Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo's
February 22nd, 2016
Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.
Het algemene doel van dit protocol is om eiwitniveaus in situ te kwantificeren in muizenpreimplantatie-embryo's. Dus deze methode stelt ons in staat om high-throughput analyse van confocale microscopie-beelden met enkelcelligheid uit te voeren op een semi-automatische manier. Deze methode kan worden gebruikt om eiwitconcentraties op confocale beelden te kwantificeren waar er een hoge nucleaire dichtheid is en wanneer men heterogeniteiten binnen celpopulaties wil bestuderen.
Gebruik om te beginnen een open vlam op een glazen Pasteur-pipet om een capillair uiteinde aan de punt te trekken. Wrijf voorzichtig over het verre uiteinde van de pipet tegen het capillair, om het te breken terwijl een stomp uiteinde wordt gecreëerd. Nadat een zwangere vrouwelijke muis is opgeofferd op de gewenste embryonale ontwikkelingsdag, legt u de buikholte bloot volgens het tekstprotocol en lokaliseert u de baarmoeder.
Houd de cervicale kant vast, snijd door de baarmoederhals en trek voorzichtig omhoog om beide baarmoederhoorns uit te rekken. Snijd het vet eraf, zorg ervoor dat u de baarmoederwand niet doorboort. Snijd boven de eileiders, onder de eierstokken, om de hele baarmoeder vrij te maken en plaats deze op een petrischaal.
Bedek vervolgens de baarmoeder met PBS en scheid beide baarmoederhoorns door op beide zijden van de baarmoederhals door het proximale uiteinde te snijden. Scheid vervolgens elke eileider van de baarmoeder door onder de isthmus die ze verbindt te snijden. Gebruik onder een dissectiemicroscoop een enkele mL spuit met een hypodermische naald om de blastocysten uit de baarmoeder en in manipulatiemedium te spoelen, door 0,5-1 mL medium door elke hoorn vanaf de cervicale opening te forceren.
Laat de blastocysten maximaal een tot twee minuten zinken naar de bodem van de schaal na het spoelen. Lokaliseer vervolgens de blastocysten en gebruik met behulp van een mondgestuurde glazen Pasteur-pipet met een capillaire punt de blastocysten te verzamelen en overbrengen naar een verse druppel medium. Na het spoelen van de blastocysten, verwijder de zona pellucida door Acidic Tyrode's Solution te gebruiken om de embryo's kort te wassen.
Zodra de zona niet meer zichtbaar is, brengt u de blastocysten terug naar manipulatiemedium. Was de blastocysten in PBS bij kamertemperatuur en fixeer ze door overbrengen naar 4% PFA in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na fixatie, brengt u de blastocysten terug naar PBS voor opslag bij vier graden Celsius.
Nadat imunofluorescentie is uitgevoerd volgens het tekstprotocol, gebruikt u een fijne mondpipet om microdruppels PBS of nucleaire kleuroplossing op het glazen oppervlak van een 35 mm glazen bodemschaal te maken en bedekt u deze met minerale olie. Plaats de embryo's in de microdruppels en rangschikt ze op een consistente manier, bij voorkeur met de ICM-holte toegang parallel aan het glazen oppervlak, zet vervolgens de schaal op de microscoophouder. Om confocale beeldvorming uit te voeren, gebruikt u de laagste laservermogen die een sterk signaal-ruisverhouding biedt zonder de fluoroforen te bleken.
Pas de versterking en offset aan om het breedste dynamische bereik te verkrijgen zonder het monster over te belichten. Het vastleggen van de meeste of het volledige grijstintenbereik zal de detectie van kleine verschillen in intensiteit tussen afbeeldingen vergemakkelijken. Volg de aanvullende details die in het tekstprotocol zijn geschetst om embryo's door de gehele Z-as te beeldvormen.
Volg de grafische gebruikersinterface van de MATLAB-gebaseerde segmentatietool Modular Interactive Nuclear Segmentation, of MINS, om een confocale afbeelding of een gehele Z-stack van ruwe gegevens gegenereerd door de microscoop te laden. Om het resultaat van elke stap te bekijken, klikt u op de overeenkomstige 'Bekijk' knop. Een gele tag boven de knop geeft aan dat de bewerking aan de gang is.
Een groene tag geeft aan dat de bewerking is voltooid. Beoordeel het resultaat van de detectiestap voordat u doorgaat naar segmentatie. Als het niet bevredigend is, wijzigt u de detectieparameters en voert u deze opnieuw uit.
Klik vanuit het menu 'Batchmodus' op 'Bestanden toevoegen' en laad alle bestanden die tegelijkertijd moeten worden verwerkt. Klik op 'Batchmodus starten' en geef de tijd voor de software om de bestanden te verwerken. De segmentatie-uitvoer wordt opgeslagen in dezelfde map als de originele bestanden.
Identificeer valse positieven zoals apoptotische vesikel of andere elementen die geen intacte kernen zijn, maar wel als zodanig door MINS zijn geïdentificeerd. Verwijder de overeenkomstige records voor valse positieven uit het starstatistics. csv-bestand.
Bewaar het originele starstatistics. csv-bestand voor toekomstig gebruik en bewerk slechts een kopie ervan. Als een kern oversegmenteerd is en als twee of meer kernen wordt gepresenteerd, kunt u de records samenvoegen door hun intensiteitsniveau te gemiddelen, of één van de records voor die cel behouden en de rest verwijderen.
Om ondersegmentatie op te lossen, identificeert u gebeurtenissen waarbij MINS heeft gefaald om de grens tussen twee of meer kernen te detecteren en ze als één segmenteerde, of waarbij het een kern helemaal niet heeft gedetecteerd. Gebruik ImageJ om het gemiddelde grijze niveau voor elke kanaal in de onder- of ongesegmenteerde cellen te meten. Zoek vervolgens een mediaal gedeelte van de onder- of ongesegmenteerde kern op het DNA-kanaal, gebruik de freehand selectietool, omlijn de omtrek van de onder- of ongesegmenteerde kern.
Druk vervolgens op Control M' of ga naar het 'Analyse' menu en selecteer 'Meet'. Dit zal de gemiddelde grijze waarde voor het omlijnde gebied registreren en deze weergeven in een nieuw venster. Gebruik het zelfde omlijnde gebied dat net is geselecteerd in het DNA-kanaal, herhaal de meting van elk van de fluorescence kanalen van belang. De resultaten worden op de vorige in het venster met meetresultaten geplaatst.
Gebruik vervolgens de verkregen metingen om de foutieve records in het starstatistics. csv-bestand te vervangen. Als de kern ondersegmenteerd is gedupliceerd u de rij, wijst u verschillende cel-ID's toe aan elke nieuwe cel en introduceert u de waarden verkregen in ImageJ
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol presenteert een methode om kwantitatieve, single-cell in situ analyse van eiwitexpressie uit te voeren om lijnspecificatie in muis pre-implantatie embryo's te bestuderen. De methode maakt hoog-doorvoer analyse van confocale microscopie beelden met single-cell resolutie mogelijk.
Belangrijkste Onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Kwantificering van eiwitniveaus in situ is cruciaal voor het begrijpen van embryonale ontwikkeling.
- Single-cell resolutie helpt bij het bestuderen van heterogeniteiten binnen celpopulaties.
- Confocale microscopie is een krachtig hulpmiddel voor het beeldvormen van cellulaire structuren.
- Deze methode is toepasbaar op muis pre-implantatie embryo's.
Doel van het Onderzoek
- Om eiwitconcentraties in muis pre-implantatie embryo's te kwantificeren.
- Om lijnspecificatie tijdens vroege ontwikkeling te analyseren.
- Om het begrip van cellulaire heterogeniteit in embryonale weefsels te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Verzameling van blastocysten van zwangere muizen.
- Whole-mount immunofluorescent detectie van eiwitten.
- Beeldvorming van monsters met behulp van confocale microscopie.
- Nucleaire segmentatie en beeldanalyse voor kwantificering.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle kwantificering van eiwitniveaus met single-cell resolutie.
- Identificatie van eiwitexpressiepatronen in pre-implantatie embryo's.
- Inzichten in lijnspecificatie tijdens vroege ontwikkeling.
- Aangetoond hoog-doorvoer capaciteiten van de methode.
Conclusies
- Deze methode biedt een robuuste aanpak voor het bestuderen van eiwitexpressie in embryo's.
- Het vergemakkelijkt het begrip van ontwikkelingsprocessen op cellulair niveau.
- Het protocol kan worden aangepast voor verschillende eiwitten van belang.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative single-cell protein expression analysis in preimplantation embryos enables mechanistic de-risking of lineage specification hypotheses. This approach supports target validation by providing spatially resolved, quantitative data on nuclear markers critical for early developmental pathways. The method enhances predictive confidence in preclinical models by linking molecular heterogeneity to cell fate decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitation of multiple nuclear markers and their spatial coordinates in intact embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying protein expression patterns associated with lineage specification events.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating high-resolution, reproducible data on target engagement in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated biological systems with quantitative nuclear fluorescence readouts for downstream compound screening.
- Reproducibility: Enables standardized imaging and segmentation workflows that reduce variability in high nuclear density samples.
- Scalability: Supports platform reuse across embryonic stem cell colonies, differentiating cultures, and cross-species embryos with minimal adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase protein expression dynamics to preclinical validation through spatial and quantitative phenotyping.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in lineage commitment models by resolving heterogeneities within cell populations at single-cell resolution.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing objective thresholds for protein co-expression and localization in developmental pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven quantification of protein expression prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation through unsupervised nuclear segmentation and multi-channel fluorescence quantification.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs suitable for evaluating compound effects on embryonic protein expression networks.
- Analytics: Generates spatial (XYZ) coordinates and nuclear fluorescence levels per channel, enabling statistical comparison of expression states across conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery by linking protein expression patterns to lineage specification in disease-relevant developmental models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging and analysis capability for studying cellular heterogeneity in diverse preclinical systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in early lineage decisions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automated segmentation and minimal user input via MINS software.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in developmental pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, spatially resolved protein expression data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, immunofluorescence, and nuclear segmentation software.
- Depends on access to laser scanning confocal microscopes and MATLAB-based MINS tool for 3D image analysis.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, staining, and imaging protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations for varying nuclear density and signal-to-noise ratios across model systems.
- Limited by sample availability and the need for optimization when applying to non-embryonic or low-abundance targets.
