Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo's
22 februari 2016
Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.
Het algemene doel van dit protocol is om eiwitniveaus in situ te kwantificeren in muizenpreimplantatie-embryo's. Dus deze methode stelt ons in staat om high-throughput analyse van confocale microscopie-beelden met enkelcelligheid uit te voeren op een semi-automatische manier. Deze methode kan worden gebruikt om eiwitconcentraties op confocale beelden te kwantificeren waar er een hoge nucleaire dichtheid is en wanneer men heterogeniteiten binnen celpopulaties wil bestuderen.
Gebruik om te beginnen een open vlam op een glazen Pasteur-pipet om een capillair uiteinde aan de punt te trekken. Wrijf voorzichtig over het verre uiteinde van de pipet tegen het capillair, om het te breken terwijl een stomp uiteinde wordt gecreëerd. Nadat een zwangere vrouwelijke muis is opgeofferd op de gewenste embryonale ontwikkelingsdag, legt u de buikholte bloot volgens het tekstprotocol en lokaliseert u de baarmoeder.
Houd de cervicale kant vast, snijd door de baarmoederhals en trek voorzichtig omhoog om beide baarmoederhoorns uit te rekken. Snijd het vet eraf, zorg ervoor dat u de baarmoederwand niet doorboort. Snijd boven de eileiders, onder de eierstokken, om de hele baarmoeder vrij te maken en plaats deze op een petrischaal.
Bedek vervolgens de baarmoeder met PBS en scheid beide baarmoederhoorns door op beide zijden van de baarmoederhals door het proximale uiteinde te snijden. Scheid vervolgens elke eileider van de baarmoeder door onder de isthmus die ze verbindt te snijden. Gebruik onder een dissectiemicroscoop een enkele mL spuit met een hypodermische naald om de blastocysten uit de baarmoeder en in manipulatiemedium te spoelen, door 0,5-1 mL medium door elke hoorn vanaf de cervicale opening te forceren.
Laat de blastocysten maximaal een tot twee minuten zinken naar de bodem van de schaal na het spoelen. Lokaliseer vervolgens de blastocysten en gebruik met behulp van een mondgestuurde glazen Pasteur-pipet met een capillaire punt de blastocysten te verzamelen en overbrengen naar een verse druppel medium. Na het spoelen van de blastocysten, verwijder de zona pellucida door Acidic Tyrode's Solution te gebruiken om de embryo's kort te wassen.
Zodra de zona niet meer zichtbaar is, brengt u de blastocysten terug naar manipulatiemedium. Was de blastocysten in PBS bij kamertemperatuur en fixeer ze door overbrengen naar 4% PFA in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na fixatie, brengt u de blastocysten terug naar PBS voor opslag bij vier graden Celsius.
Nadat imunofluorescentie is uitgevoerd volgens het tekstprotocol, gebruikt u een fijne mondpipet om microdruppels PBS of nucleaire kleuroplossing op het glazen oppervlak van een 35 mm glazen bodemschaal te maken en bedekt u deze met minerale olie. Plaats de embryo's in de microdruppels en rangschikt ze op een consistente manier, bij voorkeur met de ICM-holte toegang parallel aan het glazen oppervlak, zet vervolgens de schaal op de microscoophouder. Om confocale beeldvorming uit te voeren, gebruikt u de laagste laservermogen die een sterk signaal-ruisverhouding biedt zonder de fluoroforen te bleken.
Pas de versterking en offset aan om het breedste dynamische bereik te verkrijgen zonder het monster over te belichten. Het vastleggen van de meeste of het volledige grijstintenbereik zal de detectie van kleine verschillen in intensiteit tussen afbeeldingen vergemakkelijken. Volg de aanvullende details die in het tekstprotocol zijn geschetst om embryo's door de gehele Z-as te beeldvormen.
Volg de grafische gebruikersinterface van de MATLAB-gebaseerde segmentatietool Modular Interactive Nuclear Segmentation, of MINS, om een confocale afbeelding of een gehele Z-stack van ruwe gegevens gegenereerd door de microscoop te laden. Om het resultaat van elke stap te bekijken, klikt u op de overeenkomstige 'Bekijk' knop. Een gele tag boven de knop geeft aan dat de bewerking aan de gang is.
Een groene tag geeft aan dat de bewerking is voltooid. Beoordeel het resultaat van de detectiestap voordat u doorgaat naar segmentatie. Als het niet bevredigend is, wijzigt u de detectieparameters en voert u deze opnieuw uit.
Klik vanuit het menu 'Batchmodus' op 'Bestanden toevoegen' en laad alle bestanden die tegelijkertijd moeten worden verwerkt. Klik op 'Batchmodus starten' en geef de tijd voor de software om de bestanden te verwerken. De segmentatie-uitvoer wordt opgeslagen in dezelfde map als de originele bestanden.
Identificeer valse positieven zoals apoptotische vesikel of andere elementen die geen intacte kernen zijn, maar wel als zodanig door MINS zijn geïdentificeerd. Verwijder de overeenkomstige records voor valse positieven uit het starstatistics. csv-bestand.
Bewaar het originele starstatistics. csv-bestand voor toekomstig gebruik en bewerk slechts een kopie ervan. Als een kern oversegmenteerd is en als twee of meer kernen wordt gepresenteerd, kunt u de records samenvoegen door hun intensiteitsniveau te gemiddelen, of één van de records voor die cel behouden en de rest verwijderen.
Om ondersegmentatie op te lossen, identificeert u gebeurtenissen waarbij MINS heeft gefaald om de grens tussen twee of meer kernen te detecteren en ze als één segmenteerde, of waarbij het een kern helemaal niet heeft gedetecteerd. Gebruik ImageJ om het gemiddelde grijze niveau voor elke kanaal in de onder- of ongesegmenteerde cellen te meten. Zoek vervolgens een mediaal gedeelte van de onder- of ongesegmenteerde kern op het DNA-kanaal, gebruik de freehand selectietool, omlijn de omtrek van de onder- of ongesegmenteerde kern.
Druk vervolgens op Control M' of ga naar het 'Analyse' menu en selecteer 'Meet'. Dit zal de gemiddelde grijze waarde voor het omlijnde gebied registreren en deze weergeven in een nieuw venster. Gebruik het zelfde omlijnde gebied dat net is geselecteerd in het DNA-kanaal, herhaal de meting van elk van de fluorescence kanalen van belang. De resultaten worden op de vorige in het venster met meetresultaten geplaatst.
Gebruik vervolgens de verkregen metingen om de foutieve records in het starstatistics. csv-bestand te vervangen. Als de kern ondersegmenteerd is gedupliceerd u de rij, wijst u verschillende cel-ID's toe aan elke nieuwe cel en introduceert u de waarden verkregen in ImageJ
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol presenteert een methode voor het uitvoeren van een kwantitatieve in situ single-cell analyse van eiwitexpressie om lijnspecificatie in pre-implantatie embryo's van muizen te bestuderen. De methode maakt een high-throughput analyse van confocale microscopiebeelden met single-cell resolutie mogelijk.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Het kwantificeren van eiwitniveaus in situ is essentieel voor het begrijpen van de embryonale ontwikkeling.
- Resolutie op enkelcelniveau helpt bij het bestuderen van heterogeniteiten binnen celpopulaties.
- Confocale microscopie is een krachtig instrument voor het afbeelden van cellulaire structuren.
- Deze methode is toepasbaar op preimplantatie-embryo's van muizen.
Doel van de studie
- Om proteïneconcentraties in preimplantatie-embryo's van muizen te kwantificeren.
- Om de lineagespecificatie tijdens de vroege ontwikkeling te analyseren.
- Om het begrip van cellulaire heterogeniteit in embryonale weefsels te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van blastocysten uit drachtige muizen.
- Whole-mount immunofluorescentie-detectie van eiwitten.
- Beeldevorming van monsters met behulp van confocale microscopie.
- Nucleaire segmentatie en beeldanalyse voor kwantificering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van eiwitgehaltes op single-cell resolutie.
- Identificatie van eiwitexpressiepatronen in preimplantatie-embryo's.
- Inzichten in lijn-specificatie tijdens de vroege ontwikkeling.
- Aantoonbare high-throughput mogelijkheden van de methode.
Conclusies
- Deze methode biedt een robuuste benadering voor het bestuderen van eiwitexpressie in embryo's.
- Het vergemakkelijkt het begrip van ontwikkelingsprocessen op cellulair niveau.
- Het protocol kan worden aangepast voor verschillende eiwitten van belang.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Kwantitatieve analyse van eiwitexpressie op single-cell niveau in pre-implantatie embryo's maakt het mogelijk om mechanistische risico's van hypothesen over lijnspecificatie te verminderen. Deze benadering ondersteunt target-validatie door ruimtelijk opgeloste, kwantitatieve gegevens te leveren over nucleaire markers die cruciaal zijn voor vroege ontwikkelingspaden. De methode vergroot de voorspellende betrouwbaarheid in preklinische modellen door moleculaire heterogeniteit te koppelen aan beslissingen over het cellot.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door kwantificering van meerdere nucleaire markers en hun ruimtelijke coördinaten in intacte embryo's.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door het verduidelijken van eiwitexpressiepatronen die geassocieerd zijn met gebeurtenissen bij de specificatie van cellijnen.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door het genereren van reproduceerbare gegevens met een hoge resolutie over target-engagement in ziekterelevante systemen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Produceert gevalideerde biologische systemen met kwantitatieve nucleaire fluorescentie-readouts voor downstream compound-screening.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gestandaardiseerde imaging- en segmentatieworkflows mogelijk die de variabiliteit in monsters met een hoge nucleaire dichtheid verminderen.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt het hergebruik van het platform voor embryonale stamcelkolonies, differentiërende culturen en embryo's van verschillende soorten met minimale aanpassingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt eiwitexpressiedynamiek in de ontdekkingsfase met preklinische validatie via spatiale en kwantitatieve fenotypering.
- Mechanistische risicoreductie: Vermindert ambiguïteit in modellen voor lineage-commitment door heterogeniteiten binnen celpopulaties op single-cell resolutie op te lossen.
- Risicogebaseerde voortgang: Onderbouwt go/no-go-beslissingen door objectieve drempelwaarden te bieden voor eiwit-co-expressie en lokalisatie in ontwikkelingspaden.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door hypothese-gestuurde kwantificering van eiwitexpressie mogelijk te maken voorafgaand aan inspanningen voor lead-identificatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt pathway-verduidelijking en target-validatie door middel van ongesuperviseerde nucleaire segmentatie en multi-channel fluorescentiekwantificering.
- Screening: Levert assay-ready, gestandaardiseerde outputs die geschikt zijn voor het evalueren van compound-effecten op embryonale eiwitexpressienetwerken.
- Analytics: Genereert ruimtelijke (XYZ) coördinaten en nucleaire fluorescentieniveaus per kanaal, waardoor statistische vergelijking van expressietoestanden over verschillende condities mogelijk is.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij biomarker-ontdekking door eiwitexpressiepatronen te koppelen aan lineage-specificatie in ziekterelevante ontwikkelingsmodellen.
- Enterprise Hergebruik: Fungeert als een herbruikbare imaging- en analysecapaciteit voor het bestuderen van cellulaire heterogeniteit in diverse preklinische systemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets door mechanistische ambiguïteit bij vroege lineage-beslissingen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door geautomatiseerde segmentatie en minimale gebruikersinvoer via MINS-software.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van targets die betrokken zijn bij ontwikkelingspaden mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste eiwitexpressiegegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie, immunofluorescentie en software voor nucleaire segmentatie.
- Afhankelijk van toegang tot laser-scanning confocale microscopen en de MATLAB-gebaseerde MINS-tool voor 3D-beeldanalyse.
- Noodzaak tot standaardisatie van fixatie-, kleurings- en beeldvormingsprotocollen tussen teams om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan variërende nucleaire dichtheid en signaal-ruisverhoudingen in verschillende modelsystemen.
- Beperkt door de beschikbaarheid van monsters en de noodzaak van optimalisatie bij toepassing op niet-embryonische targets of targets met een lage abundantie.
