Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen
12 februari 2016
Ontsteking speelt een centrale rol in de pathogenese van ischemische beroerte. Toenemend bewijs suggereert dat het als een tweesnijdend zwaard werkt, wat vroege hersenschade verergert, maar ook bijdraagt aan later herstel. Dit protocol beschrijft de isolatie van immuuncellen uit de ischemische hersenen en hun daaropvolgende flowcytometrische fenotypering.
Het algemene doel van deze procedure is om immuuncellen te isoleren uit de ischemische muisbrein voor hun kwantificering en fenotypische karakterisering door middel van multiparametrische flowcytometrie. Analyse van post-ischemische ontsteking in de hersenen door middel van multicolor flowcytometrie biedt een diepgaand begrip van de immunologische processen die betrokken zijn bij de voortgang van laesies, herstel en het algemene resultaat van de beroerte. Het belangrijkste voordeel van deze procedure is de snelle, eenstaps dichtheidsgradiëntcentrifugering, die de isolatie van grote aantallen levensvatbare immuuncellen uit de ischemische muisbrein mogelijk maakt.
De toepassing van deze techniek richt zich op de identificatie en validatie van nieuwe immunomodulerende behandelingsstrategieën die kunnen worden toegepast in een breder tijdvenster van de beroerte. Begin door het ene uiteinde van een peristaltische perfusiepompslang in ijskoud calcium- en magnesiumvrij HBSS te dompelen. Bevestig een stompe 23-gauge naald aan het andere uiteinde van de slang.
En zet de pomp aan om de slang volledig te vullen met HBSS. Plaats vervolgens een geëuthanasieerde muis rugligging op een dissectiebord ingebed in een plastic bak, en prik de voor- en achterpoten, zo breed mogelijk uitgespreid, vast met 20-gauge naalden. Gebruik een paar rechte, een op twee tanden tang om de buikhuid vast te grijpen, maak een laterale insnijding door het integument en de buikwand met scherpe Iris-schaar om de lever bloot te leggen.
Til vervolgens het borstbeen op en gebruik de stompe kling van een paar scherp-stomp Iris-schaar om het diafragma te inciseren. Snijd doorgaans de laterale ribbenkast aan beide zijden in caudocraniale richting, zorg ervoor dat de long, het hart en de thoracale slagaders niet worden beschadigd, en gebruik stompe tang om de huidflap te passen. Prik de flap vast aan het dissectiebord en scheid voorzichtig het hart van het bindweefsel.
Houd het hart vast met een stompe tang, steek vervolgens het uiteinde van de 23-gauge naald aan het einde van de perfusieslang in de apex van de linker ventrikel, zorg ervoor dat het intraventriculaire septum niet wordt beschadigd. Snijd met scherpe Iris-schaar de rechter atrium en start onmiddellijk de pomp, zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan tijdens het pompen. Wanneer de lever een lichte koffiekleur krijgt, gebruik rechte chirurgische schaar om de muis net achter de schedel te onthoofden.
Gebruik vervolgens de Iris-schaar om een middenlijn insnijding in de hoofdhuid te maken. Wanneer de schedel zichtbaar is, plaats een punt van scherpe Iris-schaar in het foramen magnum en maak een laterale insnijding in het bot. Herhaal de insnijding aan de andere kant.
Gebruik vervolgens scherpe Iris-schaar om voorzichtig vanuit dezelfde holte omhoog naar de middenlijn, richting de neus te snijden. Gebruik fijne tang om voorzichtig de schedelbeenderen van elke hersenhelft te verwijderen. Til vervolgens de hersenen op met een spatel en gebruik scherpe Iris-schaar om voorzichtig de hersenzenuwvezels te dissecteren die het aan de schedel bevestigen.
Plaats de hersenen in een 15-milliliterbuisje, met 10 milliliter HBSS met calcium en magnesium op ijs. Om het hersenweefsel te dissociëren in een enkele celsuspensie, gebruik eerst een schone scheermes om voorzichtig de hersenstammen en het cerebellum te verwijderen. Gebruik vervolgens een andere schone scheermes om de hersenen in het midden door te snijden, waarbij elk hemisfeer in drie stukken van ongeveer gelijke grootte wordt gesneden langs het coronale vlak.
Gebruik het zuigereind van een vijf-milliliter spuit om de stukken hersenweefsel door een 100-micron celzeven te drukken, terwijl de zeven voortdurend wordt gespoeld met ijskoud HBSS met calcium en magnesium. Plaats vervolgens de gehomogeniseerde weefsels op ijs. Wanneer alle monsters zijn verwerkt, centrifugeer de celsuspensies en gooi voorzichtig de supernatanten weg.
Resuspendeer de pellets in één milliliter spijsverteringsbuffer. Breng vervolgens de celsuspensie over in een tweede milliliterbuisje en incubeer de cellen onder langzame continue rotatie bij 37 graden Celsius. Na een uur, zeef de celsuspensie door een 70-micron celzeven en spoel het filter grondig met drie milliliter wasbuffer met DNase.
Was vervolgens de zeven met 15 milliliter DNase-vrije wasbuffer, centrifugeer de cellen en gooi het supernatant weg. Om de celresten en myeline te verwijderen, resuspendeer de cellen in vijf milliliter kamertemperatuur, 25% dichtheidsgradiëntmedium en breng de celsuspensie over in een 15-milliliterbuisje. Meng de cellen in de gradiënt grondig met herhaald zacht pipetteren.
Spin vervolgens de celoplossing neer. Aan het einde van de scheiding, aspireer voorzichtig de myeline laag en supernatant zonder de pellet te verstoren en resuspendeer de cellen in 10 milliliter DNase-vrije wasbuffer. Breng de cellen over in een 15-milliliterbuisje en centrifugeer ze opnieuw, resuspendeer het pellet in 100 microliters koude wasbuffer.
Tel vervolgens het aantal levensvatbare cellen door trypanblauwuitsluiting en bewaar ze bij vier graden Celsius. Voordat u begint met immunokleuring, incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius met anti-murine CD26/CD32 Fc receptor blokkeringsreagens om enige niet-specifieke binding te voorkomen. Voeg vervolgens de geconjugeerde fluorofoor primaire antilichamen van belang toe bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten in het donker.
Aan het einde van de incubatie, was de cellen in twee milliliter flowcytometriebuffer. Spin neer. Resuspendeer het pellet in 200 microliters flowcytometriebuffer, en bewaar de monsters bij vier graden Celsius tot flowcytometrische analyse.
Om het absolute aantal binnendringende immuuncellen te kwantificeren door parelketting, pipet exact 40 microliters flowcytometrie en 10 microliters celsuspensie omgekeerd in een tellende buis bevattende een bekend aantal fluorescerende pareltjes. Incubeer vervolgens de cel- en parelsuspensie met FITC-gelabeld CD45 antilichaam bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten in het donker, gevolgd door omgekeerd
Overzicht
Dit protocol beschrijft de isolatie van immuuncellen uit de ischemische muizenhersenen en de fenotypische karakterisering daarvan middels flowcytometrie. Er wordt ingegaan op de dubbele rol van inflammatie bij ischemisch infarct, waarbij deze zowel bijdraagt aan vroege schade als aan later herstel.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Beroertenonderzoek
Achtergrond
- Ontsteking is cruciaal in de pathogenese van een ischemische beroerte.
- Het kan vroege hersenbeschadiging verergeren, terwijl het bij later herstel kan helpen.
- Inzicht in de dynamiek van immuuncellen is essentieel voor de ontwikkeling van behandelingen.
- Flowcytometrie maakt een gedetailleerde analyse van immuuncelfenotypen mogelijk.
Doel van de studie
- Het isoleren en karakteriseren van immuuncellen uit het ischemische brein.
- Het analyseren van post-ischemische inflammatie en de effecten hiervan op de uitkomsten van een beroerte.
- Het identificeren van potentiële immunomodulerende behandelstrategieën.
Gebruikte methoden
- Isolatie van immuuncellen via densiteitsgradiëntcentrifugatie.
- Flowcytometrische analyse voor kwantificatie en fenotypering.
- Gebruik van calcium- en magnesiumvrije HBSS voor de verwerking van cellen.
- Toevoeging van specifieke antilichamen voor immunokleuring.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van levensvatbare immuuncellen uit het ischemische brein.
- Identificatie van verschillende immuuncelpopulaties middels flowcytometrie.
- Inzichten in de rol van inflammatie bij de progressie en het herstel na een beroerte.
- Potentieel voor de ontwikkeling van nieuwe behandelstrategieën op basis van immuunprofilering.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van immuunresponsen bij een beroerte.
- Inzicht in de dynamiek van immuuncellen kan bijdragen aan therapeutische benaderingen.
- Verder onderzoek is nodig om immunomodulerende behandelingen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Ischemische beroerte triggert een complexe immuunrespons die zowel de vroege beschadiging als het latere herstel beïnvloedt, waardoor het profileren van immuuncellen een kritisch onderdeel is van preklinisch onderzoek naar beroertes. Dit protocol maakt reproduceerbare isolatie en fenotypische karakterisering van herseninfiltrerende leukocyten mogelijk, wat targetvalidatie en mechanische risicoreductie bij de ontwikkeling van immunomodulerende therapieën ondersteunt. Door kwantitatieve, multiparametrische flowcytometriegegevens van één enkele biologische replica te leveren, vergroot het het voorspellend vertrouwen in vroege ontdekkingsfasen en informeert het de prioritering van de portfolio van neuroimmunomodulerende kandidaten.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de infiltratie van immuuncellen in het ischemische brein te kwantificeren en fenotypisch te karakteriseren.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door gestandaardiseerde isolatie van levensvatbare immuuncellen middels een procedure met een enkel-laags dichtheidsgradiënt.
- Predictieve waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targets door specifieke leukocytenpopulaties (bijv. Ly-6G+ neutrofielen, Ly-6C-high monocyten) te koppelen aan de pathofysiologie en herstelprocessen van een beroerte.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening van immunomodulerende verbindingen door zeer reproduceerbare celaantallen per hemisfeer te leveren.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via een snelle, eenstaps Percoll-gebaseerde dichtheidsgradiëntcentrifugatie die myeline en debris verwijdert.
- Klaar voor screening: Maakt multiparametrische flowcytometrie-panels in één replica mogelijk, wat schaalbare evaluatie van immunomodulerende kandidaten ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten door de dynamiek van immuuncellen te modelleren bij occlusie van de middelste cerebrale arterie bij muizen, een standaard preklinisch birstelmodel.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door longitudinale tracking van immuunfenotypen na ischemie mogelijk te maken.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt beslissingen over immunomodulerende kandidaten door verschuivingen in de balans tussen monocyten/macrofagen en neutrofielenkinetiek te identificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie, in het bijzonder voor immunomodulerende strategieën bij beroertes, door immuuncelphenotypes te verschaffen die inzicht geven in het werkingsmechanisme en de targetinteractie.
- Ontdekkingsbiologie: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking ondersteunt door kwantificering van CD45-high leukocyten en subset-identificatie via Ly-6G, CD3, CD19 en CD11b markers.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid via reproduceerbare opbrengsten van immuuncellen en compatibiliteit met bead-gebaseerde absolute tellingen voor nauwkeurige kwantificering van immuuncellen.
- Analytica: Benadrukt flowcytometrie-readouts die vergelijking van immuuncelfrequenties mogelijk maken tussen ischemische, contralaterale en sham-condities.
- Translationeel Onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit door het volgen van immuuncelpopulaties die betrokken zijn bij zowel de beschadigings- als herstelfasen van een beroerte.
- Herbruikbaarheid binnen de Organisatie: Presenteert de methode als een herbruikbaar platform voor neuro-immunologische studies, aanpasbaar aan verschillende beroertemodellen en therapeutische interventies.
Operationele en ondernemingsbrede impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in neuro-immune interacties.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de isolatie van immuuncellen uit ischemisch weefsel.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium bij immunomodulerende programma's.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van profileringsgegevens van immuuncellen uit gevalideerde preklinische modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste expertise in muizperfusie, hersendissectie en enzymatische weefseldissociatie.
- Noodzaak van centrifugatieapparatuur, een flowcytometer en reagentia, waaronder Liberase, Percoll en Fc-receptorblokkers.
- Standaardisatie tussen laboratoria vereist een consistente transcardiale perfusie en dissociatie-efficiëntie om vergelijkbare celopbrengsten te waarborgen.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het bijstellen van de enzymatische digestietijd en de gradiëntcondities voor verschillende muizenstammen of letselmodellen.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van een grondige dissociatie om contaminatie door debris te voorkomen en de noodzaak van een volledige perfusie om circulerende, niet-infiltrerende cellen uit te sluiten.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Transcardial Perfusion and Brain Dissection
4:24
Cerebral Tissue Dissociation
6:21
Myelin/cell Debris Removal by Density Gradient Separation
7:34
Flow Cytometry Immunostaining and Counting Bead Absolute Quantification
9:14
Results: Representative Infiltrating Immune Cell Analysis in the Ischemic Mouse Brain
10:56
Conclusion
