Time-lapse video microscopie voor de Beoordeling van EYFP-Parkin Aggregation als marker voor Cellular mitofagie

Het algemene doel van deze time-lapse videomicroscopie is om de selectieve Parkin-gemedieerde verwijdering van beschadigde mitochondriën tijdens het mitofagieproces te volgen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van het moleculaire metabolisme, zoals de manier waarop mitofagie invloed heeft op aanhoudende pathologische condities. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een zeer krachtig instrument biedt om de dynamiek van gelabelde eiwitten tijdens hun moleculaire processen te volgen.

Deze methode kan inzicht bieden in de mitochondriale levenscyclus. Ze kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals primaire celculturen, embryologische studies en het voorspellen van een prioriteit. De geïmmortaliseerde muisembryonale fibroblasten die in deze studie zijn gebruikt, worden gekweekt in volledig DMEM-medium op een weefselkweekplaat van tien centimeter bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met vijf procent koolstofdioxide.

Wanneer de cellen een confluentie van 80% hebben bereikt, verwijder dan het medium via steriele aspiratie en voeg tien milliliter steriele PBS toe. Verwijder de PBS en voeg één milliliter 0,25% Trypsin EDTA toe. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende twee tot drie minuten totdat de cellen zijn losgekomen.

Voeg vier milliliters compleet DMEM-medium toe en resuspendeer de cellen. Neem tien microliters van de celsuspensie af voor telling met een hemocytometer. Zaai 1 × 10⁶ cellen uit op een weefkweekschaal van tien centimeter en incubeer gedurende 24 uur.

Was de volgende dag de cellen één keer met PBS en detach de cellen door trypsinisatie, zoals eerder gedemonstreerd. Voeg vier milliliter volledig DMEM-medium toe, resuspendeer de cellen en breng de celsuspensie over naar een buis van 15 milliliter. Centrifugeer de cellen bij 250 gs en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in één milliliter steriele PBS. Centrifugeer de cellen opnieuw. Verwijder het supernatant na de tweede centrifugatie.

Voeg 100 µL van het electroporatie-oplossingsmengsel toe aan de celpellet en resuspendeer de pellet voorzichtig door te pipetteren. Voeg vervolgens 2 µg van het EYFP Parkin expressieplasmid en 1 µg van het DsRed2 Mito expressieplasmid toe aan de celsuspensie. Gebruik de wegwerppasteurpipet om de oplossing over te brengen naar een steriele cuvette.

Electroporeer de cellen met behulp van een vooraf ingesteld programma. Voeg onmiddellijk na de electroporatie 500 µL vers, voorverwarmd compleet DMEM-medium toe aan de cellen en zaai de cellen uit op een weefselkweekplaat van zes centimeter die geschikt is voor live-imaging.

Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met vijf procent koolstofdioxide. Stel voorafgaand aan deze procedure de temperatuur van de microscoopkamer in op 37 °C. Bereid vervolgens een specifiek medium voor live-imaging door het volgende te mengen: fenolvrij DMEM aangevuld met tien procent FBS, twee millimolar per liter L-glutamine, 100 units per milliliter penicilline en 100 milligram per milliliter streptomycine.

Verwarm het medium vooraf tot 37 °C in een waterbad. Verwijder het medium van de ge-elektroporeerde cellen via steriele zuiging en voeg één ml vooraf verwarmd live imaging medium toe. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C.

Nadat is bevestigd dat de kamer van de microscoop op een stabiele temperatuur van 37 °C is, wordt er vijf procent kooldioxide in de kamer geleid. Plaats de plaat met de ge-electroporeerde cellen voorzichtig, en zonder grote bewegingen of schommelingen, in de kamer van de microscoop.

Stel de microscoop via de software-interface zo in dat de fluorescentiesignalen van de fusie-eiwitten, gecodeerd door de EYFP Parkin- en DsRed2 Mito-expressievectoren, worden gedetecteerd. Open de software voor time-lapse videomicroscopie. Selecteer in het bovenmenu FITC voor EYFP Parkin en Rhodamine voor DsRed2 Mito.

Selecteer een vergroting van 20X. Zoek via de softwareinterface naar een enkele cel waarin beide gecotransfecteerde vectoren tot expressie komen en registreer de positie. Doe dit voor minimaal 10 cellen voor elke experimentele conditie.

Selecteer het menu Apps en klik op Multi Dimensional Acquisition. Selecteer in de vensters van Multi Dimensional Acquisition de benodigde parameters, zoals het aantal acquisities, het tijdsinterval tussen elke acquisitie en de positie van de geregistreerde cel. Klik op Acquire om de basale acquisitie van beide fluorescentiesignalen te starten.

Neem elke vijf minuten beelden over een totaal interval van vijftien minuten. Terwijl de beeldacquisitie plaatsvindt, bereidt u voorverwarmd medium voor live imaging voor dat Carbonyl Cyanide 4 trifluouromethoxy phenylhydrazone, of FCCP, bevat in een concentratie die tweemaal de uiteindelijke werkconcentratie bedraagt. Onderbreek het acquisitieproces en voeg voorzichtig één milliliter van het voorverwarmde medium voor live imaging met FCCP toe aan de plaat in de kamer van de microscoop.

Na het toevoegen van FCCP is het belangrijk om de microscoop opnieuw te scherpstellen voordat de beeldacquisitie wordt hervat. Start het acquisitieproces opnieuw op zoals eerder beschreven en verzamel gedurende een totale periode van drie uur beelden op de geregistreerde positie. Sla na voltooiing van de beeldacquisitie alle verkregen beelden op voor latere analyse.

Hier worden time-lapsebeelden getoond van EYFP-Parkin en DsRED2-Mito fluorescentiesignalen in fibroblasten voorafgaand aan de toediening van FCCP. De witte kaders vertegenwoordigen de vergrote gebieden van de respectieve panelen aan de rechterkant. Tijdens de basale tijdspunten is EYFP-Parkin, gevisualiseerd in het groen, homogeen verspreid door de hele cel.

Het mitochondriële netwerk, in het rood gevisualiseerd, lijkt goed onderling verbonden te zijn, zoals aangegeven door de witte pijlen. Na toediening van FCCP is na vijf minuten mitochondriële fractionering als gevolg van membraandepolarisatie waarneembaar. EYFP-Parkin is echter nog steeds homogeen verspreid over het cytoplasma.

55 minuten na toediening van FCCP wordt EYFP-Parkin gerekruteerd naar de beschadigde mitochondriale membranen om het mitofagieproces in gang te zetten. De verplaatsing van EYFP-Parkin naar het mitochondriale membraan na toediening van FCCP wordt getoond in deze representatieve time-lapse movie. Zodra de methode onder de knie is, kan deze techniek in twee uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.

Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van autofagie om mitochondriale recycling te experimenteren. Hierdoor kunnen cellen worden gebruikt om het mitofagieproces te bestuderen als een vorm van mitochondriale kwaliteitscontrole in de cellen.