Modeling Chemotherapie Resistant Leukemie In Vitro

Het algemene doel van deze procedure is om resistente acute lymfatische leukemie, of ALL, beter te modelleren, in vitro. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de behandeling van refractaire ALL over hoe de beenmerg micro-omgeving ALL cel chemotherapeutische resistentie beïnvloedt. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het aanzienlijk goedkoper en minder tijdrovend is dan het gebruik van traditionele diermodellen om de effectiviteit van geneesmiddelen op refractaire ALL cellen te onderzoeken.

Begin door vijf tot twintig keer 10 tot de zesde leukemie cellen in 10 milliliter tumorspecifiek kweekmedium op een 100 millimeter plaat van 80 tot 90% confluente beenmergstromacellen of osteoblasten te zaaien. Elke vierde dag, kantelt de plaat opzij en zuigt alle behalve één milliliter van het medium af, zorg ervoor dat de aanhechtende cel laag niet wordt verstoord. Voeg vervolgens voorzichtig negen milliliter vers leukemie cel kweekmedium druppelsgewijs toe in de hoek van de plaat langs de zijkant om een minimale verstoring van de aanhechtende cellen te garanderen.

Na de 12e dag van co-cultuur, pipetteer voorzichtig het kweekmedium vijf tot tien keer op en neer over de plaat om de zwevende leukemie cellen te verzamelen. Breng de cellen over in een 15 milliliter conische buis. Zaai vervolgens de cellen opnieuw op een nieuwe plaat van 80 tot 90% confluente beenmergstromacellen of osteoblasten, zoals zojuist is gedemonstreerd.

Tegen dag vier zullen zich drie subpopulaties van leukemie cellen hebben gevormd, waarbij de gesuspendeerde leukemie cellen vrij zweven in het medium. De Phase Bright leukemie cellen hechten zich aan het oppervlak van de aanhechtende celmonolaag en de Phase Dim leukemie cellen migreren onder de monolaag. Om de G10 kralenkolommen voor te bereiden, verwarm eerst 30 milliliter kweekmedium per kolom op 37 graden Celsius in een waterbad.

Gebruik vervolgens een pincet om glaswol in dunne, losse strengen te trekken. En voeg meerdere lagen licht verpakte strengen toe aan één 10 milliliter spuit per kolom die nodig is. Wanneer de spuit 2/3 vol is, bevestig een eenrichtings stopkraan in de gesloten positie op de punt en klemp de spuit op een ringstandaard hoog genoeg dat een 50 milliliter conische verzamelbuis onder de stopkraan kan worden geplaatst.

Plaats nu een verzamelbuis onder de spuitkolom. En gebruik een 10 milliliter pipet om druppels G10 deeltjes, gesuspendeerd in PBS, bovenop de glaswol toe te voegen. Blijf de G10 deeltjes toevoegen tot er een twee milliliter pellet ontstaat.

Voeg vervolgens twee milliliter aliquoten van het voorverwarmde medium toe aan de kolom. En open langzaam de stopkraanklep, zodat het medium druppelsgewijs uit de kolom stroomt. Wanneer 10 milliliter medium volledig door de kolom is gedraineerd, sluit de stopkraan.

Gooi de doorstroming weg en plaats een nieuwe verzamelbuis onder de kolom. Om de gesuspendeerde tumor subpopulatie te oogsten, zuig het medium van de leukemie cel co-cultuurplaat en gebruik hetzelfde medium om de plaat één keer voorzichtig te spoelen. Breng vervolgens de zwevende suspensie leukemie cel subpopulatie over in een 15 milliliter conische buis.

Om de Phase Bright tumor subpopulatie te oogsten, voeg 10 milliliter vers medium toe aan de co-cultuurplaat. En spoel ongeveer vijf keer krachtig genoeg om de aanhechtende leukemie cellen te verwijderen zonder de aanhechtende celmonolaag te verplaatsen. Breng vervolgens de Phase Bright subpopulatie over in zijn eigen 15 milliliter conische buis.

Om de Phase Dim tumor subpopulatie te oogsten, verwijder het resterende medium met een een milliliter PBS spoeling. En los de cellen op met drie milliliter trypsine bij 37 graden Celsius. Na vijf minuten, tik voorzichtig op de zijden van de plaat om de aanhechtende cellen los te maken, gevolgd door de toevoeging van één milliliter FBS om de enzymatische reactie te stoppen.

Spoel vervolgens het serum drie tot vijf keer om eventuele grote celaggregaten te breken. En breng de ongezuiverde Phase Dim subpopulatie over in een nieuwe 15 milliliter conische buis. Wanneer alle subpopulaties zijn verzameld, centrifugeer de cellen.

En suspendeer elk van de pellets in één milliliter voorverwarmd medium. Met de stopkraan volledig gesloten, gebruik voor elke subpopulatie een 1.000 microliter pipet om het volledige volume van één milliliter cellen druppelsgewijs toe te voegen op de top van een van de voorbereide G10 kolommen, ervoor zorgen dat de cellen op of binnen het G10 pellet blijven. Laat de cellen 20 minuten op het G10 pellet incuberen bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens één tot drie milliliter vers voorverwarmd medium toe aan de kolom. En open de stopkraan zodat het medium druppelsgewijs langzaam de kolommen verlaat. Blijf voorverwarmd medium toevoegen aan de kolommen, in stappen van één tot twee milliliter.

Wanneer een totaal van 15 tot 20 milliliter leukemie cellen is verzameld, sluit de stopkraan en sluit de verzamelbuis af. Centrifugeer vervolgens de cellen en suspendeer het pellet in de juiste downstream analysebuffer. Na trypsinisatie van de aanhechtende celmonolaag, worden twee verschillende populaties cellen waargenomen door voorwaarts versus zijwaartse verstrooiingsanalyse.

Na G10 scheiding, wordt een pure populatie ALL cellen hersteld. Van bijzonder belang is dat alle Phase Dim cellen die zijn hersteld uit beenmergstromacellen of osteoblast co-culturen, weinig tot geen dood vertonen na hun blootstelling aan cytotoxische chemotherapie. Bij het uitvoeren van deze procedures, is het belangrijk om te onthouden deze stappen zo goed mogelijk uit te voeren om eventuele fenotypische veranderingen die in de leukemie cellen kunnen optreden te verminderen.

Deze techniek biedt een manier voor onderzoekers in het veld van leukemieonderzoek om de chemotherapie-resistente leukemie te modelleren in een in vitro model dat nauwer lijkt op de beenmerg micro-omgeving.