Flow-patroon Begeleide Fabrication van High-density Barcode Antibody Microarray
January 6th, 2016
Dit protocol beschrijft de vervaardiging van een grootschalige multiplex tweedimensionale DNA of antilichaam-array, met potentiële toepassingen in cell signaling studies en biomarker detectie.
Het algemene doel van deze methodologie is om een antilichaamarray te fabriceren met toepassingen in single-cell analyse. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van single-cell analyse te beantwoorden, zoals hoe we geheime eiwitten en intracellulaire eiwitten gelijktijdig uit dezelfde enkele cel kunnen detecteren. En hoe we een micro-array platform kunnen fabriceren om dat doel te bereiken.
Het grote voordeel van deze techniek is dat deze aanpasbaar is. Door de stroompatronenstrategieën te variëren, kunnen arrays van verschillende afmetingen worden gemaakt. Vooraf genereer de SU-8 master voor de barcode stroompatronen.
Instructies worden gegeven in het tekstprotocol. Dit omvat het ontwerpen en maken van een chroom foto-masker. Het plaatsen van het masker op een foto-resist coat en het toepassen van UV levert het patroon op.
Om te beginnen met het voorbereiden van de PDMS barcode mal, combineer 40 gram siliconen elastomere basis met vier gram verhardingsmiddel, en roer vervolgens krachtig gedurende 10 minuten. De-gas vervolgens de pre-polymeeroplossing gedurende 20 minuten onder vacuüm. Laad vervolgens de oplossing in een petrischaal met een siliconenwafer met de SU-8 master van het barcodepatroon.
Giet de oplossing tot een diepte van 7,45 millimeter. De-gas vervolgens het mengsel in de schaal om eventuele resterende luchtbellen te verwijderen. Volg de ontgassing door het mengsel een uur lang bij 75 graden Celsius te bakken om de PDMS te harden.
Vervolgens, door met een scalpel te snijden, verwijder voorzichtig de barcode mal. Vervolgens, verwijder voorzichtig de plaat van de wafer. Trim vervolgens de randen van de plaat om de gewenste vorm voor de mal te maken.
Voltooi de mal door een biopsie punch met plunjer te gebruiken om halve millimeter gaten te maken bij de cirkelvormige kenmerken op het patroon die inlaat- en uitlaatopeningen vertegenwoordigen. Na het afblazen van eventueel stof van een met poly-L-lysine gecoate glasplaat met een stikstofblazer, bevestig de PDMS mal aan de plaat. Lijn de randen van de mal voorzichtig uit met de plaat.
Bakken nu de assemblage gedurende 90 minuten bij 75 graden Celsius om de binding tussen de PDMS en de plaat te versterken. Bereid ondertussen 20 stukken flexibele polyethyleen buis voor de in- en uitlaatopeningen. Bevestig op elk stuk buis een roestvrijstalen holle pin met een diameter van een millimeter.
Vervolgens, via de pinnen, vul de lengtes met een centimeter of meer poly-L-lysine. Zodra gebonden aan het glas, bevestig de pinnen voorzichtig aan de inlaatopeningen van de mal. Dit is de moeilijkste stap van de voorbereiding.
Haast u niet met het proces. Bevestig het andere uiteinde van de buizen aan een drukgeregelde stikstoftank opstelling die bestaat uit een netwerk van 20 driewegkleppen en twee mals tegelijk kan verwerken. Gebruik de opstelling om oplossing door de mal te blazen bij 0,5 tot één PSI gedurende minimaal zes uur.
Begin met het aanzuiging van vers bereide enkelstrengs DNA-oplossingen in BS-3 door de roestvrijstalen pinnen en in de polyethyleen buis. Koppel vervolgens de PDMS mal aan de stikstofbron en laat de oplossing gedurende ongeveer 40 minuten door de barcode mal stromen of tot alle kanalen gevuld zijn. Stop vervolgens de stroom en laat de mal twee uur bij kamertemperatuur incuberen.
Na een paar uur, bak de barcode mal gedurende een uur bij 75 graden Celsius. Eenmaal gebakken, verwijder de mal van de plaat en was de plaat voorzichtig met 01%SDS. Was vervolgens de plaat drie keer met ultra-puur water.
Volg de wasbeurten door de barcode plaat te drogen met behulp van een plaatjes-spinner. Eenmaal droog, bewaar de barcode plaat in een schone 50 milliliter buis. Volg vervolgens het tekstprotocol om het eendimensionale patroon te valideren.
Om de validatieprocedure uit te voeren, blokkeer de plaat, hybridiseer cyanine drie complementaire DNA eraan en meet de resultaten. De SU-8 master voor een drie bij drie array heeft een stroompatroon dat loodrecht staat op dat van het eerste ontwerp. Gebruik de eerder beschreven methode om een nieuwe PDMS mal van dit patroon te maken.
Om te beginnen, maak verse werkconcentraties van de negen oligonucleotiden. Laat vervolgens een drie procent BSA blokkeringsoplossing een uur lang door alle 20 kanalen van de array plaat stromen bij 0,5 tot één PSI. Laad vervolgens de DNA-oplossingen in hun respectieve kanalen.
Na ze ongeveer 40 minuten te hebben laten stromen, incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende twee uur om de DNA te laten hybridiseren. Laat vervolgens drie procent BSA blokkeringsoplossing een uur lang door alle 20 kanalen stromen. Dit zal de niet-gehybridiseerde DNA verwijderen.
Vervolgens, verwijder de array plaat van de PDMS en dompel de plaat eenmaal in drie procent BSA. Dompel de plaat vervolgens twee keer in PBS gevolgd door één keer in twee procent PBS. Droog vervolgens de plaat zoals eerder met behulp van een microscoop plaatjes-spinner.
Voor het vervolgen, voer een validatiestap uit die vergelijkbaar is met het valideren van eendimensionale plaatjes. Gebruik oligonucleotiden één-prime tot negen-prime, allemaal geconjugeerd met cyanine drie. Bewaar de drie bij drie array plaat in een 50 milliliter centrifugebuis voor later gebruik.
Het tekstprotocol legt verder uit hoe de DNA array kan worden omgezet in een antilichaamarray. Na het bereiden en zuiveren van de antilichaam-oligonucleotiden conjugaten, bereid een andere PDMS mal met micro-kamers voor. Zie de tekst voor details.
Koppel deze mal met de array plaat. Blokkeer nu de plaat met één procent BSA en incubeer het een uur bij kamertemperatuur. Tijdens de incubatie, bereid 200 microliter antilichaam-oligonucleotiden conjugaten voor.
Na het blokkeren, voeg de antilichaam-oligo cocktail toe aan de opstelling. Laat de antilichamen een uur lang op de array incuberen bij 37 graden Celsius, en reinig en droog vervolgens de plaat voordat u verder gaat met de in de tekstprotocol beschreven plaatjesduiken. Na het volgen
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de fabricage van een aanpasbare antilichaam-array met toepassingen in single-cell analyse. Het doel is om geheime en intracellulaire eiwitten gelijktijdig vanuit dezelfde enkele cel te detecteren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Single-cell analyse
- Fabricage van antilichaam-array
- Biomarker detectie
Achtergrond
- Begrip van celsignalering is cruciaal voor biologisch onderzoek.
- Huidige methoden kunnen mogelijk niet effectief meerdere eiwitten in enkele cellen detecteren.
- Aanpasbare arrays kunnen de detectiecapaciteit verbeteren.
- Flow patterning strategieën staan gevarieerde array dimensies toe.
Doel van Studie
- Om een methode te ontwikkelen voor gelijktijdige detectie van eiwitten in enkele cellen.
- Om een micro-array platform te creëren dat is afgestemd op specifieke onderzoeksbehoeften.
- Om het begrip van intracellulaire processen te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Fabricage van een grootschalige antilichaam-array.
- Gebruik van SU-8 masters voor barcode flow patronen.
- Aanpasbare flow patterning strategieën.
- Toepassing van de array in single-cell analyse.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle fabricage van een multiplexed antilichaam-array.
- Aangetoond vermogen om meerdere eiwitten uit enkele cellen te detecteren.
- Aanpasbare arrays vertoonden veelzijdigheid in toepassingen.
- Mogelijkheid voor significante vooruitgang in biomarker detectie.
Conclusies
- De ontwikkelde methode verbetert de capaciteit van single-cell analyse.
- Aanpasbare arrays kunnen worden afgestemd op specifieke onderzoeksvragen.
- Deze aanpak kan leiden tot nieuwe inzichten in celsignalering en biomarker onderzoek.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
High-density barcode antibody microarrays fabricated via flow-patterning enable multiplexed protein detection at single-cell resolution, addressing critical needs in early discovery and translational research. This platform supports simultaneous analysis of secreted and intracellular proteins, enhancing mechanistic de-risking and predictive confidence for target validation. The customizable, miniaturized format facilitates integration into diverse R&D workflows, supporting portfolio-wide biomarker and signaling studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of protein expression and signaling pathways at the single-cell level.
- Supports functional target validation by detecting multiple analytes from individual cells.
- Facilitates mechanistic de-risking through multiplexed protein profiling.
- Improves predictive confidence for early-stage portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microarray platforms for high-throughput screening of protein biomarkers.
- Delivers quantitative, reproducible outputs suitable for assay standardization.
- Supports scalable, printer-free fabrication adaptable to various assay formats.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein expression in single cells.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant single-cell models for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting multiplexed protein analysis.
- Reduces biological risk in advancing candidates by providing high-content, quantitative data.
- Facilitates studies of cell-cell signaling in tumor microenvironments and other complex systems.
Pipeline & Workflow Integration
This barcode microarray technology integrates from early discovery through lead identification and translational research, supporting multiplexed protein analysis in single-cell and tissue models.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and pathway clarification at single-cell resolution.
- Screening: Offers reproducible, quantitative readouts for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables sensitive, multiplexed measurement of protein expression and signaling outputs.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and disease-relevant model studies.
- Enterprise Reuse: Delivers a customizable, scalable platform adaptable across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and miniaturizes microarray fabrication for broad laboratory adoption.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-content data early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with robust protein profiling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, DNA-antibody conjugation, and microarray validation.
- Needs access to PDMS molding, flow-patterning equipment, and fluorescence detection systems.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and sensitivity.
- Adaptable to various model systems, including single-cell and tissue microenvironments.
- Uniformity and sensitivity depend on particulate-free fabrication and precise handling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
One-dimensional DNA Barcode Slides: Preparing the PDMS Barcode Mold
2:21
One-dimensional DNA Barcode Slides: Patterning of Poly-L-lysine (PLL)
3:39
One-dimensional DNA Barcode Slides: Patterning of ssDNA
5:00
Two-dimensional 3x3 DNA Arrays: Preparing the PDMS Barcode Mold and Flow Patterning of ssDNA
6:17
Two-dimensional 3x3 DNA Arrays: Validation and Immunoassay
7:32
Results: Multiplex-protein Detection from Single-cell Preparations
8:25
Conclusion
