Verbetering van 2D- en 3D-Skin In Vitro Modellen Met behulp van macromoleculaire Crowding
22 augustus 2016
We presenteren een protocol om cellen afgeleide matrices rijk aan extracellulaire matrix eiwitten te verkrijgen, met behulp van macromoleculaire Crowders (MMC). Bovendien presenteren we een protocol dat MMC in 3D organotypische co-kweek huid generatie, die kweektijd vermindert behoud looptijd construct omvat.
Het algemene doel van deze procedure is om de afzetting van extracellulaire matrix te verbeteren en de huidige 2D- en 3D-huidmodellen te verbeteren door gebruik te maken van macromoleculair crowding. Crowding verbetert de generatie van door cellen afgescheiden matrices en rijpe organotypische culturen in een beperkt tijdsbestek. Deze methode kan belangrijke vragen in het veld van weefselengineering beantwoorden omdat het verbeterde manieren biedt om door cellen afgescheiden extracellulaire matrices te genereren voor de bio-engineering van huid en andere weefsels.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat door cellen afgescheiden matrices en organotypische huidconstructen in een aanzienlijk kortere tijd kunnen worden gegenereerd door macromoleculair crowding toe te passen op deze culturen. De techniek van interferentieverspreidingsmicroscopie stelt u in staat om de totale extracellulaire matrixafzetting te visualiseren zonder de noodzaak van antilichaamkleuring. Toepassingen van deze technieken zullen zich uitstrekken van onderzoek naar extracellulaire matrixafzetting door huidcellen tot verbeterde wondtherapieën, vooral met de generatie van betere huidequivalenten en weefselkweek voor transplantatie.
Om te beginnen, zaait u 50.000 primaire fibroblasten, primaire keratinocyten of een co-cultuur van beide, in één milliliter medium per put, in de putjes van een 24-putsplaat. Laat de cellen overnacht aanhechten in een 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide incubator. Gooi vervolgens het oude medium weg en vervang het door één milliliter vers medium dat macromoleculaire crowders en 100-micromolaire ascorbinezuur bevat.
Incubeer de culturen gedurende zes dagen, waarbij het medium om de twee dagen wordt ververst. Voer immunofluorescentie en Western blotting uit volgens het tekstprotocol. Om een door cellen afgescheiden matrix te maken en te gebruiken, decellulizeer de cellagen na culturing van de cellen gedurende zes dagen met moleculaire crowders en ascorbinezuur zoals zojuist is aangetoond, om een door cellen afgescheiden matrix te verkrijgen door eerst 1X PBS te gebruiken om de cellagen twee keer te wassen.
Zuig de PBS op en voeg vervolgens 250 microliter 0,5% natriumdeoxycholaat toe en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Zuig het cellysaat op, voeg vervolgens nog eens 250 microliter 0,5% natriumdeoxycholaat toe en herhaal de 10-minuten incubatie en aspiratie nog twee keer. Gebruik gedistilleerd water om de door cellen afgescheiden matrix twee keer te wassen.
Zuig het water op en voeg vervolgens 1X PBS toe. Bewaar de matrix maximaal een week op vier graden Celsius. Om een secundaire celsuspensie te bereiden, zuig de PBS van de matrix weg en zaait u 50.000 keratinocyten op de F mat, bijvoorbeeld.
Laat de cellen overnacht aanhechten. Om interferentieverspreidingsmicroscopie, of RIM, uit te voeren op een door cellen afgescheiden matrix, voert u beeldverwerving uit met behulp van een con-focale microscoop volgens het tekstprotocol. Om een collageengel met fibroblasten ingekapseld in een celcultuurinzetstuk te giet, verdeelt u 10 milliliter rattenstaarcolageen type één in een koude beker.
Voeg één milliliter koud DMEM en 0,5 milliliter één molair natriumhydroxide toe om het zure collageen te neutraliseren. Voeg vervolgens 0,5 milliliter fibroblastensuspensie toe. Verdeel de 12 milliliter oplossing met behulp van een koude pipet gelijkmatig in celcultuurinzetstukken in een zes-putscultuurplaat.
Incubeer de gel gedurende één uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Zodra de gel is gestold, dompelt u deze in fibroblastmedium of FM. Na incubatie gedurende 24 uur, zuigt u de FM op. Gebruik vier milliliter vers medium dat macromoleculaire crowders bevat om het oude FM te vervangen door twee milliliter toe te voegen aan de binnenkant van het celcultuurinzetstuk en twee milliliter aan de buitenkant van het celcultuurinzetstuk. Na een incubatie van 24 uur, gebruikt u 0,125% trypsine-cheating agent om de keratinocyten te trysoniseren.
Tik zachtjes op de zijkanten van de flacon om de cellen los te maken en voeg serumbevattend medium toe om de trypsine te neutraliseren. Na het tellen van de cellen, bereidt u een keratinocytensuspensie voor. Vervolgens zuigt u het medium van de celcultuurinzetstukken en voegt u de keratinocyten toe aan de bovenkant van het gel.
Incubeer het gel gedurende één uur. Nadat de keratinocyten zich aan het geloppervlak hebben gehecht, gebruikt u twee milliliter KSFM, of CTN-57 serumvrij medium om de cel binnen het gelcultuurinzetstuk onder te dompelen en voegt u twee milliliter FM toe aan de buitenkant van het celcultuurinzetstuk. Na een incubatie van 24 uur, gooit u het oude medium weg en vervangt u het door vers medium dat macromoleculaire crowders bevat.
Na zeven dagen in de ondergedompelde cultuur, om de cultuur naar een lucht-vloeistofgrensvlak te brengen, brengt u het cultuurinzetstuk over naar een diepe putplaat. Voeg 10 milliliter stratificatiemedium toe aan de buitenkant van het celcultuurinzetstuk, waarbij de binnenkant van het inzetstuk droog blijft. Beëindig tenslotte de culturen en ververs het medium elke drie dagen gedurende 14 dagen.
Oogst en verwerk ze volgens het tekstprotocol. Zoals hier getoond, maakte macromoleculair crowding het mogelijk voor fibroblasten om meer extracellulaire matrix of ECM af te zetten in vergelijking met controleculturen. Bij secularisatie was het duidelijk dat fibroblasten de belangrijkste deposito's waren van collageen één, collageen vier en fibronectine.
Deze figuur toont aan dat het fibroblasten waren en niet keratinocyten die de belangrijkste deposito's waren van collageen zeven, en dit is het eerste rapport van succesvolle collageen zeven afzetting in vitro. Met behulp van RIM werd de volledige omvang van de door cellen afgescheiden matrix vastgelegd. Een overlap van de RIM-afbeelding met antilichaamsgekleurde toont de relatieve hoeveelheid van die ECM-component in relatie tot de totale hoeveelheid ECM.
In een 3D in vitro huidmodel verkortte macromoleculair crowding of MMC de cultuurtijd van vijf weken tot drie om een rijpe organotypische huidco-
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het verkrijgen van cel-afgeleide matrices die rijk zijn aan extracellulaire matrixeiwitten met behulp van macromoleculaire crowding (MMC). De methode verbetert de generatie van organotypische huid-cocultures, waardoor de cultuurduur wordt verkort terwijl de rijpheid van het construct behouden blijft.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Weefseltechniek
- Biologie van de extracellulaire matrix
- Huidregeneratie
Achtergrond
- Huidige 2D- en 3D-huidmodellen vertonen beperkingen in de depositie van de extracellulaire matrix.
- Macromoleculaire crowding kan de generatie van de cel-afgeleide matrix verbeteren.
- Verbeterde organotypische kweek kan worden bereikt binnen een verkort tijdsbestek.
- Dit onderzoek beantwoordt kernvragen binnen de weefseltechnologie.
Doel van de studie
- Om methoden voor het genereren van cel-afgeleide extracellulaire matrices te verbeteren.
- Om betere huidequivalenten te ontwikkelen voor transplantaties en wondtherapieën.
- Om de depositie van de extracellulaire matrix te visualiseren zonder antilichaamkleuring.
Gebruikte methoden
- Toepassing van macromoleculaire crowding in celculturen.
- Interferentiereflectiemicroscopie voor visualisatie.
- Generatie van 3D organotypische huid-coculturen.
- Beoordeling van de depositie van de extracellulaire matrix.
Belangrijkste resultaten
- Aanzienlijk verkorte cultuurtijd voor organotypische constructen.
- Waargenomen verbeterde depositie van de extracellulaire matrix.
- Behaalde verhoogde maturiteit van huidconstructen.
- Potentiële toepassingen in wondtherapie en huidtransplantaties.
Conclusies
- Het gebruik van MMC is effectief bij het genereren van celafgeleide matrices.
- Deze methode kan leiden tot vooruitgang in tissue engineering.
- Toekomstige studies kunnen bredere toepassingen in de regeneratieve geneeskunde verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Macromoleculaire crowding pakt een belangrijk knelpunt in de ontwikkeling van huidmodellen aan door de depositie van de extracellulaire matrix te versnellen, waardoor fysiologisch relevante 2D- en 3D-huidconstructen sneller kunnen worden gegenereerd. Deze benadering ondersteunt voorspellende risicoreductie bij dermale weefselengineering door de assemblage van collageen en fibronectine te verbeteren, welke cruciaal zijn voor de integratie van huidtransplantaten en de resultaten van wondgenezing. Door de kweekperiodes te verkorten van vijf naar drie weken en tegelijkertijd de rijping van de dermale-epidermale junctie te verbeteren, biedt deze methode strategische waarde bij de optimalisatie van vroegstadium preklinische modellen en translationele continuïteit.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert de depositie van collageen I/IV/VII en fibronectine door dermale fibroblasten, wat bijdraagt aan de functionele targetvalidatie van matrix-gerelateerde signaalpaden.
- Operationele waarde: Maakt de snelle generatie van cel-afgeleide matrices mogelijk voor mechanistische analyse van extracellulaire eiwitinteracties.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert gestandaardiseerde cel-afgeleide matrices met een kwantificeerbare ECM-samenstelling voor reproduceerbare assayplatformen.
- Operationele waarde: Maakt interferentiereflectiemicroscopie mogelijk om matrixdepositie te monitoren zonder antilichaamkleuring, waardoor de acquisitie van resultaten wordt gestroomlijnd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Genereert volwassen organotypische huidmodellen met verbeterde vorming van de dermale-epidermale overgang en verankeringsfibrillen, wat de preklinische relevantie verhoogt.
- Operationele waarde: Verkort de kweekduur voor huidequivalenten, waardoor de tijdlijnen voor preklinisch testen van transplantatie- en wondgenezingsstudies worden versneld.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm door de snelle productie van gevalideerde biologische systemen mogelijk te maken voor downstream-toepassingen in lead-identificatie en preklinische validatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing over mechanismen van matrixdepositie en pathway-verduidelijking in co-culturen van fibroblasten en keratinocyten.
- Screening: Levert assay-klare cel-afgeleide matrices met gestandaardiseerde ECM-outputs voor compound-screening en biomarker-evaluatie.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van de extracellulaire matrix via interferentiereflectiemicroscopie en immunokleuring om cultuurcondities te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Handhaaft continuïteit van 2D-matrixgeneratie naar 3D-organotypische modellen, wat de afstemming van biomarkers bij de dermale-epidermale junctie ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het genereren van cel-afgeleide matrices over meerdere huidmodel-systemen en weefseltypen.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in de rijpheid van het huidmodel door verbeterde depositie van collageen VII en de vorming van verankeringsfibrillen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de productie van de extracellulaire matrix via gestandaardiseerde protocollen voor macromoleculaire crowding.
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico in de preklinische ontwikkeling door klinisch relevantere huidequivalenten te genereren met een matrixarchitectuur die lijkt op die van natuurlijk weefsel.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door eerdere toegang te bieden tot rijpe, transplanteerbare huidconstructen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in primaire celkweek, analyse van de extracellulaire matrix en het hanteren van macromoleculaire reagentia.
- Is afhankelijk van toegang tot interferentiereflectiemicroscopie, immunofluorescentie en elektronenmicroscopie voor matrixvalidatie.
- Maakt standaardisatie van de crowderconcentratie en ascorbinezuursuppletie over verschillende celtypen en kweekformaten noodzakelijk.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het overdragen van het protocol naar verschillende fibroblasten- of keratinocytenbronnen.
- Wordt beperkt door de noodzaak van geoptimaliseerde decellularisatiestappen om de integriteit van de matrix te behouden terwijl cellulaire componenten worden verwijderd.
