Name: Onderzoek van eiwitten gebonden aan ontluikende DNA in zoogdiercellen met behulp van BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Leer de BrdU-ChIP-Slot-Western techniek om eiwitten gebonden aan ontluikend DNA in zoogdiercellen te onderzoeken. Deze methode biedt snelle, kwantitatieve detectie van DNA-replicatie en reparatieprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk in dit manuscript werd ondersteund door fondsen van Dept. of Radiation Oncology en Huntsman Cancer Institute en het National Institute of Health subsidie ​​(R01-CA188520) naar SB. Ik dank Danielle Johnson en Steven Bennett in mijn lab voor het aantonen van het protocol en het uitleggen van de voordelen ervan. Ik ben dankbaar dat Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Cancer Institute) voor kritische opmerkingen over het manuscript.

1. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) na BrdU Labeling <ol><li> Kweek NIH3T3-cellen in de aanwezigheid van ofwel DMSO of HDAC1,2-selectieve inhibitors zoals eerder 6 beschreven. </li><li> Na behandeling met DMSO of HDAC1,2 selectieve remmers, voeg BrdU aan de cellen in een steriele weefselkweek kap. Incubeer 2 x 10 6 NIH3T3-cellen uitgeplaat in 10 ml NIH3T3 media met een 20 pM eindconcentratie van broomdeoxyuridine (BrdU) gedurende 60 min in een steriele 37 ° C weefselkweek incubator. </li><li> Crosslink intracellulaire eiwitten aan DNA door formaldehyde direct toevoegen aan het kweekmedium in een eindconcentratie van 1%. Incubeer 2 x 10 6 NIH3T3 cellen met formaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten op een schudapparaat. </li><li> Blus de verknoping door toevoeging van glycine tot een uiteindelijke concentratie van 125 mM. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op een shaker. </li><li> Verwijder het medium en cellen in PBS te verzamelen in een 15 ml centrifugebuis. Spin CELls bij 956 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Was de celpellet tweemaal met ijskoude PBS. Verwijder PBS uit de tube. Bewaar de verknoopte celpellet zonder PBS (het supernatans) bij -80 ° C tot gebruik. </li><li> Bereid het lysaat van de verknoopte celpellet door toevoeging van 500 pi FA140 buffer (50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 en 0,1% natriumdeoxycholaat) aangevuld met protease inhibitor cocktail. </li><li> Shear het chromatine door sonicating de monsters vijf keer bij 35% vermogen en met een 15 sec puls, 0,9 seconde aan en 0,1 seconde uit-instelling. Houd de buisjes op ijs na elke ronde van sonicatie verwarming van de monsters te voorkomen. <ol><li> Controleer de afschuiving op een DNA gel de afschuiving efficiëntie varieert tussen verschillende sonicators. Om sonicatie controleren, reverse verknoping door het toevoegen van NaCl tot een concentratie van 0,16 M en stappen 1.17.1 voeren. - 1.22. Run geëlueerde 10 pl DNA op een 1,5% agarose gel om te controleren of de afschuiving istussen 300 - 700 bp met een gemiddelde intensiteit van 500 bp. </li></ol></li><li> Na sonicatie, centrifuge monsters gedurende 10 min bij 17.949 xg bij 4 ° C en breng het supernatans naar een nieuwe buis. <ol><li> Voer eiwit schatting met de commerciële eiwit assay kit volgens protocol van de fabrikant. Gebruik gelijke hoeveelheid lysaat voor de chip van de controle en experimentele monsters. In het algemeen, gebruik 1 mg totaal lysaat per chip reactie. </li></ol></li><li> Bereid 50% suspensie van proteïne A-agarose gebruikt FA140 buffer bevattende proteaseremmer cocktail. Voeg 1/10 volume van de proteaseremmer cocktail. Bereken het volume kralen nodig op basis van het aantal monsters in totaal. <ol><li> Wash Proteïne A-agarose kralen met FA140 buffer tweemaal de opslagbuffer verwijderen en een gelijk volume aan FA140 buffer om de kralen tot 50% slurry te maken. </li><li> Eiwitten die niet-specifiek binden aan de kralen te verwijderen, voeg 50 ul van 50% suspensie van proteïne A-agarose en incubate de monsters bij 4 ° C onder constant end-over-end rotatie in een rotisserie menger gedurende 30 min. </li></ol></li><li> Spin de monsters bij 956 xg bij 4 ° C gedurende een minuut. Verzamel de bovenstaande vloeistof en uitvoeren immunoprecipitatie door toevoeging ofwel 8 pl H4K16ac antilichaam of 5 ui (5 ug) van 1 mg / ml SMARCA5 antilichaam aan het supernatant. Incubeer bij 4 ° CO / N met een constante end-over-end rotatie in een rotisserie mixer. </li><li> Opslaan 1 / 10e van het extract voor &#39;input&#39; controle en instellen als terzijde bij -20 ° C. De ingang heeft reverse verknoopt met de IP samples worden. </li><li> Met evenveel konijnen IgG (5 ui 1 mg / ml) als negatieve controle immunoprecipitatie monster. </li><li> De volgende dag, toevoegen van 50 pl 50% proteïne A-agarose slurrie aan het extract en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C met rotatie. </li><li> Pellet agarose korrels door centrifugatie bij 956 xg gedurende 2 min bij 4 ° C, verwijder het supernatant en wash de kralen met de volgende buffers sequentieel. In buffer preparaten voeg proteaseremmers vlak voor gebruik. <ol><li> Wassen met laag zout immuuncomplex Wash Buffer (FA140; eindconcentratie van 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 en 0,1% natrium deoxycholaat) voor 5 min bij 4 ° C met eind-over-eind rotatie. </li><li> Wassen met High Salt immuuncomplex Wash Buffer (FA500; eindconcentratie van 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 en 0,1% natrium deoxycholaat) voor 5 min bij 4 ° C met eind-over-eind rotatie. </li><li> Wassen met LiCl immuuncomplex Wash Buffer (eindconcentratie van 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 250 mM LiCl, 0,5% NP40 en 0,5% natrium deoxycholaat) gedurende 5 min bij 4 ° C met eind-over-eind rotatie. </li></ol></li><li> Na wassen zoals hierboven beschreven, voeg 200 ul elutieoplossing (eindconcentratie van 1% SDS en 100 mM natriumbicarbonaat) en incubate bij KT gedurende 15 min met end-over-end rotatie bij kamertemperatuur. </li><li> Spin de monsters bij 956 xg bij kamertemperatuur en breng het eluaat om een ​​nieuwe 1,5 ml buis. Herhaal stap 1,15 bijkomende 200 pl elutieoplossing. </li><li> Aan 400 pl van het eluaat, voeg NaCl tot een concentratie van 0,16 M en meng. <ol><li> Bovendien, voeg 400 ul elutieoplossing tot 10 gl ingang die is vernietigd (stap 1,11) en voeg NaCl tot een concentratie van 0,16 M tot verknopen ingangsmonsters omgekeerde ook. Omgekeerde verknopen de monsters door incubatie bij 65 ° C waterbad gedurende 5 uur. </li></ol></li><li> Voeg 1 ml 100% EtOH omgekeerd-verknoopte eluaat. Goed mengen en incuberen bij -80 ° C gedurende 2 - 3 uur of bij -20 ° CO / N. Spin de monsters bij 17.949 g gedurende 15 min en gooi ethanol. </li><li> Voeg 800 ui 70% ethanol om de pellet te wassen. Spin bij 17.949 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en werp ethanol. Spin kort om alle resterende ethanol te verwijderen. Lucht-drogen van de monsters bij 37 ° C gedurende 10 min om achtergebleven ethanol te verwijderen. </li><li> Los DNA in 90 pl RNase en DNase-vrij water en voeg 2 ul 10 mg / ml RNase in een 0,2 mg / ml eindconcentratie. Incubeer bij 37 ° C in een waterbad gedurende 30 min. </li><li> Voeg 10 ul 10x Proteinase K Buffer (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 5% SDS). Meng goed en voeg 1 pl proteïnase K. Incubeer bij 42 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Zuiver ingang en ChIP DNA met commerciële PCR zuivering kit volgens het protocol van de fabrikant en elueer DNA in 50 pl water. WINKEL DNA bij -20 ° C tot verder gebruik. </li></ol> 2. Slot Blot analyse van ChIP DNA <ol><li> Meet de opbrengst invoer- en ChIP DNA geëlueerd in 50 pi water zoals beschreven in stap 1,22 met behulp van een spectrofotometer bij 280 nm volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Neem gelijke volumes (50 pl) van ingang of immunologisch neergeslagen DNA die binnen het lineaire traject van detectie. <ol><li> Bijvoorbeeld, als ingangDNA-opbrengst is 1,5 ng / ul, vervolgens 30 ul (of 45 ng totaal DNA) en maak het volume tot 50 pi met water. Voor factor ChIP, neem de volledige 50 ul eluaat van stap 2.1 en ga verder met stap 2.3. </li></ol></li><li> Denatureren 50 gl input of immunologisch neergeslagen DNA door het toevoegen van 2,5 volumina 0,4 N NaOH kort vortex en centrifugeer 956 xg gedurende 10 sec, en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Neutraliseer het gedenatureerde DNA door het toevoegen van 175 ui 1 M Tris-HCl, pH 6,8, vortex, centrifugeer 956 xg gedurende 10 seconden en zet de monsters op ijs. </li><li> Bereid een seriële verdunning van input en immunologisch neergeslagen DNA voor de Slot Blot analyse zoals hieronder beschreven. <ol><li> Volg stap 2,3 - 2,4 op een totaal monstervolume van 350 pi te krijgen (dat wil zeggen 50 ul Input / ChIP DNA, 125 ui 0,4 N NaOH, 175 ui 1 M Tris-HCl, pH 6,8). Opmerking: Voor boven de instantie aangegeven, zal 45 ng ingang DNA uiteindelijk 0,129 ng / ul. </li><li> Voor input DNA, label drie buiss en 100, 50 en 25 en voeg 100 ul, 50 ul en 25 ul van het gedenatureerde en geneutraliseerde DNA monster. Maak de uiteindelijke volume tot 100 ul met nuclease-vrij water. Voor ChIP DNA, label drie buizen 200, 100 en 50 en voeg 200 ul, 100 pi en 50 pi van het gedenatureerde en geneutraliseerde DNA-monster. Maak uiteindelijke volume tot 200 ul met nuclease gratis water. </li></ol></li><li> Knip het membraan om de grootte van het Slot Blot inrichting. Pre-nat het membraan en blotting papers in 20x SSC vóór en voorafgaand aan het toevoegen DNA. Monteer ze in de sleuf Blot volgens protocol van de fabrikant. </li><li> Pipet DNA uit stap 2.5.2 in de juiste sleuven. Breng vacuüm langzaam aan het DNA op de zeta-probe membraan trekken. Stop vacuüm nadat alle monsters door de apparatuur geleid. <ol><li> Demonteer de inrichting onmiddellijk immobiliseren van het DNA op het membraan met UV crosslinker. Hebben de DNA-kant naar boven in het UV crosslinker en het gebruik van de autocrosslink instelling in het verknopingsmiddel. Volg protocol van de fabrikant. </li></ol></li><li> Detecteren BrdU het slot blot door het uitvoeren van western blotting. <ol><li> Blokkeer het membraan met 5% vetvrije droge melk in PBS met 0,1% Tween-20 (PBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur werd het niet-specifieke binding van antilichamen aan het membraan voorkomen. </li><li> Add primaire anti-BrdU-antilichaam (1: 500 verdunning) verdund in 1% niet-vette droge melk in PBST en incubeer de blot met het primaire antilichaam gedurende 3 uur bij kamertemperatuur op een shaker. Was het membraan met PBST driemaal na het primaire antilichaam incubatie. </li><li> Add HRP-geconjugeerd anti-muis secundair antilichaam aan de blot (1: 5000 verdunning) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was het membraan met PBST driemaal na het secundaire antilichaam incubatie. OPMERKING: Gebruik voldoende volume van de antilichamen volledig te bedekken het membraan tijdens de primaire en secundaire antilichaam incubaties. </li></ol></li><li> Bereid de ECL mix en voeg deze toe aan de vlek acgens het protocol van de fabrikant. Incubeer het membraan met ECL mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. <ol><li> Plaats het membraan in een röntgencassette, het membraan naar de röntgenfilm bloot te stellen en te ontwikkelen met behulp blot protocol van de fabrikant. </li><li> Kwantificeren van het verkregen signaal voor invoer en chiped DNA na het scannen van de blots met de Image J software volgens het protocol van de fabrikant. Voor kwantificering gebruikt het signaal dat binnen het lineaire traject van detectie teneinde de nauwkeurigheid van de meting te waarborgen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX+Phosphorylation%3A+Its+Role+in+DNA+Damage+Response+and+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy.</a> J nucleic acids. , (2010).</li>
<li>Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+challenges+during+DNA+replication+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin challenges during DNA replication and repair.</a> 128, 721-733 (2007).</li>
<li>Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodelling+and+DNA+replication%3A+from+nucleosomes+to+loop+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains.</a> Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+histone+deacetylase+3+reveals+critical+roles+in+S+phase+progression+and+DNA+damage+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control.</a> Mol Cell. 30, 61-72 (2008).</li>
<li>Bhaskara, S., Hiebert, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+histone+deacetylase+3+in+maintenance+of+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability.</a> Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+maintain+S-phase+chromatin+and+DNA+replication+fork+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression.</a> Epigenetics Chromatin. 6, 27(2013).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hdac3+is+essential+for+the+maintenance+of+chromatin+structure+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability.</a> Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).</li>
<li>Johnson, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC1%2C2+inhibition+impairs+EZH2-+and+BBAP-mediated+DNA+repair+to+overcome+chemoresistance+in+EZH2+gain-of-function+mutant+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma.</a> Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).</li>
<li>Bhaskara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+regulate+DNA+replication+and+DNA+repair%3A+potential+targets+for+genome+stability-mechanism-based+therapeutics+for+a+subset+of+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers.</a> Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).</li>
<li>Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplication+and+maintenance+of+heterochromatin+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Duplication and maintenance of heterochromatin domains.</a> J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).</li>
<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492, 280-284 (2012).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).</li>
</ol>

Ik heb geen concurrerende financiële belangen.

De in dit manuscript beschreven protocol is een relatief snelle methode om de aanwezigheid van eiwitten of hun post-translationeel gemodificeerde vormen van nieuw gerepliceerd of ontluikende DNA tonen. Bovendien, deze techniek maakt het mogelijk een aan de vereniging-dissociatie kinetiek van een eiwit of zijn gemodificeerde vorm met ontluikende DNA meten. Deze techniek is een aanvulling op de elegante iPOND technologie 13. In de iPOND technologie, is nieuw gesynthetiseerde DNA gelabeld met ethyl deoxyuridine ...

Defecte DNA herstel en / of DNA-replicatie zijn een belangrijke oorzaak van instabiliteit van het genoom, die celdood kunnen veroorzaken. Een enkele unrepaired double strand break voldoende is om celdood te 1 veroorzaken. Chromatine organisatie transient gewijzigd tijdens zowel de replicatie en reparatie 2,3 en niet epigenetische informatie behouden tijdens deze processen leidt tot een bedreiging voor de integriteit genoom. Verlies van HDAC3 of HDAC1,2 functie belemmert de S-fase progressie, DNA-replicatie en reparatie leidt tot genotoxische stress (DNA schade) en celdood 4-9. Daarom is een praktische strategie om selectieve HDAC inhibitoren replicatie, reparatie en chromatine verstoren kankercellen en DNA-schade veroorzaken, wat weer kan stoppen de groei en celdood selectief snel groeiende kankercellen. Tijdens de DNA-replicatie, wordt chromatine snel gedemonteerd en daarna weer in elkaar gezet na DNA-duplicatie. Nieuw synthesized histon H4 wordt geacetyleerd op K5 en K12 residuen (H4K5K12ac) en na depositie op chromatine, zijn ze snel gedeacetyleerd door histondeacetylasen (HDAC) 10,11. Niet-cellen ontluikende chromatine integriteit van histondeacetylering handhaven kan leiden tot splitsing instorten, wat weer kan leiden tot DNA-schade en celdood. We hebben onlangs bleek dat de selectieve remming van HDAC1,2 verhoogt histonacetylering (H4K5ac, H4K12ac en H4K16ac) en remt SMARCA5 chromatine remodeler activiteit op ontluikende chromatine, die correleert met verminderde progressie replicatievork, verhoogde vork instorting en verhoogde replicatie stress-geïnduceerde DNA-schade 6 . Aldus kunnen HDAC remmer ontluikende chromatinestructuur te veranderen op DNA-schade en de dood veroorzaken zeer snel in kankercellen, omdat deze cellen snel cyclus en langs vele malen via de S-fase. Daarom is het belangrijk om te begrijpen hoe HDACs functie om histonacetylering en eiwitten bindi regulerenng DNA replicatie in zoogdiercellen te handhaven. Om kwantitatief de hoeveelheid histonacetylering en SMARCA5 chromatine remodeler geassocieerd met ontluikende DNA tijdens de DNA-replicatie te meten, hebben we bedacht een aangepaste chip test genaamd de BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek. Na chromatine immunoprecipitatie (ChIP) van een gewenst proteïne of histonmodificatie de hoeveelheid ontluikende DNA (geëtiketteerd met thymidine analoog BrdU) in het ChIP monster kan worden gedetecteerd met Western analyse van BrdU gelabelde ChIP DNA overgebracht op een membraan met behulp van een Groef Blot apparaat. Met deze techniek hebben we aangetoond dat H4K16ac (een markering die deze chromatine verpakking) en ISWI familielid SMARCA5 (SWI / SNF gerelateerde matrix geassocieerde actine afhankelijke regulator van chromatine) chromatine remodeler geassocieerd met ontluikende DNA in S-fasecellen 6. We vonden ook dat de ontluikende H4K16ac merk wordt gedeacetyleerd door HDAC1,2 tijdens de DNA-replicatie 6. H4K16ac remtchromatine remodeler activiteit van het ISWI familielid SMARCA5 12. Vandaar dat het gebruik van de BrdU-CHIP-Slot-Westerse techniek konden we de functies voor HDAC1,2 bij het reguleren van chromatine remodeling tijdens de DNA-replicatie te sluiten. Vandaar dat de BrdU-ChIP-Slot-Western Blot techniek is een krachtige aanpak van de associatie en dissociatie dynamiek van eiwitten of hun post-translationele modificaties die zijn gebonden aan ontluikende DNA kwantitatief te meten.

<table><tbody><tr><td>Anti-BrdU (westerns)</td><td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H4K16ac</td><td>Active Motif</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Zeta-Probe GT Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Protein A agarose</td><td>Millipore</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Corporation</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-treated water</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Mallinckrodt GenAR&nbsp;</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Life Technologies</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Lab Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>X-ray film</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier&nbsp; Digital Ultrasonic Cell Disruptor</td><td>Model: 450</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Model: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>Model: 2322</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 spectrophotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>Model: 1000</td><td></td></tr><tr><td>Slot Blot apparatus&nbsp;</td><td>Schleicher and Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators</td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoek van eiwitten gebonden aan ontluikende dna in zoogdiercellen met behulp van brdu-chip-slot-westerse techniek

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histondeacetylase 1 en 2 (HDAC1,2) lokaliseren op de plaatsen van DNA-replicatie. In het vorige onderzoek met behulp van een selectieve remmer en een genetisch knockdown systeem, toonden wij nieuwe functies HDAC1,2 in replicatievork progressie en ontluikende chromatine onderhoud in zoogdiercellen. Daarnaast gebruikten we een BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek die chromatine immunoprecipitatie (ChIP) van broom-deoxyuridine (BrdU) -gemerkte DNA combineert met slot blot en westerse analyses kwantitatief eiwitten of histonmodificatie geassocieerd met ontluikende DNA meten. Actief delende cellen werden behandeld met HDAC1,2 selectieve remmer of getransfecteerd met siRNA tegen HDAC1 en HDAC2 en nieuw gesynthetiseerde DNA werd gemerkt met thymidine analoge broomdeoxyuridine (BrdU). De BrdU labeling werd uitgevoerd op een tijdstip waarop er geen significant celcyclus of apoptose door het verlies van HDAC1,2 functies. Volgende lAbeling van cellen met BrdU, chromatine immunoprecipitatie (ChIP) van histonacetylering merken of de chromatine-remodeler werd uitgevoerd met specifieke antilichamen. BrdU-gelabelde DNA ingang en immunogeprecipiteerd (of chiped) DNA werd vervolgens door aanstippen op een membraan met het slot blot-techniek en geïmmobiliseerd met UV. De hoeveelheid DNA in elke ontluikende slot werd vervolgens kwantitatief bepaald met behulp van Western-analyse met een anti-BrdU-antilichaam. Het effect van het verlies van HDAC1,2 functies op het niveau van nieuw gesynthetiseerde DNA-geassocieerde histonacetylering merken en chromatine remodeler werd vervolgens bepaald door het normaliseren van de BrdU-ChIP signaal afkomstig van behandelde monsters naar de controlemonsters.

Om de specificiteit van HDAC1,2-selectieve remmers te bepalen, werden Hdac1,2 FL / FL en Hdac3 FL / FL fibrosarcoomcellen gebruikt. Adenovirus-bevattende Cre recombinase (Ad-Cre) werd gebruikt om Hdac1,2 en Hdac3 verwijderen in deze cellen. Volgende Ad-Cre infectie van Hdac1,2 FL / FL cellen, een robuuste toename H4K5ac waargenomen. Behandeling van Hdac1,2 knockout cellen met 233 ...

In dit protocol beschrijven we een nieuwe BrdU-ChIP-Slot-Western techniek om eiwitten en histonmodificaties te onderzoeken die geassocieerd zijn met nieuw gesynthetiseerd of nagenoeg DNA.

Onderzoek van eiwitten gebonden aan ontluikende DNA in zoogdiercellen met behulp van BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Het algemene doel van deze procedure is om eiwitten gebonden aan navormend DNA snel en nauwkeurig te onderzoeken met behulp van BrdU-labeling en chromatineprecipitatie. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden op het gebied van replicatie en reparatie in chromatine, zoals welke eiwitten gebonden zijn aan navormend DNA tijdens DNA-replicatie en welke reparatie-eiwitten gebonden zijn aan navormend DNA tijdens replicatiestress. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een relatief snelle methode is om eiwitten gebonden aan navormend DNA op een zeer kwantitatief niveau te detecteren.Om te beginnen, zet je culturen op van twee miljoen NIH 3T3 cellen in 10 milliliter media met ofwel DMSO of remmer. Voeg ook BrdU toe tot een eindconcentratie van 20 micromolar. Nadat ze zijn geplaatst, incubeer je de cellen gedurende 60 minuten.Na een uur, crosslink je de intracellulaire eiwitten aan het DNA door formaldehyde direct toe te voegen aan het kweekmedium tot een concentratie van 1%in volume. Laat de cellen vervolgens 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur met schudden. Na 10 minuten, blus je de reactie door glycine toe te voegen aan het media tot 125 millimolar en vervolg je de incubatie nog vijf minuten.Verzamel vervolgens de cellen in PBS en was ze twee keer met PBS door centrifugatie. De pellet kan eventueel worden ingevroren bij 80 graden Celsius voor opslag. Bereid nu het lysate van de gecrosslinkte cellen, voeg 500 microliter FA140-buffer aangevuld met het protease-remmercocktail toe aan de pellet en scheer het chromatine met behulp van vijf 15-seconde pulsen sonicatie.Houd de cellen gekoeld tussen de pulsen. Voer vervolgens 10 microliter van het monster uit op een 1,5%gel om de efficiëntie van het scheren te diagnosticeren. Nadat ze zijn gescheerd, centrifugeer je de monsters gedurende 10 minuten en breng je het supernatant over naar een nieuw buisje.Schat vervolgens de eiwitconcentratie in het supernatant met behulp van een kit. Bereid vervolgens een 50% slurry van Protein A Agarose-kralen met FA140-buffer bevattende protease-remmer. Voeg 50 microliter van de slurry toe aan elk monster en incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 4 graden Celsius met constante eind-over-eind rotatie.Na een half uur, centrifugeer je de monsters een minuut rond de 1000 G's in een gekoelde centrifuge. Verzamel vervolgens het supernatant dat het gelabelde chromatine bevat. Voordat je verdergaat, bewaar 1/10e van het extract bij 20 graden Celsius om later te dienen als inputcontrole.Om het chromatine te immunoprecipiteren, voeg je acht microliter H4K16ac-antilichaam of vijf microgram SMARCA5-antilichaam toe aan de supernatanten. Voeg ook vijf microgram snel IgG toe aan het extract dat als negatieve controlemonster dient. Incubeer het chromatine bij 4 graden Celsius een nacht lang op een rotisseriemixer.De volgende dag, voeg je 50 microliter van de bereide 50% Protein A Agarose slurry toe aan de immunoprecipitaties en incubeer je de mengsels gedurende een uur bij 4 graden Celsius met rotatie. Na een uur, pellet je de Agarose-kralen en gooi je voorzichtig het supernatant weg. Was nu de kralen met behulp van eind-over-eind rotaties bij 4 graden Celsius in drie opeenvolgende buffers.Eerst, gebruik je vers bereid, laag-zout immuuncomplex wasbuffer gedurende vijf minuten. Ten tweede, gebruik je vers bereid, hoog-zout immuuncomplex wasbuffer gedurende vijf minuten. Ten derde, gebruik je vers bereid, Lithiumchloride immuuncomplex wasbuffer gedurende vijf minuten.Na het wassen, voeg je elutieoplossing toe aan de monsters zoals beschreven in de tekst. Centrifugeer de monsters en breng het eluaat over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis. Incubeer nu de monsters gedurende 5 uur bij 65 graden Celsius om de crosslinking om te draaien.Later, precipiteer je het DNA. Voeg een milliliter 100% ethanol toe aan de monsters en meng goed. Incubeer vervolgens gedurende twee tot drie uur bij 80 graden Celsius of overnacht bij 20 graden Celsius.Na de precipitatie, verwijder je het ethanol met een 15-minuten centrifugatie bij 18000 G's. Was vervolgens het pellet, behandel de monsters met RNase, vervolgens met Proteinase K, zuiver DNA zoals beschreven in de tekst en bewaar tenslotte bij 20 graden Celsius. Om te beginnen, meet je het rendement van input en ChIP DNA op een spectrofotometer.Ontbind vervolgens de monsters. Voeg 2,5 volumes 0,4 normaal natriumhydroxide toe, vortex kort, centrifugeer en incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Neutraliseer vervolgens het gedenatureerde DNA door 175 microliter een molair Tris hydochloride pH 6,8 toe te voegen.Vortex, centrifugeer en plaats de monsters op ijs. Bereid nu seriële verdunningen van het input en immunoprecipiteerde DNA en ga verder met de slot-blot assay zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat het DNA op de blot is UV geïmmobiliseerd, detecteer je de BrdU op de slotblot met behulp van western blotting.Blok eerst de membraan met 5%magere droge melk in PBST gedurende een uur bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding te voorkomen. Bereid vervolgens een bad van 1%magere droge melk in PBST met toegevoegd 1:500 verdund anti-BrdU-antilichaam. Incubeer de blot in dit bad gedurende drie uur bij kamertemperatuur op een shaker.Was vervolgens de membraan drie keer met PBST. Dompel vervolgens de blot in een 1:5000 verdunning van HRP-geconjugeerd anti-muis secundair antilichaam in PBST. Incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur met schudden.Gebruik drie wasbeurten met PBST om de secundaire te verwijderen en analyseer het resultaat. De BrdU H4K16ac ChIP slot western techniek werd gebruikt om de hoeveelheid H4K16ac geassocieerd met navormend DNA te bepalen. Er werd een robuuste verrijking waargenomen in H4K16ac geassocieerd met navormend DNA in vergelijking met de snelle IgG controle.Na remming van HDAC1/2 met verbinding 23

examination-proteins-bound-to-nascent-dna-mammalian-cells-using-brdu

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het bepalen van de celcyclus positie van een populatie van cellen, of begrijpen hoe signalen proliferatie van invloed zijn, gemakkelijk kan worden gemeten door middel van flowcytometrie gebruik van dit protocol. We brengen verslag uit een eenvoudige experimentele benadering voor vlekken cellen en kwantificeren van hun positie in de cel cyclus.

Analyse van celcyclus Positie in zoogdiercellen

Een kwantitatieve methode voor de analyse van chromosoom replicatie timing beschreven. De werkwijze gebruikt BrdU opname in combinatie met...

Chromosoom repliceren Timing In combinatie met TL-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

This video describes the protocol for BrdU immunofluorescence staining. The technique allows the identification of cells in different phases of cell cycle. Addition of DNA dyes and antibody labeling allows the detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

BrdU Immunofluorescence Staining: A Technique to Identify Cells in Different Phases of Cell Cycle

Deze video artikel beschrijft een in vitro microarray gebaseerde methode om het gen doelstellingen en bindingsplaatsen bepalen voor twee componenten systeem respons toezichthouders.

DNA-affiniteit-gezuiverd Chip (DAP-chip) methode om Gene Doelen bepalen voor bacteriële Twee componenten Regulatory Systems

Een systeem voor het opwekken van laesies op de gedefinieerde regio sub nucleaire's vereist studeren DNA schade reparatie kinetiek. Beschrijven we een methode om gelokaliseerde double-stranded einden met behulp van een laser-scanner confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser maken en leveren van geautomatiseerde procedures om te kwantificeren van de dynamiek van reparatie factoren bij deze letsels.

Onderzoek van eiwit werving aan DNA laesies met behulp van 405 Nm Laser-Micro-bestraling

Ribonucleotides behoren tot de meest voorkomende niet-canonieke nucleotiden in het genoom opgenomen tijdens de eukaryote nucleair DNA-replicatie. Als het niet correct is verwijderd, kan ribonucleotides DNA-beschadiging en mutagenese veroorzaken. Hier presenteren we twee experimentele benaderingen die worden gebruikt voor het beoordelen van de overvloed van ribonucleotide opneming in DNA en zijn mutagene effecten.

Studeren Ribonucleotide opneming: Strand-specifieke detectie van Ribonucleotides in het genoom van de gist en het meten van Ribonucleotide-geïnduceerde mutagenese

In dit protocol laten we zien hoe dna dubbelstrengs eindresectie tijdens de S/G2-fase van de celcyclus kan worden gevisualiseerd met behulp van een op immunofluorescentie gebaseerde methode.

Beoordeling van wereldwijde DNA double-strand eindresectie met behulp van BrdU-DNA-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging

Het huidige protocol belicht een gemodificeerde methode voor het detecteren en kwantificeren van DNA-eiwit crosslinks (DPC's) en hun posttranslationele modificaties (PTM's), waaronder ubiquitylering, SUMOylation en ADP-ribosylatie geïnduceerd door topoisomeraseremmers en door formaldehyde, waardoor de vorming en reparatie van DPC's en hun PTM's kan worden bestudeerd.

Kwantitatieve detectie van DNA-eiwit crosslinks en hun posttranslationele modificaties

Het volgende protocol presenteert de detectie van enkelstrengs DNA-foci in de G1-fase van de celcyclus met behulp van celcyclussynchronisatie gevolgd door RPA2-immunofluorescerende kleuring.

Visualisatie van enkelstrengs DNA-foci in de G1-fase van de celcyclus

Verrijking en sequentiebepaling van proteïne-geassocieerd nieuwvormings-DNA (eSPAN) is ontwikkeld om de relatieve abundantie van een chromatine-geassocieerd eiwit op twee replicerende DNA-strengen te detecteren, waardoor moleculaire inzichten in chromatine-replicatie en de gekoppelde processen worden onthuld. Dit protocol beschrijft eSPAN-procedures in gist- en muis embryonale stamcellen (ES).

Strandspecifieke analyse van eiwitten bij replicatie van DNA-strengen door verrijking en sequentiebepaling van eiwit-geassocieerd naissant DNA-methode

Laminopathiestoornissen leiden vaak tot veranderingen in de nucleaire envelop, wat nucleaire blebbing en lekkage kan veroorzaken. Deze studie presenteert een immunofluorescentiemethode om de nucleaire lamina samen met dubbelstrengs DNA (dsDNA) te visualiseren, wat een middel biedt om de nucleaire structuur en integriteit in zoogdiercellen te beoordelen.

Detectie van nucleaire bloedingen en DNA-lekkage in zoogdiercellen door immunofluorescentie

Leer de BrdU-ChIP-Slot-Western techniek om eiwitten gebonden aan ontluikend DNA in zoogdiercellen te onderzoeken. Deze methode biedt snelle, kwantitatieve detectie van DNA-replicatie en reparatieprocessen.

Onderzoek van eiwitten gebonden aan ontluikende DNA in zoogdiercellen met behulp van BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek

Meer video's verkennen