Isolatie van Infiltrating leukocyten uit Mouse huid met behulp van enzymatische Digest en Gradient Scheiding
25 januari 2016
Dit protocol beschrijft enzymatische vertering van muizenhuid in voedingsrijk medium, gevolgd door gradiëntscheiding om leukocyten te isoleren. De zo verkregen cellen kunnen voor verschillende downstream-toepassingen worden gebruikt. Dit is een effectieve, economische en verbeterde alternatief voor weefseldissociatiemachines en agressievere trypsine- en dispase-gebaseerde weefselverteringsprotocollen.
Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van huid-infiltrerende leukocyten met behulp van enzymatische spijsvertering en dichtheidsgradiëntscheiding. Deze methode kan worden toegepast op het onderzoek van cellulaire en moleculaire mechanismen in veel muismodellen van huidaandoeningen, inclusief atopische dermatitis. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de biologie van huid-infiltrerende leukocyten, kan het ook worden toegepast op het onderzoek van andere residente celpopulaties.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen met het oogsten van huid, wat een volledige verwijdering van overtollig vetweefsel en bindweefsel omvat. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien huidoogst en het hanteren van dichtheidsgradiënten moeilijk te leren zijn en precisie en oefening vereisen. Gebruik op het juiste tijdstip na de behandeling 10 centimeter chirurgische schaar om voorzichtig een gebied van 25 bij 25 millimeter van de geschoren flankhuid van een volwassen acht tot twaalf weken oude vrouwelijke ND4 Swiss-Webster muis te excideren.
Gebruik een schone, scherpe chirurgische kling om het overtollige vet en bindweefsel van de huid te schrappen, en breng de huid vervolgens over in een 50 milliliter conische buis met 10 milliliter HBSS op kamertemperatuur, aangevuld met EDTA, HEPES en FBS, en predigesteer het weefsel gedurende 30 minuten op een draaiende plaat in een droge, niet-beluchte, 37 graden Celsius incubator. Aan het einde van de incubatie, vortex de buis krachtig gedurende tien seconden en filter de weefselslurry door een 70 micron zeef. Gebruik vervolgens een paar pincetten om de flankhuidstukken van de zeef over te brengen naar een nieuwe 50 milliliter buis met tien milliliter vers, kamertemperatuur HBSS-medium, aangevuld met EDTA, HEPES en FBS, en gebruik vervolgens een 12,5 centimeter paar chirurgische dissectiescharen om elk stukje flankhuid te hakken zodat het gemiddelde stukje weefsel ongeveer 2,2 bij 2,2 millimeter groot is.
Wanneer alle stukken zijn gehakt, breng de buis terug naar de draaiende plaat voor een verdere incubatie van 30 minuten. Vortex de buis krachtig gedurende 10 seconden aan het einde van de incubatie en filter de inhoud door de 70 micron zeef. Verzamel de resterende flankhuidstukken in een nieuwe 50 milliliter buis met 10 milliliter HBSS aangevuld met 0,7 milligram per milliliter Collagenase D, en breng de buis terug naar de draaiende plaat voor nog eens 30 minuten incubatie.
Na nog eens 10 seconden van vortexen, filter de inhoud van de buis opnieuw, gooi dit keer het puin op de zeef weg, vul de buis vervolgens met maximaal 50 milliliter HBSS, EDTA, HEPES, FBS, centrifugeer de cellen en decant het supernatant. Voeg drie milliliter kamertemperatuur, 67 procent dichtheidsgradiënt centrifugatiemedium in PBS toe aan een nieuwe 15 milliliter conische buis en suspendeer het cellenpellet in vijf milliliter kamertemperatuur 44 procent dichtheidsgradiënt centrifugatiemedium in HBSS met fenolrood. Stel de pipettor op de laagste snelheid in, plaats de pipet aan de zijkant van de buis en laag de cellen voorzichtig op het 67 procent dichtheidsgradiënt centrifugatiemedium.
Wanneer u met dichtheidsgradiënten werkt, zorg ervoor dat u geen luchtbellen maakt en minimaliseer eventuele verstoringen van het gradiëntoppervlak. Scheid vervolgens de cellen, gebruik een vijf milliliter transferpipet om de cellen aan het oppervlak aan het einde van de centrifugatie te verzamelen. Aangezien het voorzichtig lagen van het gradiënt en het zorgvuldig verwijderen van het oppervlak van de gradiënten cruciale stappen zijn, is het verstandig om de dichtheidsgradiënt centrifugatiemedium lagen en oppervlakverwijdering te oefenen met de suspensie van muiselijke splenocyten voordat u de procedure probeert met de experimentele cellen van belang.
Ten slotte, was de verzamelde cellen in ijskoud PBS aangevuld met FBS in een 15 milliliter conische buis en tel het aantal levensvatbare cellen door trypanblauwe uitsluiting. CD4 en CD8-alpha oppervlakte-expressie worden niet beïnvloed door Collagenase D-digestie, aangezien hetzelfde aantal CD4 positieve en CD8-alpha positieve cellen wordt gedetecteerd met of zonder enzymatische vertering. Verder vertoont Collagenase D-digestie geen effect op de oppervlaktedichtheid van de T-cel activeringsmarkers CD44 en CD62L op CD4 positieve T-cellen.
Na gradiëntscheiding worden ongeveer 250 levensvatbare immuuncellen per vierkante millimeter flankweefsel geïsoleerd uit Oxazolon of Ox-uitgedaagde muizen, versus slechts vier levensvatbare immuuncellen per vierkante millimeter weefsel in voertuig-uitgedaagde muizen, eerder gesensibiliseerd met Ox. 95 procent van de lage voorwaartse en zijwaartse verstrooiing van enkele cellen in Ox-uitgedaagde muizen, en 71 procent van deze cellen in voertuig-uitgedaagde controles zijn levende CD45 positieve cellen, wat overeenkomt met een ongeveer 67-voudige toename van de infiltrerende CD45 positieve immuuncelpopulatie in de flankhuid na drie dagelijkse Ox-uitdagingen. Inderdaad, Ox-uitdaging resulteert in de uitgesproken infiltratie van T-cellen en neutrofielen in de flankhuid, met 42 procent van de enkele, levende CD45 positieve cellen in Ox-behandelde dieren, zichtbare Gr-1 positieve neutrofielen, en ongeveer 84 procent CD3 positieve T-cellen die CD8-alpha of CD4 tot expressie brengen, vergeleken met controle, ethanol-behandelde dieren. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer drie uur worden voltooid als deze goed wordt uitgevoerd.
Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om voorzichtig met het dichtheidsgradiënt om te gaan. Vergeet niet om altijd dichtheidsgradiënt centrifugatiemedium op kamertemperatuur te gebruiken bij het uitvoeren van deze procedure. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals flowcytometrische analyse, celsortering, celtransfer of in vitro celcultuur worden uitgevoerd om het fenotype en de functie van de huid-infiltrerende leukocyten te evalueren.
Na het bekijken van deze video, zou u
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de isolatie van huidinfiltrerende leukocyten met behulp van enzymatische digestie en dichtheidsgradiëntscheiding. Deze methode is effectief voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire mechanismen in muismodellen van huidpathologieën, zoals atopische dermatitis.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Huid-infiltrerende leukocyten spelen een cruciale rol bij huidpathologieën.
- Traditionele methoden voor weefseldissociatie kunnen belastend zijn en minder effectief.
- Enzymatische digestie biedt een economischer alternatief.
- Precisie is vereist bij het oogsten van de huid en het hanteren van gradiënten.
Doel van de studie
- Om leukocyten uit muishuid te isoleren voor verdere analyse.
- Om inzicht te verschaffen in de biologie van huid-infiltrerende leukocyten.
- Om de studie van andere residente celpopulaties te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Enzymatische digestie van muishuid in een voedingsrijk medium.
- Gradiëntscheiding voor het isoleren van leukocyten.
- Zorgvuldige excisie van de huid met behulp van chirurgische scharen.
- Visuele demonstratie ter ondersteuning bij het aanleren van de techniek.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van leukocyten uit muishuid.
- Verbeterd begrip van de biologie van huid-infiltrerende leukocyten.
- Potentiële toepassingen bij het bestuderen van diverse huidpathologieën.
- Aangetoonde effectiviteit van de methode in vergelijking met traditionele technieken.
Conclusies
- De enzymatische digestie- en gradiëntscheidingsmethode is effectief en economisch.
- Dit protocol kan het onderzoek naar huidgerelateerde ziekten bevorderen.
- Visuele hulpmiddelen zijn essentieel voor het beheersen van de techniek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het isoleren van levensvatige huidinfiltrerende leukocyten maakt mechanistische risicoreductie van therapeutische doelwitten in modellen van inflammatoire huidaandoeningen mogelijk. Dit protocol ondersteunt de validatie van doelwitten door reproduceerbare toegang te bieden tot immuuncelpopulaties voor fenotypische en functionele analyse. De methode vergroot het voorspellende vertrouwen in preklinische studies door de integriteit van oppervlaktemarkers te behouden, wat cruciaal is voor besluitvorming op basis van flowcytometrie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door infiltrerende immuuncellen uit zieke huid te isoleren.
- Operationele waarde: Biedt een kosteneffectief alternatief voor mechanische dissociatoren en agressieve enzymatische methoden die de levensvatbaarheid in gevaar brengen.
- Voorspellende waarde: Behoudt de integriteit van oppervlaktemarkers zoals CD4, CD8-alpha, CD44 en CD62L, wat een betrouwbare fenotypische karakterisering ondersteunt.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert zeer levensvatbare single-cell suspensies die geschikt zijn voor downstream flowcytometrie en functionele assays.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van toegankelijke reagentia (Collagenase D, dichtheidsgradiëntmedia) en standaard laboratoriumapparatuur, wat de standaardisatie van assays verbetert.
- Schaalbaarheid: Maakt een consistente opbrengst aan immuuncellen mogelijk (~250 levensvatbare cellen/mm² in ontstoken huid) voor reproduceerbare screeningsworkflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt de analyse van immuuninfiltraten in modellen van huidontsteking, zoals Oxazolon-geïnduceerde dermatitis.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt kwantificering van CD45+ immuuncelinfiltratie mogelijk (67-voudige toename na challenge) om de target engagement te beoordelen.
- Relevantie van preklinische modellen: Isoleert T-cellen en neutrofielen waarvan de infiltratiepatronen de menselijke huidpathologie weerspiegelen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing in de vroege immunologie tot lead-optimalisatie via immuuncelprofilering in modellen voor inflammatoire ziekten.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten door huid-infiltrerende leukocyten te isoleren om immuunmechanismen bij huidpathologieën te verduidelijken.
- Screening: Maakt assay-klare celsuspensies mogelijk voor het evalueren van de effecten van verbindingen op de rekrutering of activatie van immuuncellen.
- Analytiek: Levert kwantitatieve resultaten, zoals levensvatbare celcounts en voor flowcytometrie geschikte subsets voor vergelijkende conditieanalyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt ontdekkingen met preklinische validatie door markers te behouden die nodig zijn om immuuncelfenotypen in verschillende modellen te volgen.
- Herbruikbaarheid in ondernemingen: Vestigt een herbruikbaar isolatieprotocol dat toepasbaar is op meerdere modellen van huidziekten en residente celtypen.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het doelwit door een nauwkeurige karakterisering van infiltrerende leukocytsubsets mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde stappen voor enzymatische digestie en gradiëntscheiding.
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico bij de selectie van lead-verbindingen door betrouwbare immuuncelgegevens te leveren voor go/no-go-beslissingen.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt de risicogecorrigeerde prioritering van verbindingen op basis van de effectiviteit van immunomodulatie in relevante preklinische modellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het oogsten van weefsel, specifiek het verwijderen van vet- en bindweefsel van de muizenhuid.
- Afhankelijk van toegang tot een centrifuge, een roterende plaat, 70 micron strainers en chirurgische instrumenten voor het fijnmalen van weefsel.
- Training in het aanbrengen van dichtheidsgradiënten en interface-extractie is noodzakelijk om beluchtingsvorming te voorkomen en herstel te waarborgen.
- Aanpassing kan nodig zijn bij toepassing op verschillende muizenstammen, leeftijden of huidbeschadigingsmodellen buiten de Oxazolone-challenge.
- Praktische beperking: Vaardigheid vereist oefening, met name in de omgang met gradiënten, om consistente leukocytenopbrengsten te realiseren.
