geoptimaliseerd met een lymfoïde weefsels en een gemeenschappelijke celoppervlak antigen (zoals CD4 of CD8) vóór verkrijging van fluorescentiegegevens. </li><li> Om het aantal cellen te verhogen voor downstream flowcytometrieanalyse, data verwerven van volledige monsters van gekleurde cellen. </li></ol> 7. Analyseer Flowcytometrie gegevens met behulp van standaard methoden om de onderstaande stappen Accomplish <ol><li> Ten eerste poort op de lymfocyt regio de voorwaartse verstrooiing(gebied) by side scatter (gebied) plot. </li><li> Selecteer vervolgens enkele cellen met behulp van de voorwaartse verstrooiing (breedte) by side scatter (breedte), om te voorkomen dat het analyseren van wambuizen. Dit kan ook worden bereikt met een voorwaartse verstrooiing hoogte by side scatter hoogte plot. </li><li> Vervolgens poort aan afstamming (CD 11 b, CD 11 c en CD45R / B220) -negatieve en CD3-positieve gebeurtenissen uit te sluiten macrofagen, dendritische cellen en B-cellen, respectievelijk, en confine analyses de T-cel compartiment, als het doel is, als hier te beoordelen infiltrerende T-cellen. </li><li> Vervolgens poort op levende cellen die de live / dead vlek te sluiten. </li><li> Tot slot, poort aan de cel bevolking van belang (zie representatieve resultaten sectie). </li></ol>

<ol><li>Hay, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Global+Burden+of+Skin+Disease+in+2010%3A+An+Analysis+of+the+Prevalence+and+Impact+of+Skin+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).</li>
<li>Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+immune+events+in+the+murine+contact+hypersensitivity+model%3A+toward+the+understanding+of+allergic+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis.</a> J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).</li>
<li>Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Mouse models of psoriasis.</a> J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).</li>
<li>Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Models+of+Innate+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Mouse+Models+of+Innate+Immunity%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse Models of Innate Immunity.</a> Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).</li>
<li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+CD69+Interference+with+Sphingosine-1-Phosphate+Receptor+Function+Regulates+Peripheral+T+Cell+Retention%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immun%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention.</a> J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).</li>
<li>Schaerli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+skin-selective+homing+mechanism+for+human+immune+surveillance+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells.</a> J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).</li>
<li>Zaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+skin-resident+memory+T+cells+within+an+epidermal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).</li>
<li>Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+vitiligo+with+focused+epidermal+depigmentation+requires+IFN-%CE%93+for+autoreactive+CD8%2B+T+cell+accumulation+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin.</a> J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> J. Vis. Exp. (22), e1029(2008).</li>
<li>Nagao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+epidermal+Langerhans+cells+and+langerin-expressing+dermal+dendritic+cells+are+unrelated+and+exhibit+distinct+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).</li>
<li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267(2009).</li>
<li>Dudeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+are+key+promoters+of+contact+allergy+that+mediate+the+adjuvant+effects+of+haptens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens.</a> Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).</li>
<li>Hershko, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+Cell+Interleukin-2+Production+Contributes+to+Suppression+of+Chronic+Allergic+Dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis.</a> Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).</li>
<li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).</li>
<li>Tabatabaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells%3A+The+effect+of+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Avicenna+J+Med.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin.</a> Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).</li>
<li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).</li>
<li>Gu, D., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+population+analyses+during+skin+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell population analyses during skin carcinogenesis.</a> J. Vis. Exp. (78), e50311(2013).</li>
<li>Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Murine+Lymph+Node+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22+J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells.</a> J. Vis. Exp. (90), e51803(2014).</li>
<li>Martinov, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+hypersensitivity+to+oxazolone+provokes+vulvar+mechanical+hyperalgesia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice.</a> PloS one. 8 (10), e78673(2013).</li>
<li>Katsares, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Accurate+Method+for+the+Stem+Cell+Viability+Evaluation%3A+The+Case+of+the+Thawed+Umbilical+Cord+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Med%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood.</a> Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).</li>
<li>Thomas, M. L., Lefrançois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+the+leucocyte-common+antigen+family%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Today%22%5BJournal%5D)">Differential expression of the leucocyte-common antigen family.</a> Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).</li>
<li>Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Ly6G-specific+monoclonal+antibody+to+deplete+neutrophils+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice.</a> J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële of andere belangen te onthullen.

Het karakteriseren van veranderingen in de huid-ingezeten leukocyten in knaagdiermodellen van huidziekten, zoals atopische dermatitis of psoriasis is van belang voor het begrijpen van mechanistische verbindingen tussen inflammatoire cel instroom en de ziekte pathologie. Hier beschrijven we een voordelige techniek om leukocyten uit huidweefsel te isoleren met basisuitrusting gevonden in de meeste biomedisch onderzoek labs. Deze relatief snelle techniek vermijdt het gebruik van dure weefsel dissociatie machines en aangepa...

Huidaandoeningen, variërend van contact dermatitis, eczeem, psoriasis, cellulitis, schimmelinfecties en abcessen op non-melanoma huidkanker bleken te zijn van de 50 meest voorkomende ziekten in de wereld, en de vierde toonaangevende wereldwijde oorzaak van niet-dodelijke ziekten in 2010 1. Dienovereenkomstig, het onderzoek van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan diverse huid pathologieën is een noodzakelijke en actieve gebied van onderzoek. Knaagdiermodellen opmerkelijk bruikbaar zijn bij het ​​begrijpen van inflammatoire huidaandoeningen geweest zoals atopische dermatitis 2, psoriasis 3 of Staphylococcus aureus infectie 4. Goedkoop, efficiënt, eenvoudig en protocollen voor de enzymatische vertering van muizenhuid weefsel van cellen die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van downstreamtoepassingen beter begrip van de pathofysiologie van huidziekten verschaffen. Hier wordt een eenvoudige en economische werkwijze beschreven voor enzymatische digestie van muizenhuidweefsel en isoleren van huid-infiltrerende leukocyten die kunnen worden gebruikt voor celkweek, in vivo adoptieve overdracht, flow cytometrische analyse en sortering of gene expression studies. Het algemene doel van deze procedure is om een ​​enkele celsuspensie van huid-infiltrerende leukocyten te bereiden met een hoge levensvatbaarheid van de cel terwijl het minimaliseren van de kosten doorgaans geassocieerd met aangepaste reagens kits en mechanische dissociators. Bestaande huidweefsel dissociatie methoden 5-7 kan resulteren in lage levensvatbaarheid en oppervlakte celmerker integriteit, of eisen aangepaste enzym kits en dure weefsel dissociatie machines 8-11. Terwijl de vertering van muizenoor huidweefsel redelijk gangbaar 12-13, verteren sterk verhoornde huidweefsel (bijvoorbeeld van de flank) kan resulteren in celpreparaten verontreinigd met grote hoeveelheden niet-cellulair afval. In een recente studie, Zaid en collega verteerd muis flank huid gedurende 90 min in 2,5 mg / ml dispase, followed door 45 min bij 3 mg / ml collagenase 7. In een andere studie, deze onderzoekers gebruikte meervoudige incubaties met een gecombineerde digestie van 2,5 uur, inclusief het gebruik van trypsine / EDTA, collagenase III en dispase 5. Het gebruik van trypsine wordt niet aanbevolen voor de huid enzymatische digestie, zoals behandeling met trypsine van verschillende fabrikanten heeft aangetoond dat meetbaar invloed op de integriteit van celoppervlakeiwitten op zoogdiercellen 14-15. Bovendien kan dispase aanzienlijk proliferatieve vermogen van CD4 en CD8a T cellen en beïnvloeden oppervlakte overvloed van ten minste 20 moleculen met gemeenschappelijke T cel activatie merkers zoals CD62L 16. Andere protocollen RPMI 1640 in digestiemedium 6. Echter, de aanwezigheid van Mg2 + en Ca2 + in RPMI uitgebreide celaggregatie 17 veroorzaken. Een ideale protocol voor het weefsel dissociatie moeten streven naar een hoge levensvatbaarheid van de cellen, laagniveaus van cel- aggregatie en minimale schade aan oppervlakte-eiwitten cel. Hoge kwaliteit lymfeklier stromale cel voorbereidingen zijn bereikt met protocollen die kortere enzymincubaties, Ca 2+ en Mg 2+ vrije media te gebruiken, en trypsine te vermijden en Dispase 18. Echter protocollen van dit type niet vastgesteld voor de dissociatie van hele muizenhuid. Hier wordt een protocol beschreven te distantiëren, te isoleren en te verrijken huid-infiltrerende leukocyten uit-allergeen uitgedaagd muis flank huid. In het kort uitgesneden huid gepreïncubeerd in Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) met 10% foetaal runderserum gedurende 1 uur aan het weefsel voor de spijsvertering te verzachten en verwijderen van overtollige dode huid en vetweefsel. Dit wordt gevolgd door een 30 min enzymatische digestie stap met 0,7 mg / ml collagenase D. collagenase D heeft minimale effecten op de dichtheid van celoppervlak markers, en geen effect op T-celproliferatie in vitro 16,18, waardoor hetzeer geschikt voor toepassingen in de karakterisering van oppervlakte-eiwitten. Na enzymatische digestie, werd discontinue dichtheidsgradiënt centrifugatie gebruikt epitheelcellen en vuil van de eencellige suspensie te verwijderen en te verrijken voor hematopoïetische cellen. Belangrijk is dat deze procedure vermijdt dure kolommen gebaseerde magnetische celscheiding reagentia en weefsels dissociatie machines 11/08, en kan worden uitgevoerd met apparatuur en materialen die in een fundamenteel biomedisch onderzoekslaboratorium. Hier werd dit protocol dat wordt gebruikt om leukocyten te isoleren van de flank huid uitgedaagd drie keer met het hapteen oxazolon (Ox) in eerder gevoelig ND4 Zwitserse muizen (aangepast van 19). Cellen werden geanalyseerd met behulp van multi-parametrische flowcytometrie. Deze techniek leverde een celsuspensie met minimale puin en&gt; 95% levensvatbaarheid van de geïsoleerde lymfocyten die werden geanalyseerd door multi-parametrische flowcytometrie om de infiltratie van T-lymfocyten en neutrofielen te meten in de getroffen skin.

<table><tbody><tr><td>HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55021C</td><td>Bewaar steriel tot de dag van gebruik.</td></tr><tr><td>HEPES, &ge;99.5% (titratiewaarde)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium zout oplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td>Bewaar steriel tot de dag van gebruik.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select</td><td>MidSci</td><td>S01520HI</td><td>Bewaar steriel tot de dag van gebruik.</td></tr><tr><td>Percoll, pH 8,5-9,5 (25&deg;C)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Bewaar steriel. Percoll moet isotoniek worden gemaakt met steriele 10X PBS voor gebruik.</td></tr><tr><td>Trimmer Combo Kit</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201&nbsp;</td><td>Gebruik de grotere trimmer voor het scheren van de flank en rug.</td></tr><tr><td>4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E0753-10G</td><td>Los op in 100% EtOH bij 50&deg;C gedurende 15 minuten op een roterende plaat.</td></tr><tr><td>Gevlochten anti-muis CD16/CD32 (2.4G2)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td>Antilichaam gebruikt om niet-specifieke antilichaambinding te blokkeren tijdens antilichaamkleuring voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD3&epsilon;-BV650 (145-2C11)</td><td>Becton Dickinson</td><td>564378</td><td>Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)</td><td>eBioscience</td><td>47-0042-80</td><td>Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD8&alpha;-BV785 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100749</td><td>Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-80</td><td>Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD11c-eFluor450 (N418)</td><td>eBioscience</td><td>48-0114-80</td><td>Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD44-BV711 (IM7)</td><td>Becton Dickinson</td><td>563971</td><td>Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC (30-F11)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0451-U025</td><td>Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>48-0452-80</td><td>Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)</td><td>BioLegend</td><td>104431</td><td>Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108407</td><td>Antilichaam gebruikt om cellen te kleuren voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>Ghost Dye-BV510</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870-T100</td><td>Viabiliteitskleuring voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A</td><td>Celanalyzer (18 parameters)</td></tr><tr><td>Collagenase D van Clostridium histolyticum</td><td>Roche Applied Science</td><td>11088858001</td><td>Gebruik een lyofilisaat van het enzym in HBSS met phenol red, zonder calcium en zonder magnesium, opgelost tot 5 mg/ml, in porties van 1 ml.&nbsp; Bewaar onmiddellijk bij -20&deg;C gedurende maximaal zes maanden.</td></tr><tr><td>ND4 Zwitserse vrouwelijke muizen</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>8-12 weken oud; conventioneel gehuisvest met vrije toegang tot voedsel en water en gebruikt volgens de IACUC-richtlijnen van Macalester College.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolatie van infiltrating leukocyten uit mouse huid met behulp van enzymatische digest en gradient scheiding

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Het dissociëren van muishuid in een enkele celsuspensie is essentieel voor downstream cellulaire analyse, zoals de karakterisering van infiltrerende immuuncellen in knaagdiermodellen van huidontsteking. Hier beschrijven we een protocol voor de vertering van muishuid in een voedingsrijke oplossing met collagenase D, gevolgd door scheiding van hematopoëtische cellen met behulp van een discontinue dichtheidsgradiënt. Cellen die aldus worden verkregen, kunnen worden gebruikt voor in vitro studies, in vivo overdracht en andere downstream cellulaire en moleculaire analyses, inclusief flowcytometrie. Dit protocol is een effectieve en economische alternatief voor dure mechanische dissociators, gespecialiseerde scheidingskolommen en scherpere trypsine- en dispase-gebaseerde verteringsmethoden, die de celviabiliteit of dichtheid van oppervlakte-eiwitten die relevant zijn voor fenotypische karakterisering of cellulaire functie kunnen aantasten. Zoals hier in onze representatieve gegevens wordt getoond, produceerde dit protocol zeer levensvatbare cellen, bevatte specifieke immuuncelpopulaties en had geen effect op de integriteit van veelgebruikte oppervlaktemarker-eiwitten die in flowcytometrische analyse worden gebruikt.

Collagenase D behandelde miltcellen vertonen gelijkaardige niveaus van CD4 en CD8 α op T-cellen in vergelijking met media-behandelde controles Ten eerste, de mogelijke gevolgen van collagenase D van de frequentie en oppervlakte overvloed aan afstamming en activatie merkers op T-cel subsets werden beoordeeld met behulp van secundaire lymfoïde weefsel als controle. Een suspensie van splenocyten verkregen uit ND4 muizen en gewassen 1...

Dit protocol beschrijft enzymatische vertering van muizenhuid in voedingsrijk medium, gevolgd door gradiëntscheiding om leukocyten te isoleren. De zo verkregen cellen kunnen voor verschillende downstream-toepassingen worden gebruikt. Dit is een effectieve, economische en verbeterde alternatief voor weefseldissociatiemachines en agressievere trypsine- en dispase-gebaseerde weefselverteringsprotocollen.

Isolatie van Infiltrating leukocyten uit Mouse huid met behulp van enzymatische Digest en Gradient Scheiding

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van huid-infiltrerende leukocyten met behulp van enzymatische spijsvertering en dichtheidsgradiëntscheiding. Deze methode kan worden toegepast op het onderzoek van cellulaire en moleculaire mechanismen in veel muismodellen van huidaandoeningen, inclusief atopische dermatitis. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de biologie van huid-infiltrerende leukocyten, kan het ook worden toegepast op het onderzoek van andere residente celpopulaties.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen met het oogsten van huid, wat een volledige verwijdering van overtollig vetweefsel en bindweefsel omvat. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien huidoogst en het hanteren van dichtheidsgradiënten moeilijk te leren zijn en precisie en oefening vereisen. Gebruik op het juiste tijdstip na de behandeling 10 centimeter chirurgische schaar om voorzichtig een gebied van 25 bij 25 millimeter van de geschoren flankhuid van een volwassen acht tot twaalf weken oude vrouwelijke ND4 Swiss-Webster muis te excideren.Gebruik een schone, scherpe chirurgische kling om het overtollige vet en bindweefsel van de huid te schrappen, en breng de huid vervolgens over in een 50 milliliter conische buis met 10 milliliter HBSS op kamertemperatuur, aangevuld met EDTA, HEPES en FBS, en predigesteer het weefsel gedurende 30 minuten op een draaiende plaat in een droge, niet-beluchte, 37 graden Celsius incubator. Aan het einde van de incubatie, vortex de buis krachtig gedurende tien seconden en filter de weefselslurry door een 70 micron zeef. Gebruik vervolgens een paar pincetten om de flankhuidstukken van de zeef over te brengen naar een nieuwe 50 milliliter buis met tien milliliter vers, kamertemperatuur HBSS-medium, aangevuld met EDTA, HEPES en FBS, en gebruik vervolgens een 12,5 centimeter paar chirurgische dissectiescharen om elk stukje flankhuid te hakken zodat het gemiddelde stukje weefsel ongeveer 2,2 bij 2,2 millimeter groot is.Wanneer alle stukken zijn gehakt, breng de buis terug naar de draaiende plaat voor een verdere incubatie van 30 minuten. Vortex de buis krachtig gedurende 10 seconden aan het einde van de incubatie en filter de inhoud door de 70 micron zeef. Verzamel de resterende flankhuidstukken in een nieuwe 50 milliliter buis met 10 milliliter HBSS aangevuld met 0,7 milligram per milliliter Collagenase D, en breng de buis terug naar de draaiende plaat voor nog eens 30 minuten incubatie.Na nog eens 10 seconden van vortexen, filter de inhoud van de buis opnieuw, gooi dit keer het puin op de zeef weg, vul de buis vervolgens met maximaal 50 milliliter HBSS, EDTA, HEPES, FBS, centrifugeer de cellen en decant het supernatant. Voeg drie milliliter kamertemperatuur, 67 procent dichtheidsgradiënt centrifugatiemedium in PBS toe aan een nieuwe 15 milliliter conische buis en suspendeer het cellenpellet in vijf milliliter kamertemperatuur 44 procent dichtheidsgradiënt centrifugatiemedium in HBSS met fenolrood. Stel de pipettor op de laagste snelheid in, plaats de pipet aan de zijkant van de buis en laag de cellen voorzichtig op het 67 procent dichtheidsgradiënt centrifugatiemedium.Wanneer u met dichtheidsgradiënten werkt, zorg ervoor dat u geen luchtbellen maakt en minimaliseer eventuele verstoringen van het gradiëntoppervlak. Scheid vervolgens de cellen, gebruik een vijf milliliter transferpipet om de cellen aan het oppervlak aan het einde van de centrifugatie te verzamelen. Aangezien het voorzichtig lagen van het gradiënt en het zorgvuldig verwijderen van het oppervlak van de gradiënten cruciale stappen zijn, is het verstandig om de dichtheidsgradiënt centrifugatiemedium lagen en oppervlakverwijdering te oefenen met de suspensie van muiselijke splenocyten voordat u de procedure probeert met de experimentele cellen van belang.Ten slotte, was de verzamelde cellen in ijskoud PBS aangevuld met FBS in een 15 milliliter conische buis en tel het aantal levensvatbare cellen door trypanblauwe uitsluiting. CD4 en CD8-alpha oppervlakte-expressie worden niet beïnvloed door Collagenase D-digestie, aangezien hetzelfde aantal CD4 positieve en CD8-alpha positieve cellen wordt gedetecteerd met of zonder enzymatische vertering. Verder vertoont Collagenase D-digestie geen effect op de oppervlaktedichtheid van de T-cel activeringsmarkers CD44 en CD62L op CD4 positieve T-cellen.Na gradiëntscheiding worden ongeveer 250 levensvatbare immuuncellen per vierkante millimeter flankweefsel geïsoleerd uit Oxazolon of Ox-uitgedaagde muizen, versus slechts vier levensvatbare immuuncellen per vierkante millimeter weefsel in voertuig-uitgedaagde muizen, eerder gesensibiliseerd met Ox. 95 procent van de lage voorwaartse en zijwaartse verstrooiing van enkele cellen in Ox-uitgedaagde muizen, en 71 procent van deze cellen in voertuig-uitgedaagde controles zijn levende CD45 positieve cellen, wat overeenkomt met een ongeveer 67-voudige toename van de infiltrerende CD45 positieve immuuncelpopulatie in de flankhuid na drie dagelijkse Ox-uitdagingen. Inderdaad, Ox-uitdaging resulteert in de uitgesproken infiltratie van T-cellen en neutrofielen in de flankhuid, met 42 procent van de enkele, levende CD45 positieve cellen in Ox-behandelde dieren, zichtbare Gr-1 positieve neutrofielen, en ongeveer 84 procent CD3 positieve T-cellen die CD8-alpha of CD4 tot expressie brengen, vergeleken met controle, ethanol-behandelde dieren. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer drie uur worden voltooid als deze goed wordt uitgevoerd.Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om voorzichtig met het dichtheidsgradiënt om te gaan. Vergeet niet om altijd dichtheidsgradiënt centrifugatiemedium op kamertemperatuur te gebruiken bij het uitvoeren van deze procedure. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals flowcytometrische analyse, celsortering, celtransfer of in vitro celcultuur worden uitgevoerd om het fenotype en de functie van de huid-infiltrerende leukocyten te evalueren.Na het bekijken van deze video, zou u

isolation-infiltrating-leukocytes-from-mouse-skin-using-enzymatic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een snelle methode om te infiltreren leukocyten te verkrijgen van de muis hersenen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van een continue en discontinue gradiënt Percoll Ficoll gradiënt te selecteren en te zuiveren van de leukocyten-verrijkte laag. Geïsoleerde leukocyten kan dan worden gekenmerkt door flowcytometrische metingen.

Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten

Een efficiënte manier om lymfocyten uit muizen genitaal isoleren beschreven. Deze methode maakt gebruik van enzymdigestie en Percoll gradiëntscheiding om efficiënte isolatie. Deze techniek is ook aangepast aan gebruik in andere...

Isolatie van Lymfocyten van Mouse geslachtsorganen Mucosa

In this video, we demonstrate the isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colonic tissue by enzymatic digestion using collagenase E and silica-based density separation media gradient separation. The isolated mononuclear cells can be used for subsequent downstream analysis.

Lamina Propria Mononuclear Cell Isolation: A Silica-based Density Gradient Centrifugation Technique to Obtain Mononuclear Cells from Murine Colon

We beschrijven een protocol om efficiënt huidresidente T-cellen te isoleren uit humane huidbiopsieën. Dit protocol levert voldoende aantallen vitale humane huidresidente lymfocyten op voor flowcytometrische analyse en ex vivo kweek.

Lymfocyt Isolatie van Human Skin voor Fenotypische Analyse en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

De huid is de thuisbasis van een complex netwerk van immuuncellen. We beschrijven een efficiënte methodologie voor het verteren van muizenhuid, uit verschillende delen van het lichaam van het dier, om een enkele celsuspensie te verkrijgen en de verschillende leukocytenpopulaties die in de huid aanwezig zijn te analyseren door middel van flowcytometrie.

Voorbereiding van de Single-cell Charms voor Cytofluorimetric Analyse van verschillende Mouse Skin Regio

We beschrijven hier een protocol voor het isoleren van myeloïde cellen uit muizenhuid en drainerende lymfknoop na intradermale injectie van Plasmodium sporozoïeten. Stroomcytometrie van de verzamelde cellen biedt een betrouwbare test om de ontstekingsreactie in de huid en de drainerende lymfknoop op de parasiet te karakteriseren.

Myeloïde Cell Isolatie van Mouse Skin en aftappen lymfkliertest Na Intradermal Immunisatie met levende verzwakte<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoieten

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

Dit protocol beschrijft hoe de huid keratinocyten van Muismodellen te isoleren, te vlekken met metaal-gelabelde antilichamen, en om bevlekte cellen te analyseren door massa cytometrie om het patroon van de expressie van eiwitten van belang in de verschillende celcyclus fasen profiel.

Isolatie en kleuring van de muis huid keratinocyten voor celcyclus specifieke analyse van cellulaire eiwit expressie door massa Cytometrie

Het doel van dit protocol is het isoleren van mononucleaire cellen die zich in de lamina propria van de dikke darm bevinden door enzymatische vertering van het weefsel met collagenase. Dit protocol maakt een efficiënte isolatie van mononucleaire cellen mogelijk, wat resulteert in een enkelvoudige celsuspensie die op zijn beurt kan worden gebruikt voor robuuste immunophenotypering.

Isolatie van lamina propria mononucleaire cellen van Murine Colon met behulp van Collagenase E

Dit artikel beschrijft een methode voor magnetische isolatie op basis van kralen van endotheelcellen van muizen uit dermale lymfatische capillairen. De geïsoleerde lymfatische endotheelcellen kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse in-vitro-experimenten en eiwitexpressie-analyse.

Isolatie van dermale lymfatische endotheelcellen bij muizen

Dit protocol beschrijft de isolatie van levende immuun- en niet-immuunpopulaties uit de muizenlong in een stabiele toestand en na griepinfectie. Het biedt ook poortstrategieën voor het identificeren van subsets van epitheelcellen en myeloïde cellen.

Isolatie van levende myeloïde en epitheelcelpopulaties uit de muizenlong

Leer de isolatie van huidinfiltrerende leukocyten uit muizenhuid met enzymatische digestie en dichtheidsgradiëntscheiding. Deze methode ondersteunt onderzoek naar huidpathologieën zoals atopische dermatitis.

Isolatie van Infiltrating leukocyten uit Mouse huid met behulp van enzymatische Digest en Gradient Scheiding

Meer video's verkennen