Name: Time-lapse video microscopie voor de Beoordeling van EYFP-Parkin Aggregation als marker voor Cellular mitofagie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Leer time-lapse videomicroscopie voor het volgen van EYFP-Parkin aggregatie als marker voor mitofagie in cellen. Deze methode biedt inzicht in mitochondriële dynamiek en eiwitgedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidies (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 naar R.G.P.), de Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core-subsidie P30CA056036 (R.G.P.), een subsidie van de Breast Cancer Research Foundation, genereuze subsidies van de Dr. Ralph and Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) en een subsidie van het Pennsylvania Department of Health (R.G.P.). Gedeeltelijk werd dit werk ondersteund door een American Italian Cancer Foundation postdoctorale beurs (G.D.) en Bioimaging Shared Resource van het Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5 P30 CA-56036). Het Department wijst specifiek alle verantwoordelijkheid af voor een analyse, interpretaties of conclusies. Er zijn geen belangenconflicten verbonden aan dit manuscript.

1. Elektroporatie van fibroblast met Beide Expression Vectors EYFP-Parkin en pDsRed2-Mito <ol><li> Groeien de onsterfelijk muis embryonale fibroblast cellen op 10 cm weefsel- kweekplaat met behulp DMEM (Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium) medium aangevuld met 10% foetaal runderserum, 2 mmol / l L-glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine in bevochtigde atmosfeer die 5% CO2 bij 37 ° C. <ol><li> Bij 80% cel confluentie, gooi de volledige DMEM medium met steriele afzuigen en voeg 10 ml steriele 1x fosfaatbufferoplossing (PBS) (80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4 en 1 l gedestilleerd H2O, pH: 7,4). </li><li> Gooi de PBS door steriele zuig- en voeg 1 ml trypsine-EDTA 0,25%. Incubeer de plaat bij 37 ° C totdat de cellen losgemaakt (2-3 min). Voeg 4 ml compleet DMEM medium, resuspendeer de cellen en nemen 10 _6, l van de celsuspensie voor de hemocytometer geteld. OPMERKING: De hemocytometer is zo ontworpen dat het aantal cellen in één set van 16 hoekvelden is gelijk aan het aantal cellen x 10 4 / ml. </li></ol></li><li> Seed 1 x 10 6 cellen op 10 cm weefselcultuurschalen 24 uur voorafgaand aan de elektroporatie werkwijze. </li><li> Gooi de volledige DMEM medium met steriele zuig- en voeg 10 ml steriel PBS. Gooi de PBS door steriele zuig- en voeg 1 ml trypsine-EDTA 0,25%. Incubeer de plaat bij 37 ° C totdat de cellen losgemaakt (2-3 min). Voeg 4 ml compleet DMEM medium en resuspendeer de cellen in een 15 ml buis. </li><li> Spin de cellen neer op 250 xg gedurende 5 min met behulp van een gekoelde centrifuge (4 ° C). Verwijder het supernatant door afzuigen steriel en resuspendeer de pellet in 1 ml steriel PBS. Spin de cellen neer op 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant door steriele afzuigen en voeg 100 ul of oplossing mix voor elektroporatie (82 ul van elektroporatie Solution V + 18 pl Aanvullende oplossing 1) naar de cel pellet en voorzichtig resuspendeer de pellet door pipetteren (Voor meer details, zie de handleiding van). Voeg 2 ug EYFP-Parkin (excitatie / emissie 514/527) en 1 ug pDsRed2-Mito (excitatie / emissie 565/620) aan de celsuspensie. </li><li> Breng de oplossing aan de steriele cuvet met behulp van een wegwerp pasteur (beide instrumenten zijn voorzien van de kit) en electroporate met behulp van de vooraf ingestelde programma NIH / 3T3 U-030 (Single puls, spanning 200 V, capaciteit 960 uF, pulstijd 20 milliseconden , pulse nummer: 1). </li><li> Onmiddellijk na de elektroporatie, voeg 500 ul vers voorverwarmde compleet DMEM medium en zaden de cel op een 6 cm weefsel kweekplaat live imaging-rang en incubeer ze in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 bij 37 ° C 24 uur. </li></ol> 2. Time-lapse video Microscopie <ol><li&gt; Stel de temperatuur van de microscoop kamer bij 37 ° C vóór gebruik. </li><li> Op dit moment stelt een specifieke levende beeldmedium te gaan met de experimentele protocol. Bereid de live-imaging medium als volgt; mix DMEM fenolvrij gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum, 2 mmol / l L-glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine. Pre-warm de levende beeldmedium bij 37 ° C in een waterbad. </li><li> Gooi het medium van de geëlektroporeerde cellen door steriele afzuigen en voeg 1 ml voorverwarmde levende beeldmedium, met een P1000 pipet en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Tijdens de plaat incubatieperiode instroom 5% CO 2 in de microscoop kamer al op een stabiele temperatuur van 37 ° C. </li><li> Leg de plaat met de geëlektroporeerde cellen in de microscoop kamer van het vermijden van grote bewegingen of trillingen. </li><li> Via de software-interface, zet de microscoop teneinde zowel fluore detecterenscene signalen van de fusie-eiwitten waarvoor het gecotransfecteerd vectoren, EYFP-Parkin (Excitatie bereik 495-510 nm en emissie bereik 520-550 nm, groen) en de pDsRed2-Mito (excitatiemaximum 558 nm en emissie maximum 583 nm, rood). <ol><li> Open de time-lapse video microscopie-software. In het bovenste menu de FITC voor EYFP-Parkin en Rhodamine voor pDsRed2-Mito. In het bovenste menu de vergroting (20X). </li></ol></li><li> Met behulp van de software-interface, kijk voor de enkele cel die zowel gecotransfecteerde vectoren en registreren van de positie. Herhaal deze stap tot een minimum van 10 cellen wordt verzameld voor elke experimentele conditie (experimentele groep). <ol><li> Selecteer het menu &quot;Apps&quot; en klik op Multi Dimensional Acquisition. In de multidimensionale Verwerving vensters selecteert de parameters die nodig zijn, zoals het aantal acquisities, het tijdsinterval tussen elke verwerving en de positie van de cel opgenomen. Klik op &#39;Acquire&quot;Om de overname te starten. </li></ol></li><li> Start de basale overname van zowel EYFP-Parkin en DsRed2-Mito fluorescerend signaal verzamelen van beelden elke 5 minuten voor een totaal interval van 15 minuten. </li><li> Bereid voorverwarmde live-imaging medium met een concentratie van FCCP twee keer hoger dan de uiteindelijke werking concentratie (0,1-10 pM, het type-afhankelijke cel). </li><li> Onderbreekt het acquisitieproces en voeg voorzichtig 1 ml voorverwarmde levende beeldmedium met FCCP in de plaat in de microscoop kamer met een P1000 pipet. </li><li> Start de acquisitieproces zoals eerder beschreven, een totale duur van 3 uur, met de vastgelegde positie. Bewaar alle verkregen beelden om ze te analyseren en een video van de mitophagic proces bij de overname is voorbij. </li></ol> 3. Analyse <ol><li> Verzamel alle verkregen beelden in &quot;.tiff&quot; formaat op een personal computer </li><li> Open de foto&#39;s met een grafische zachteware en de temporele interval definiëren plaatsgevonden vanaf het mitochondriale geïnduceerde-depolarisatie met FCCP naar het eerste plaatje van de werving van Parkin in het mitochondriale membraan (De beelden worden elke 5 min verworven). Herhaal deze analyse voor elke cel in de experimentele groep. </li><li> Label de eerste cel van de kolom op een spreadsheet met de experimentele groepsnaam. Voor elke experimentele groep, het meten van de tijdelijke intervallen voor Parkin aanwerving van een minimum van 10 cellen. Maak een gemiddelde van de berekende tijdsintervallen voor Parkin werving en bepalen de standaardafwijking voor elke experimentele groep (gemiddelde ± SD, n = 10). <ol><li> Organiseren in de kolommen van de enkele berekende tijdelijke intervallen. Elke kolom bevat n = 10 metingen van de experimentele groep. </li><li> Selecteer de functie &quot;gemiddelde&quot; van de Formula Builder menu. Selecteer de gegevens in de kolom. Selecteer de functie &quot;standaarddeviatie&quot; van de Formula Builder menu. Select de gegevens in de kolom. </li></ol></li><li> Met behulp van een statistische benadering, vergelijk de experimentele groepen van de gepaste statistiek om een ​​significant verschil in de dynamiek van mitofagie tussen de experimentele groepen definiëren. (Bijvoorbeeld, twee groepen = t-toets, drie of meer groepen = ANOVA plus een post-hoc test) </li></ol>

<ol><li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).</li>
<li>Zhi, X., Zhong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">Autophagy in cancer.</a> F1000Prime Rep. 7, 18(2015).</li>
<li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%3A+mechanisms%2C+pathophysiological+roles%2C+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biol Chem. 393, 547-564 (2012).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+mitochondrial+autophagy%2C+or+mitophagy%2C+as+a+targeted+defense+against+oxidative+stress%2C+mitochondrial+dysfunction%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Res%22%5BJournal%5D)">Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging.</a> Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).</li>
<li>Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uth1p+is+involved+in+the+autophagic+degradation+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria.</a> J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).</li>
<li>Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+mitophagy%3A+the+yin+and+yang+of+cell+death+control%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control.</a> Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).</li>
<li>Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+mechanisms+and+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitophagy mechanisms and role in human diseases.</a> Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).</li>
<li>Di Sante, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+sirt1+promotes+prostatic+intraepithelial+neoplasia%2C+reduces+mitophagy%2C+and+delays+park2+translocation+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria.</a> Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).</li>
<li>Tanaka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin-mediated+selective+mitochondrial+autophagy%2C+mitophagy%3A+Parkin+purges+damaged+organelles+from+the+vital+mitochondrial+network%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network.</a> FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).</li>
<li>Shiba-Fukushima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-mediated+phosphorylation+of+the+Parkin+ubiquitin-like+domain+primes+mitochondrial+translocation+of+Parkin+and+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy.</a> Sci Rep. 2, 1002(2012).</li>
<li>Trinh, J., Farrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+genetics+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advances in the genetics of Parkinson disease.</a> Nat Rev Neurol. 9, 445-454 (2013).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417, 1-13 (2009).</li>
<li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).</li>
<li>Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+wild+type+and+mutant+ELOVL4+in+cell+culture%3A+subcellular+localization+and+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability.</a> Mol Vis. 10, 248-253 (2004).</li>
<li>Jin, S. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-+and+Parkin-mediated+mitophagy+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance.</a> J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).</li>
<li>Kerr, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+of+macropinosome+maturation+by+the+recruitment+of+sorting+nexins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins.</a> J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).</li>
<li>Edin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+gel+culture+and+time-lapse+video+microscopy+of+the+human+vestibular+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve.</a> Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).</li>
<li>Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SPI-2+type+III+secretion+system+restricts+motility+of+Salmonella-containing+vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles.</a> Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).</li>
<li>Meseguer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+incubation+and+selection+in+a+time-lapse+monitoring+system+improves+pregnancy+outcome+compared+with+a+standard+incubator%3A+a+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study.</a> Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).</li>
<li>Campbell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+a+risk+classification+of+aneuploidy+in+human+embryos+using+non-invasive+morphokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics.</a> Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).</li>
<li>Bingol, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+deubiquitinase+USP30+opposes+parkin-mediated+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy.</a> Nature. 510, 370-375 (2014).</li>
<li>Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+sensitizes+toward+apoptosis+induced+by+mitochondrial+depolarization+through+promoting+degradation+of+Mcl-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1.</a> Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).</li>
<li>Batlevi, Y., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+autophagy+in+neural+function%2C+neurodegenerative+disease%2C+neuron+cell+death%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging.</a> Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).</li>
<li>Frank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+is+triggered+by+mild+oxidative+stress+in+a+mitochondrial+fission+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner.</a> Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Sugar, I. P., Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+model+for+electric+field-induced+membrane+pores.+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Chem%22%5BJournal%5D)">Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation.</a> Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variants+of+mitochondrial+autophagy%3A+Types+1+and+2+mitophagy+and+micromitophagy+%28Type+3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3).</a> Redox Biol. 2, 749-754 (2014).</li>
<li>Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+mitochondrial+electron+transport+and+energy+coupling+by+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light.</a> Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).</li>
<li>Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fibroblast+alterations+induced+by+low+power+laser+irradiation+at+the+single+cell+level+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy.</a> Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).</li>
<li>Kim, I., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+selectively+degrades+individual+damaged+mitochondria+after+photoirradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation.</a> Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).</li>
<li>Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+processes+by+long-term+live+imaging--historic+problems+and+current+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions.</a> J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Time-lapse microscopie kan worden gedefinieerd als de techniek die live cell imaging uitstrekt vanaf één observatie in de tijd om de waarneming van cellulaire dynamiek gedurende lange tijd. Deze methode onderscheidt zich van een eenvoudige confocale microscopie en levende cellen omdat het de waarnemer identificeren in real time een fluorescerend-gemerkt eiwit en volg de dynamische in een levende cel. In feite, kan het confocale microscopie gemakkelijk geïdentificeerd immunologisch gemerkte eiwitten met fluorescerende an...

Macro-autofagie is een intracellulair proces dat de katabolische afbraak van zowel beschadigde als disfunctionele cellulaire componenten omvat, zoals organellen en eiwitten met als doel recyclen of energieproductie. Om dit metabolische proces te initiëren, omhult de cel de beschadigde cellulaire componenten in een dubbelmembraanstructuur, bekend als een autofagosoom, dat fuseert met een lysosoom en het inhoud ervan wordt afgebroken en gerecycled 1,2. Er zijn twee hoofdtypen autofagie, de niet-selectieve en selectieve. Het niet-selectieve autofagieproces vindt plaats wanneer de cel onder voedingsgebreksomstandigheden verkeert en zowel essentiële voedingsstoffen als energie moet zoeken. Echter, selectieve autofagie vindt plaats om de verwijdering te bemiddelen van zowel disfunctionele/beschadigde organellen en eiwitten die anders toxisch zouden kunnen zijn. Een van de meest bestudeerde selectieve autofagieprocessen is de verwijdering van mitochondriën, bekend als mitofagie 1,3-5.
Mitochondriën zijn de centrale organellen voor celmetabolisme en de primaire bron van adenosintrofosfaat (ATP) via oxidatieve fosforylering door de elektronentransportketen, vetzuuroxidatie en tricarbonzuur (TCA) cyclus. Bovendien reguleren mitochondriën de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en geven eiwitten vrij die deelnemen aan celdoodsroutes 6-8.
PTEN-geïnduceerde putatieve kinase 1 (PINK1) en Parkin RBR E3 ubiquitineligase (Parkin) zijn de belangrijkste eiwitten die betrokken zijn bij het mitofagieproces. Parkin kan beschermen tegen celdood door de cel gezond te houden door middel van mitochondriale kwaliteitscontrole9. Bij verlies van mitochondriale membraanpotentiaal wordt cytosolisch Parkin door PINK1 naar de mitochondriën gerekruteerd. Deze rekrutering triggert de sequentiële gebeurtenissen van mitofagie 10. Er is een breed scala aan bewijs dat mitofagie een fundamenteel mitochondriaal kwaliteitscontroleproces is en abnormaliteiten in dit proces veroorzaken ziekte 7. Bijvoorbeeld, autosomaal recessieve ziekte van Parkinson is geassocieerd met mutaties in de genen die coderen voor Parkin en PINK1 (PARK2 en PINK1, respectievelijk) 11. De kwaliteitscontrole van mitochondriale gezondheid is essentieel voor de verwijdering van mitochondriën die bijdragen aan de accumulatie van ROS12. Overmatige aanwezigheid van intracellulaire ROS kan leiden tot schade aan zowel nucleair als mitochondriaal DNA (DNA en mt DNA, respectievelijk).
Hier laten we een tijds-lapse videomicroscopie-benadering zien om de aggregatie van Parkin te volgen na de inductie van Parkin-gemedieerde mitofagie in geïmmortaliseerde muizen embryonale fibroblasten via in vitro toediening van carbonylcyanide 4-(trifluormethoxy)-fenylhydrazon (FCCP), een ontkoppelingsmiddel. FCCP verstoort ATP-synthese door protonen kortsluiten over de buitenste mitochondria-membraan en ontkoppelt daardoor oxidatieve fosforylering van de elektronentransportketen 13. Het triggeren van de depolarisatie van het mitochondriale membraan leidt tot de verstoring van mitochondriën en selectieve Parkin-afhankelijke verwijdering. Daarom kan het transfecteren van de cellen van belang met een expressievector die Parkin codeert gefuseerd met een fluorescerende marker (verbeterde gele fluorescente proteïne, EYFP) worden gebruikt als een fluorescerende tag om de rekrutering van Parkin tijdens het mitofagische proces te volgen. Om de mitochondriën te visualiseren, co-transfecteerden we pDsRed2-Mito, dat codeert voor rood fluorescerend proteïne (DsRed2) dat een mitochondriale targetingsequentie van cytochroom c oxidase subeenheid VIII (Mito) bevat. pDsRed2-Mito is ontworpen voor fluorescerende labeling van mitochondriën14. De tijd die nodig is voor Parkin-translocatie in het mitochondriale membraan kan worden gemeten en geeft een indirecte maatstaf voor cellulaire gezondheid. Bijvoorbeeld, we kunnen zeggen dat als een cellijn die knock-out is voor een bepaald gen van belang of een snellere of langzamere rekrutering van Parkin vertoont na de inductie van mitofagie door FCCP, dat genproduct een sleutelrol zou spelen om de metabolische snelheden van de cel op de fysiologische status te houden en de ontwikkeling van ziekten te voorkomen. Daarom biedt de tijds-lapse videomicroscopie een zeer krachtig hulpmiddel voor zowel fundamenteel als klinisch onderzoek in het volgen van de dynamica van gelabelde proteïnen tijdens hun moleculaire processen en het begrijpen hoe deze processen worden beïnvloed tijdens een pathologische toestand.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning Life Science</td><td>10-013-CV</td><td>Voorverwarmen bij 37 &#176;C voor gebruik</td></tr><tr><td>Phenol-vrij DMEM</td><td>Corning Life Science</td><td>17-205-CV</td><td>Voorverwarmen bij 37 &#176;C voor gebruik</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Voorverwarmen bij 37 &#176;C voor gebruik</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Voorverwarmen bij 37 &#176;C voor gebruik</td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Corning Life Science</td><td>30-002-CI</td><td>Voorverwarmen bij 37 &#176;C voor gebruik</td></tr><tr><td>EYFP-PARKIN expressievector</td><td>Addgene</td><td>23955</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed2-Mito expressievector</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2B apparaat</td><td>LONZA</td><td>AAD-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector voor kit R NIH/3T3</td><td>LONZA</td><td>VCA-1001</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscoop</td><td>CARL ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-fenylhydrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>Experimental Builder</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>Experimental Builder</td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse video microscopie voor de beoordeling van eyfp-parkin aggregation als marker voor cellular mitofagie

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-lapse videomicroscopie kan worden gedefinieerd als de realtime beeldvorming van levende cellen. Deze techniek is gebaseerd op het verzamelen van beelden op verschillende tijdstippen. Tijdsintervallen kunnen worden ingesteld via een computerinterface die de microscoopgeïntegreerde camera bestuurt. Dit soort microscopie vereist zowel de mogelijkheid om zeer snelle gebeurtenissen te registreren als het signaal dat wordt gegenereerd door de waargenomen cellulaire structuur tijdens deze gebeurtenissen. Nadat de beelden zijn verzameld, wordt een film van het hele experiment samengesteld om de dynamica van de moleculaire gebeurtenissen van belang te tonen. Time-lapse videomicroscopie heeft een breed scala aan toepassingen in het biomedische onderzoeksveld en is een krachtig en uniek hulpmiddel voor het volgen van de dynamica van de cellulaire gebeurtenissen in realtime. Door deze techniek kunnen we cellulaire gebeurtenissen zoals migratie, deling, signaaltransductie, groei en dood beoordelen. Bovendien kunnen we met behulp van fluorescerende moleculaire sondes specifieke moleculen markeren, zoals DNA, RNA of eiwitten, en ze volgen door hun moleculaire paden en functies. Time-lapse videomicroscopie heeft meerdere voordelen, waarbij het grootste voordeel is de mogelijkheid om gegevens op het niveau van enkele cellen te verzamelen, wat het een unieke technologie maakt voor onderzoek op het gebied van celbiologie. Echter, time-lapse videomicroscopie heeft beperkingen die de verwerving van beelden van hoge kwaliteit kunnen beïnvloeden. Beelden kunnen worden aangetast door zowel externe factoren; temperatuurschommelingen, vibraties, luchtvochtigheid en interne factoren; pH, celbeweeglijkheid. Hierin beschrijven we een protocol voor de dynamische verwerving van een specifiek eiwit, Parkin, gefuseerd met het verbeterde gele fluorescente eiwit (EYFP) om de selectieve verwijdering van beschadigde mitochondriën te volgen, met behulp van een time-lapse videomicroscopie benadering.

Hierin tonen we hoe time-lapse microscopie video is een techniek die kan worden gebruikt om moleculaire gebeurtenissen van fluorescent-gemerkte eiwitten volgen in één cel. De representatieve resultaten laten ook zien hoe deze techniek zorgt voor het verkrijgen van beelden van hoge kwaliteit. Wanneer beelden van de moleculaire proces worden verkregen, hebben we de mogelijkheid om ze te analyseren op verschillende manieren. Hier analyseren we de tijd tussen start van de geïnduceerde mitofa...

Hier beschrijven we in detail een time-lapse videomicroscopie-benadering om de temporele recrutering van EYFP-Parkin te meten tijdens de selectieve verwijdering van beschadigde mitochondriën. Dit dynamische proces van EYFP-Parkin-afhankelijke verwijdering van beschadigde mitochondriën kan worden gebruikt als een indicator van cellulaire gezondheid onder verschillende experimentele omstandigheden.

Time-lapse video microscopie voor de Beoordeling van EYFP-Parkin Aggregation als marker voor Cellular mitofagie

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

Het algemene doel van deze time-lapse videomicroscopie is om de selectieve Parkin-gemedieerde verwijdering van beschadigde mitochondriën tijdens het mitofagieproces te volgen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van het moleculaire metabolisme, zoals de manier waarop mitofagie invloed heeft op aanhoudende pathologische condities. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een zeer krachtig instrument biedt om de dynamiek van gelabelde eiwitten tijdens hun moleculaire processen te volgen.Deze methode kan inzicht bieden in de mitochondriale levenscyclus. Ze kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals primaire celculturen, embryologische studies en het voorspellen van een prioriteit. De geïmmortaliseerde muisembryonale fibroblasten die in deze studie zijn gebruikt, worden gekweekt in volledig DMEM-medium op een weefselkweekplaat van tien centimeter bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met vijf procent koolstofdioxide.Wanneer de cellen een confluentie van 80% hebben bereikt, verwijder dan het medium via steriele aspiratie en voeg tien milliliter steriele PBS toe. Verwijder de PBS en voeg één milliliter 0,25% Trypsin EDTA toe. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende twee tot drie minuten totdat de cellen zijn losgekomen.Voeg vier milliliters compleet DMEM-medium toe en resuspendeer de cellen. Neem tien microliters van de celsuspensie af voor telling met een hemocytometer. Zaai 1 × 10⁶ cellen uit op een weefkweekschaal van tien centimeter en incubeer gedurende 24 uur.Was de volgende dag de cellen één keer met PBS en detach de cellen door trypsinisatie, zoals eerder gedemonstreerd. Voeg vier milliliter volledig DMEM-medium toe, resuspendeer de cellen en breng de celsuspensie over naar een buis van 15 milliliter. Centrifugeer de cellen bij 250 gs en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in één milliliter steriele PBS. Centrifugeer de cellen opnieuw. Verwijder het supernatant na de tweede centrifugatie.Voeg 100 µL van het electroporatie-oplossingsmengsel toe aan de celpellet en resuspendeer de pellet voorzichtig door te pipetteren. Voeg vervolgens 2 µg van het EYFP Parkin expressieplasmid en 1 µg van het DsRed2 Mito expressieplasmid toe aan de celsuspensie. Gebruik de wegwerppasteurpipet om de oplossing over te brengen naar een steriele cuvette.Electroporeer de cellen met behulp van een vooraf ingesteld programma. Voeg onmiddellijk na de electroporatie 500 µL vers, voorverwarmd compleet DMEM-medium toe aan de cellen en zaai de cellen uit op een weefselkweekplaat van zes centimeter die geschikt is voor live-imaging.Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met vijf procent koolstofdioxide. Stel voorafgaand aan deze procedure de temperatuur van de microscoopkamer in op 37 °C. Bereid vervolgens een specifiek medium voor live-imaging door het volgende te mengen: fenolvrij DMEM aangevuld met tien procent FBS, twee millimolar per liter L-glutamine, 100 units per milliliter penicilline en 100 milligram per milliliter streptomycine.Verwarm het medium vooraf tot 37 °C in een waterbad. Verwijder het medium van de ge-elektroporeerde cellen via steriele zuiging en voeg één ml vooraf verwarmd live imaging medium toe. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C.Nadat is bevestigd dat de kamer van de microscoop op een stabiele temperatuur van 37 °C is, wordt er vijf procent kooldioxide in de kamer geleid. Plaats de plaat met de ge-electroporeerde cellen voorzichtig, en zonder grote bewegingen of schommelingen, in de kamer van de microscoop.Stel de microscoop via de software-interface zo in dat de fluorescentiesignalen van de fusie-eiwitten, gecodeerd door de EYFP Parkin- en DsRed2 Mito-expressievectoren, worden gedetecteerd. Open de software voor time-lapse videomicroscopie. Selecteer in het bovenmenu FITC voor EYFP Parkin en Rhodamine voor DsRed2 Mito.Selecteer een vergroting van 20X. Zoek via de softwareinterface naar een enkele cel waarin beide gecotransfecteerde vectoren tot expressie komen en registreer de positie. Doe dit voor minimaal 10 cellen voor elke experimentele conditie.Selecteer het menu Apps en klik op Multi Dimensional Acquisition. Selecteer in de vensters van Multi Dimensional Acquisition de benodigde parameters, zoals het aantal acquisities, het tijdsinterval tussen elke acquisitie en de positie van de geregistreerde cel. Klik op Acquire om de basale acquisitie van beide fluorescentiesignalen te starten.Neem elke vijf minuten beelden over een totaal interval van vijftien minuten. Terwijl de beeldacquisitie plaatsvindt, bereidt u voorverwarmd medium voor live imaging voor dat Carbonyl Cyanide 4 trifluouromethoxy phenylhydrazone, of FCCP, bevat in een concentratie die tweemaal de uiteindelijke werkconcentratie bedraagt. Onderbreek het acquisitieproces en voeg voorzichtig één milliliter van het voorverwarmde medium voor live imaging met FCCP toe aan de plaat in de kamer van de microscoop.Na het toevoegen van FCCP is het belangrijk om de microscoop opnieuw te scherpstellen voordat de beeldacquisitie wordt hervat. Start het acquisitieproces opnieuw op zoals eerder beschreven en verzamel gedurende een totale periode van drie uur beelden op de geregistreerde positie. Sla na voltooiing van de beeldacquisitie alle verkregen beelden op voor latere analyse.Hier worden time-lapsebeelden getoond van EYFP-Parkin en DsRED2-Mito fluorescentiesignalen in fibroblasten voorafgaand aan de toediening van FCCP. De witte kaders vertegenwoordigen de vergrote gebieden van de respectieve panelen aan de rechterkant. Tijdens de basale tijdspunten is EYFP-Parkin, gevisualiseerd in het groen, homogeen verspreid door de hele cel.Het mitochondriële netwerk, in het rood gevisualiseerd, lijkt goed onderling verbonden te zijn, zoals aangegeven door de witte pijlen. Na toediening van FCCP is na vijf minuten mitochondriële fractionering als gevolg van membraandepolarisatie waarneembaar. EYFP-Parkin is echter nog steeds homogeen verspreid over het cytoplasma.55 minuten na toediening van FCCP wordt EYFP-Parkin gerekruteerd naar de beschadigde mitochondriale membranen om het mitofagieproces in gang te zetten. De verplaatsing van EYFP-Parkin naar het mitochondriale membraan na toediening van FCCP wordt getoond in deze representatieve time-lapse movie. Zodra de methode onder de knie is, kan deze techniek in twee uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van autofagie om mitochondriale recycling te experimenteren. Hierdoor kunnen cellen worden gebruikt om het mitofagieproces te bestuderen als een vorm van mitochondriale kwaliteitscontrole in de cellen.

time-lapse-video-microscopy-for-assessment-eyfp-parkin-aggregation-as

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mitochondriale fusie werd gemeten door het bijhouden van de gelijkschakeling van de photoconverted matrix-gerichte GFP over het mitochondriale netwerk in de tijd. Tot dusver kon slechts een cel worden onderworpen aan een uur lang kinetische analyse tegelijk. Wij presenteren een methode die meet gelijktijdig meerdere cellen, waardoor versnelling van het proces van gegevensverzameling.

Een snellere, met hoge resolutie, MTPA-GFP-gebaseerde Mitochondriale Fusion Assay verwerven Kinetische gegevens van meerdere cellen parallel geschakeld Met behulp van confocale microscopie

Hier, multispectrale beeldvormende flowcytometrie met een analytische functie die heldere detailafbeeldingen van 3 autofagie markers vergelijkt en kwantificeert hun co-lokalisatie, samen met LC3 spot counting, werd gebruikt om autofagie op objectieve, kwantitatieve en statistisch robuuste wijze te meten.

Autofagische Flux beoordelen door LC3-, P62- en LAMP1-co-lokalisatie met behulp van Multispectrale Imaging Flow Cytometry

Mitophagy, het proces van clearing beschadigd de mitochondriën, is noodzakelijk voor mitochondriale homeostase en gezondheid onderhoud. Dit artikel presenteert een aantal van de meest recente mitophagy detectiemethoden in menselijke cellen, Caenorhabditis elegansen muizen.

In Vitro en In Vivo opsporing van Mitophagy in menselijke cellen, C. Elegansen muizen

Hebben we een eenvoudige en flexibele workflow om kwantitatieve gegevens extract van fluorescentie imaging-gebaseerde cel biologische studies van aggregatie van eiwitten en autophagic flux in het centrale zenuwstelsel van Drosophila modellen van neurodegeneratie.

Kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in Drosophila door onbevooroordeelde analyse van Fluorescently Tagged eiwitten met behulp van ImageJ

Mitophagy, de selectieve afbraak van mitochondriën, heeft betrokken bij mitochondriale homeostase en in verschillende ziekten bij de mens is gedereguleerd. Handige experimentele methoden voor het meten van de activiteit van de mitophagy zijn echter zeer beperkt. Hier bieden we een gevoelige test voor het meten van de activiteit van de mitophagy met behulp van stroom cytometry.

Gevoelige meting van Mitophagy door Stroom Cytometry met behulp van de pH-afhankelijke fluorescerende verslaggever mt-Keima

Dit protocol schetst een methode voor kwantitatieve analyse van mitophagy eiwit complexvorming specifiek in bètacellen van primaire menselijke eilandje monsters. Deze techniek maakt dus analyse van mitophagie van beperkt biologisch materiaal mogelijk, die cruciaal zijn in de voorbeelden van kostbare humane alvleesklier bètacellen.

Visualisatie van endogene Mitophagie complexen in situ in humane pancreas Bètacellen met behulp van proximity Ligatie test

Mitofagie is het primaire mechanisme van mitochondriale kwaliteitscontrole. De evaluatie van mitofagie in vivo wordt echter belemmerd door het gebrek aan betrouwbare kwantitatieve testen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de observatie van mitofagie in levende cellen met behulp van een celpermeant groen-fluorescerende mitochondriënkleurstof en een rood-fluorescerende lysosoomkleurstof.

Mitofagie visualiseren met fluorescerende kleurstoffen voor mitochondriën en lysosoom

Op basis van in vitro experimenten onthulde deze studie het mechanisme van crocetine bij het repareren van oxidatieve stressschade van cardiomyocyten door mitofagie te beïnvloeden, waarbij de PINK1 / Parkin-signaleringsroute een belangrijke rol speelt.

Bescherming van H9c2 myocardiale cellen tegen oxidatieve stress door crocetine via PINK1 / Parkin Pathway-gemedieerde mitofagie

Deze techniek beschrijft een effectieve workflow om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus in HeLa-cellen te visualiseren en kwantitatief te meten met behulp van op fluorescentie gebaseerde live beeldvorming.

Op fluorescentie gebaseerde kwantificering van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus met behulp van live beeldvorming in HeLa-cellen

Deze studie presenteert een methode om de morfologie van mitochondriën te analyseren op basis van immunokleuring en beeldanalyse in hersenweefsel van muizen in situ. Het beschrijft ook hoe dit het mogelijk maakt om veranderingen in de mitochondriale morfologie te detecteren die worden veroorzaakt door eiwitaggregatie in modellen voor de ziekte van Parkinson.

Histologisch onderzoek van mitochondriale morfologie in een model voor de ziekte van Parkinson

Leer time-lapse videomicroscopie voor het volgen van EYFP-Parkin aggregatie als marker voor mitofagie in cellen. Deze methode biedt inzicht in mitochondriële dynamiek en eiwitgedrag.

Time-lapse video microscopie voor de Beoordeling van EYFP-Parkin Aggregation als marker voor Cellular mitofagie

Meer video's verkennen