Name: Ontwikkeling van een Alpha-synucleïne Based ratmodel van de ziekte van Parkinson via stereotactische injectie van een recombinant adeno-geassocieerde virale vector (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-28T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Leer hoe je een virale vector-gebaseerd dierlijk model voor de ziekte van Parkinson ontwikkelt via stereotactische injectie in het centrale zenuwstelsel. Deze methode maakt gerichte genexpressie in specifieke hersengebieden mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Joris Van Asselberghs en Ann Van Santvoort voor hun uitstekende technische bijstand. Onderzoek werd gefinancierd door het IWT-Vlaanderen (IWT SBO / 80.020), het FWO Vlaanderen (G.0768.10), van het EG-FP6 programma &#39;Dimi&#39; (LSHB-CT-2005-512146), het KP7 OTO-project MEFOPA (GEZONDHEID -2.009-241.791), het KP7-programma &#39;Inmind&#39; (HEALTH-F2-2011-278850), de KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, Imir PF / 10/017), en de MJFox Foundation (Target validatie 2010). A. Van der Perren en C. Casteels zijn een postdoctorale bursalen van het Vlaams Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek. K. Van Laere is senior klinisch fellow van het Vlaams Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek.

Alle dierproeven worden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen richtlijn van de Raad van 24 november 1986 (86/609 / EEG) zijn goedgekeurd door de bio-ethische commissie van de Universiteit van Leuven (België). 1. Recombinant AAV productie en zuivering Opmerking: rAAV vector productie en zuivering werd uitgevoerd door Leuven Viral Vector Core (LVVC) zoals eerder beschreven 17. <ol><li> In het kort transfecteren subconfluente laag (&lt;50) doorgang hechtende HEK 293T cellen met een 25kD lineaire polyethyleenimine 150 nM NaCl transfectieoplossing en drie verschillende plasmiden in een verhouding van 1: 1: 1 in DMEM medium 2% foetaal runderserum. Na 24 uur incubatie bij 37 ° C in een 5% CO 2 Vervang het medium met vers DMEM medium 2% foetaal runderserum. Noot: De plasmiden bevatten de constructen voor AAV7 serotype, de AAV transferplasmide codeert voor de menselijke mutant A53T α-SYN onder de controle van de versterkte CMVie synapsin1 promotor en de pAdvDeltaF6 adenovirale helper plasmide 17. </li><li> Oogst de drager 5 dagen na transiënte transfectie en concentraat via tangentiële flow filtratie 17. </li><li> Zuiver het rAAV vectordeeltjes in het geconcentreerde medium met behulp van een stapsgewijze gradiënt 17 iodixanol. </li><li> Gebruik standaard technieken van real-time PCR voor genomische kopie (GC) bepaling. In dit protocol, een vector titer van 3,0 E11 GC / ml werd gebruikt om een α-SYN gebaseerde rattenmodel ontwikkeld voor PD 17. </li></ol> 2. stereotactische injectie van rAAV α-SYN vector in de SN van de rat (figuur 2) <ol><li> House acht weken oud vrouwelijke Wistar-ratten met een gewicht van ongeveer 200-250 g onder een normale 12 uur licht / donker cyclus met vrije toegang tot gepelleteerde voedsel en water uit de kraan. </li><li> Verzend rat intraperitoneale (ip) anesthesie met een mengsel van ketamine (60 mg / kg) en medetomidine (0,4 mg / kg). Zodra de rat wordt verdoofd en reageert nietwanneer knijpen de verschillende poten, toedienen van een micro-transponder subcutaan op de rug van de rat voor verdere erkenning behulp van een micro-transponder implantaatinjector. Controleer of de micro-transponder juist gepositioneerd en kunnen door de leesinrichting worden gelezen. </li><li> Snijd het haar bovenop de hoofdhuid. Breng een plaatselijke verdoving zowel de hoofdhuid en oren. Voer de rest van de chirurgische procedure onder een laminaire stroming behulp van aseptische technieken. </li><li> Plaats de ratten in een stereotactische hoofd frame met behulp van twee oor bars, een mond en een neus bar. Bedek het lichaam van de rat met een papieren deken op een daling van de lichaamstemperatuur voorkomen. Pas een oculair smeermiddel om te voorkomen dat de ogen uitdrogen. </li><li> Ontsmet de hoofdhuid met jodium 1% in isopropanol 70% en een kleine incisie in de middellijn van de hoofdhuid. Voorzichtig schrapen weg de membranen op de schedel en spoel met een zoutoplossing. Laat de schedel drogen gedurende enkele minuten. Let op de schedelnaden en de twee referentiepunten: Bregma en Lambda. </li&gt; <li> Om de rAAV vector in de SN te injecteren, bepalen de coördinaten in de richting van Bregma (achterwaartse: 5,3 mm; mediolateral: 2,0 mm en dorsoventral: 7,2 mm berekend op basis van de dura). Opmerking: De driedimensionale coördinaten van elk gebied van belang kan worden berekend met een stereotaxische atlas van de rattenhersenen, toepassing Bregma met anatomisch referentiepunt. </li><li> Vul een 10 ul micro-injectie spuit (30 gauge 20 mm) met rAAV vector en plaats het in de stereotaxische instrument verbonden met een gemotoriseerde micro-injectie pomp. Regel het volume door het vrijgeven van een daling van de vector en te elimineren in een polyvalent schoonmaakmiddel pH 9 (bijv RBS). </li><li> Visueel controleren of de kop is bevestigd recht in het hoofd frame en evalueren van de links-rechts as. Zorgvuldig visueel bepalen de achterwaartse en mediolateral coördinaten voor Bregma en Lambda en meet de hoogte met behulp van een 30 gauge 20 mm naald in de dorsoventral arm van de stereotactische frame. <ol><li> laat amaximale van 0,3 mm verschil in hoogte tussen Bregma en Lambda. Plaats de naald terug op Bregma en de achterwaartse en mediolateral coördinaten toe te passen door het bewegen van de achterwaartse en de mediolateral arm van de stereotactische frame. </li></ol></li><li> Op de plaats van de injectie, het meten van de hoogte van de schedel en ervoor zorgen dat het verschilt niet meer dan 0,3 mm van de hoogte van Bregma. Boor een gat in de schedel met een diameter van ongeveer 2 mm. Meet de hoogte van de dura, zal dit dienen als referentie gelden de dorsoventral coördineren. Als alternatief aftrekken vaste dikte van de schedel (0,9 mm). </li><li> Doordringen in de dura met behulp van een 26 gauge naald en te absorberen het bloed met een steriele. Wacht totdat alle bloeden is gestopt voordat u verder gaat. </li><li> Langzaam steek de micro-injectie 10 pl injectiespuit vooraf gevuld met vector oplossing in de hersenen naar de vooraf bepaalde diepte (dorsoventral coördinaat). Wacht 1 min met de naald op zijn plaats. Injecteer 3 ulvector oplossing (3,0 E11 genoom kopieën / ml (gemiddeld vector dosis) of 1,0 E12 GC / ml (hoog vector dosis) rAAV2 / 7 α-SYN of eGFP controlevector) met de gemotoriseerde micro-injectie pomp met een debiet van 0,25 pl / min. </li><li> Na injectie, houdt de naald op zijn plaats voor nog eens 5 minuten voordat langzaam te verwijderen. Steek de hoofdhuid met behulp van gecoate gevlochten polyester 3.0, desinfecteren met 1% jodium in 70% isopropanol en voorzichtig het dier uit het stereotactische instrument. draai eerst de neus en mond bar, waarna de twee oor bars. </li><li> De anesthesie keren injecteren ratten intraperitoneaal met 0,5 mg / kg atipamezol en plaats de rat in een schone kooi op een verwarmingsplaat van 38 ° C tot ontwaakt. Bedek de rat met een papieren deken op een daling van de lichaamstemperatuur voorkomen. </li><li> Zorg voor eenvoudige toegang tot voedsel en water voor de eerste uren. Bewaken van de rat voor de eerste paar dagen. Indien nodig passen analgesie. Opmerking: Het is niet nodig om de steken uit t verwijderenHij schedel. Na 1-2 weken de schedel volledig is hersteld en de steken komen los. </li></ol> 3. Beoordeling van rAAV2 / 7 α-SYN geïnjecteerde ratten met behulp van niet-invasieve PET Imaging, gedragstesten en immunohistochemische analyse <ol><li> Om de opvolging van de kinetiek van nigrostriatale dopaminerge neurodegeneratie niet-invasief de loop der tijd bij individuele dieren, kwantificeren dopamine transporter (DAT) binding met behulp van kleine dieren positron emissie tomografie (PET) en een tracer van de DA Transporter bijvoorbeeld [18F] -FECT 16 . </li><li> Om te onderzoeken of het niveau van dopaminerge neurodegeneratie is voldoende om motorische stoornissen in de ratten te induceren, onder voorbehoud van de ratten naar de cilinder test om spontaan voorpoot gebruik te evalueren. <ol><li> Plaats de rat in een 20 cm breed heldere glazen cilinder en videotape het gedrag tijdens de verticale bewegingen langs de muur en de landing na een achterste. Score het aantal contacten die door elke voorpoot voor een totaal van 20contacten. Voor een gedetailleerde beschrijving van de scoring criteria zie Schallert et al. 18 Druk het aantal verminderde voorpoot contacten (bijv linker voorpoot) als een percentage van de totale voorpoot contacten (links plus rechts voorpoot). Let op: Niet-laesie controle ratten met beide poten in gelijke mate moet rond de 50% in deze test scoren. </li></ol></li><li> Voer immunohistochemische analyse (IHC) om het niveau van transgenexpressie en dopaminerge celverlies beoordelen. <ol><li> Op verschillende eindfase, offeren de ratten met een overdosis van natriumpentobarbital (60 mg / kg, ip) en het uitvoeren van een intracardiale perfusie met koude zoutoplossing, gevolgd door 4% paraformaldehyde in PBS 19. Fixeer de hersenen gedurende de nacht bij 4 ° C en gesneden 50 pm dikke coronale hersensecties met een trillende microtoom. </li><li> Voer IHC vlekken op vrij zwevende delen met behulp van antilichamen tegen α-SYN en tyrosine hydroxylase tot α-SYN expressie niveaus en de le analyserenvel van neurodegeneratie 16. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Magen, I., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mouse+models+of+Parkinson%27s+disease+The+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art.</a> Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).</li>
<li>Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+loss+and+inclusion+body+formation+in+alpha-synuclein+mice%3A+implications+for+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders.</a> Science. 287, 1265-1269 (2000).</li>
<li>Freichel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+cognitive+decline+and+amygdala+pathology+in+alpha-synuclein+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice.</a> Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).</li>
<li>Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mouse+models+of+parkinsonism%3A+strengths+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations.</a> NeuroRx. 2, 495-503 (2005).</li>
<li>Kahle, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+insolubility+of+alpha-synuclein+in+human+Lewy+body+diseases+is+recapitulated+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model.</a> Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).</li>
<li>Chesselet, M. F., Richter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+Parkinson%27s+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Modelling of Parkinson's disease in mice.</a> Lancet Neurol. 10, 1108-1118 (2011).</li>
<li>Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+genes+at+work+in+the+living+brain+with+non-invasive+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging.</a> Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).</li>
<li>Manfredsson, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV-mediated+nigral+human+parkin+over-expression+partially+ameliorates+motor+deficits+via+enhanced+dopamine+neurotransmission+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson's disease.</a> Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).</li>
<li>Vercammen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+protects+against+neurotoxicity+in+the+6-hydroxydopamine+rat+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson's disease.</a> Mol Ther. 14, 716-723 (2006).</li>
<li>Winklhofer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parkin+protein+as+a+therapeutic+target+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+therapeutic+targets%22%5BJournal%5D)">The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson's disease.</a> Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).</li>
<li>Kirik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson-like+neurodegeneration+induced+by+targeted+overexpression+of+alpha-synuclein+in+the+nigrostriatal+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system.</a> J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).</li>
<li>Kirik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nigrostriatal+alpha-synucleinopathy+induced+by+viral+vector-mediated+overexpression+of+human+alpha-synuclein%3A+a+new+primate+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).</li>
<li>Lauwers, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathology+and+neurodegeneration+in+rodent+brain+induced+by+lentiviral+vector-mediated+overexpression+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+pathology%22%5BJournal%5D)">Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein.</a> Brain pathology. 13, 364-372 (2003).</li>
<li>Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+cell+loss+induced+by+human+A30P+alpha-synuclein+gene+transfer+to+the+rat+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra.</a> Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).</li>
<li>Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vector-Based+Models+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Beh+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral Vector-Based Models of Parkinson's Disease.</a> Curr Top Beh Neurosci. , (2014).</li>
<li>Van der Perren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+follow-up+and+characterization+of+a+robust+rat+model+for+Parkinson%27s+disease+based+on+overexpression+of+alpha-synuclein+with+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson's disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors.</a> Neurobiol Aging. , (2014).</li>
<li>Van der Perren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+stable+transduction+of+dopaminergic+neurons+in+rat+substantia+nigra+by+rAAV++2%2F1%2C+2%2F2%2C+2%2F5%2C+2%2F6.2%2C+2%2F7%2C+2%2F8+and+2%2F9%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9.</a> Gene Ther. , (2011).</li>
<li>Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+plasticity+and+assessment+of+forelimb+sensorimotor+outcome+in+unilateral+rat+models+of+stroke%2C+cortical+ablation%2C+parkinsonism+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).</li>
<li>Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+and+Methods+of+Animal+Brain+Surgery%3A+Perfusion%2C+Brain+Removal%2C+and+Histological+Techniques.+Brain+Neurotrauma%3A+Molecular%2C+Neuropsychological%2C+and+Rehabilitation+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects.</a> Frontiers in Neuroengineering. , (2015).</li>
<li>Dale, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+Lewy+bodies+and+pale+bodies+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).</li>
<li>Dawson, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+flies+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of flies and mice.</a> Science. 288, 631-632 (2000).</li>
<li>Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+PD%3A+pieces+of+the+same+puzzle%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Animal models of PD: pieces of the same puzzle?</a> Neuron. 35, 219-222 (2002).</li>
<li>LeVine, H. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+beta-sheet+amyloid+fibril+structures+with+thioflavin+T%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T.</a> Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).</li>
<li>Oliveras-Salva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV2%2F7+vector-mediated+overexpression+of+alpha-synuclein+in+mouse+substantia+nigra+induces+protein+aggregation+and+progressive+dose-dependent+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration.</a> Mol Neurodegener. 8, (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen reëel of potentieel belangenconflict.

Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. De vector titer als de vector zuiverheid rechtstreeks welke fenotypische uitkomst van het model. Overmatig vector titers of onvoldoende gezuiverd vector partijen kan leiden tot niet-specifieke toxiciteit. Daarom is het gebruik van hoge kwaliteit vector series en geschikt controlevectoren onontbeerlijk. Verder is de exacte positionering van het hoofd van de rat in het stereotactische frame en de nauwkeurige bepaling van de coördinaten essentieel is gericht op de su...

Om de pathofysiologie van PD te bestuderen en om nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen, is er een dringende behoefte aan diermodellen die sterk lijken op de neuropathologie, fysiologie en motorische symptomen van de menselijke PD. Hoe hoger de voorspellende waarde, hoe beter we nieuwe therapieën van diermodellen vertalen naar patiënten. De ontdekking van alfa-synucleïne (α-SYN) als eerste PARK gen 1997 geleid tot de ontwikkeling van de eerste genetische PD modellen. Veel transgene muizen overexpressie menselijk wild-type (WT) of mutant (A30P, A53T) α-SYN zijn gegenereerd in het afgelopen decennium. De niveaus van α-SYN overexpressie hebben bewezen cruciaal in de ontwikkeling van de pathologie zijn. Ook de muizenstam, de aanwezigheid of afwezigheid van endogene α-SYN en of de volledige lengte of een afgeknotte vorm wordt uitgedrukt, speelt een rol (gedetailleerd overzicht van Magen en Chesselet 1). Overexpressie van zowel WT en verscheidene klinische mutanten van humaan &amp;# 945; -SYN in transgene muizen leidt tot pathologische accumulatie van α-SYN en neuronale dysfunctie 2-6. Echter, tot nu toe de meeste transgene α-SYN muismodellen geen duidelijke dopaminerge cel verlies en dopamine-afhankelijke behavioral tekorten weer te geven. Deze hindernis werd overwonnen door directe targeting van de substantia nigra (SN) met virale vectoren overexpressie α-SYN. Virale vectoren zijn afgeleid van virussen die gemakkelijk cellen kunnen infecteren, genetisch materiaal in hun gastheergenoom en dwingen de gastheercel het virale genoom repliceren om nieuwe virusdeeltjes produceren. Virussen kunnen worden gemanipuleerd om niet-replicerende virale vectoren op hun vermogen om in cellen en genen te introduceren behouden. Door schrapping delen van het virale genoom en te vervangen door de genen van belang, zal de toepassing van de vector tot een enkele ronde infectie zonder replicatie in de gastheercel, algemeen aangeduid als &quot;transductie&quot;. Virale vectoren ceen worden gebruikt voor overexpressie en silencing. De expressie transgen kan een reporter proteïne (bv groen fluorescerend eiwit of vuurvlieg luciferase) 7, een therapeutisch eiwit voor gentherapie toepassingen of 8-10, zoals we zullen zich in dit papier, een ziekte gerelateerd eiwit dat voor ziektemodel 11 -14. Virale vector gemedieerde genafgifte verschaft een alternatieve manier om transgenen in het CNS tot expressie met een aantal voordelen. Met behulp van lokale transgene levering kunnen specifieke hersengebieden worden gericht. Verder kunnen transgene expressie worden geïnduceerd tijdens de volwassenheid minder kans op compensatiemechanismen tijdens de ontwikkeling. Ook kunnen modellen worden gemaakt in verschillende soorten en rassen. En ten slotte, verschillende transgenen kan gemakkelijk gecombineerd worden. Gebruik virale vectoren, kunnen hoge transgenexpressie niveaus worden bereikt, die cruciaal zou kunnen zijn aangezien het begin van de ziekte en de ernst vaak afhangen van de mate van OVEREXPression. Verschillende vectorsystemen basis van verschillende virussen ontwikkeld. De keuze van de vector is afhankelijk van de grootte van het gen van belang, de gewenste duur van de genexpressie, de doelcel en bioveiligheidsimplicaties. Voor stabiele genoverdracht in de hersenen, lentivirale (LV) en recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) vectoren worden nu beschouwd als de vectorsystemen gekozen aangezien ze de efficiënte en langdurige genexpressie in de hersenen van knaagdieren. Voor specifieke targeting van de dopaminerge neuronen (DN) van de SN, hebben rAAV vectoren geleidelijk weggeconcurreerd LV vectoren vanwege hun hogere titers en transductie efficiëntie van DN. De beste α-SYN gebaseerde knaagdiermodellen momenteel beschikbaar zijn ontwikkeld vanuit een gecombineerde benadering, waarbij nieuwere AAV serotypes (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) en geoptimaliseerde vector constructen titers en zuiverheid 15,16. De vector titer evenals de vector zuiverheid directe invloedde fenotypische uitkomst van het model. Overmatig vector titers of onvoldoende gezuiverd vector partijen kan leiden tot niet-specifieke toxiciteit. Daarom passende controlevectoren onontbeerlijk. Geruime tijd investeringen in de virale vector productie, opschaling en procedures zuivering hebben ook bewezen dat het essentieel om reproduceerbare en hoge kwaliteit vector batches te verkrijgen.

<table><tbody><tr><td>Vrouwelijke 8 weken oude Wistar ratten</td><td>Janvier</td><td>/</td><td>200-250 g</td></tr><tr><td>Ketamine (Nimatek)</td><td>Eurovet animal health</td><td>804132</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine (Dormitor)</td><td>Orion-Pharma/ Janssen Animal Health</td><td>1070-499</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Locaal anesthetisch middel voor hoofdhuid en oren: Xyloca&iuml;ne 2% gel</td><td>Astrazeneca</td><td>0137-547</td><td></td></tr><tr><td>Terramycine</td><td>Pfizer</td><td>0132-472</td><td></td></tr><tr><td>Bupr&eacute;norfine (Vetergesic)</td><td>Ecuphar</td><td>2623-627</td><td></td></tr><tr><td>Jodium 1% isopropanol</td><td>VWR</td><td>0484-0100</td><td></td></tr><tr><td>stereotactische hoofdframe</td><td>Stoeling</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton-spuit (30 gauge -20 mm -pst 2)</td><td>Hamilton/ Filter Service</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>atipamezole (Antisedan)</td><td>Orion-Pharma/Elanco</td><td>1300-185</td><td></td></tr><tr><td>rAAV A53T &alpha;-SYN vector</td><td>LVVC, KU Leuven</td><td>/</td><td>https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/</td></tr><tr><td>natrium pentobarbital (Nembutal)</td><td>Ceva Sant&eacute;</td><td>0059-444</td><td></td></tr><tr><td>microtoom</td><td>Microm</td><td>HM650</td><td></td></tr><tr><td>konijn polyklonaal synucleïne Ab</td><td>Chemicon</td><td>5038</td><td>1:5.000</td></tr><tr><td>konijn polyklonaal TH Ab</td><td>Chemicon</td><td>152</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Lutetium oxyorthosilicaat detector-gebaseerde FOCUS 220 tomograph</td><td>Siemens/ Concorde Microsystems</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>radioligand: 18F-FECT</td><td>In house</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>L-dopa: Prolopa 125</td><td>Roche</td><td></td><td>6 mg/kg i.p.</td></tr><tr><td>DMEM, Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>N&deg; 31331-093</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Life Technologies</td><td>N&deg; 10270-106</td><td></td></tr><tr><td>25 kD lineaire polyethyleenimine (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Dichtheidsgradientmedium: Iodixanol</td><td>Sigma</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Optimen</td><td>Life Technologies</td><td>N&deg; 51985-026</td><td></td></tr><tr><td>Paxinos 1 watston steretactic atlas, vierde Editie</td><td>Elsevier</td><td>/</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een alpha-synucleïne based ratmodel van de ziekte van parkinson via stereotactische injectie van een recombinant adeno-geassocieerde virale vector

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

Om de moleculaire wegen van de ziekte van Parkinson (PD) onderzoeken en om nieuwe therapeutische strategieën, wetenschappelijke onderzoekers afhankelijk diermodellen. De identificatie van PD-geassocieerde genen heeft geleid tot de ontwikkeling van genetische PD modellen. De meeste transgene α-SYN muismodellen te ontwikkelen geleidelijke α-SYN pathologie, maar niet om duidelijke dopaminerge cel verlies en dopamine-afhankelijke behavioral tekorten weer te geven. Deze hindernis werd overwonnen door directe targeting van de substantia nigra met virale vectoren overexpressie-PD-geassocieerde genen. Lokale genafgifte via virale vectoren verschaft een aantrekkelijke manier om transgenen in het centrale zenuwstelsel tot expressie. Specifieke hersengebieden kan worden getarget (bijvoorbeeld de substantia nigra) kan expressie worden geïnduceerd in het volwassen omgeving en hoge expressieniveaus kunnen worden bereikt. Verder kunnen verschillende vector op basis van verschillende virussen worden gebruikt. Het protocol beschrijft alle cruciale stappen om een ​​virale vector uit te voereninjectie in de substantia nigra van de rat een virale vector gebaseerde alpha-synuclein diermodel voor de ziekte van Parkinson te ontwikkelen.

De opzet van het experiment is in Figuur 1 rAAV 07/02-gemedieerde overexpressie van A53T α-SYN induceert tekorten dopamine-afhankelijke motor. Om te onderzoeken of het niveau van de α-SYN overexpressie is voldoende om motorische stoornissen in de ratten te induceren, we onderworpen de ratten naar de cilinder test om spontaan voorpoot gebruik (figuur 3A) te evalueren. Va...

Dit manuscript beschrijft hoe virale vector-gemedieerde lokale gen-levering een aantrekkelijke manier biedt om transgenen in het centrale zenuwstelsel tot expressie te brengen. Het protocol schetst alle cruciale stappen om een injectie met een virologisch vector uit te voeren in de substantia nigra van de rat om een op een virologisch vector gebaseerd diermodel voor de ziekte van Parkinson te ontwikkelen.

Ontwikkeling van een Alpha-synucleïne Based ratmodel van de ziekte van Parkinson via stereotactische injectie van een recombinant adeno-geassocieerde virale vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een op virale vectoren gebaseerd diermodel voor de ziekte van Parkinson via stereotactische injectie in het centrale zenuwstelsel. Deze methode kan worden gebruikt voor het ontwikkelen van standaard diermodellen die preklinische drugstesten mogelijk maken en kan nuttig zijn bij het bestuderen van het moleculaire mechanisme van de ziekte van Parkinson, evenals vele andere neurodegeneratieve aandoeningen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt voor het specifiek targeten van hersengebieden.Een hoge expressie in de hersenen kan worden bereikt en dit kan worden gebruikt om diermodellen te creëren in specifieke dierstammen en soorten. Er zijn verschillende uiteindelijke vectorsystemen ontwikkeld. De keuze van het vectorsysteem hangt af van de grootte van het fragment dat u wilt tot expressie brengen, de duur van de genexpressie, de doelgebieden die u wilt targeten en kwesties met betrekking tot biologische veiligheid.De procedure wordt gedemonstreerd door Annelies Aertgeerts, een laborant uit ons laboratorium. Begin met het correct anesthetiseren van een acht weken oude vrouwelijke Wistar-rat volgens goedgekeurde protocollen. Controleer of een chirurgisch vlak van anesthesie is bereikt door elke poot samen te knijpen en vast te stellen dat de terugtrekreflex afwezig is.Gebruik vervolgens een MicroTransponder-implanteerder om een MicroTransponder op de rug van de rat te plaatsen. Controleer of de MicroTransponder correct is gepositioneerd en of er een uitlezing kan worden verkregen. Knip nu het haar op de schedel van de rat en breng een plaatselijke verdoving aan op de schedel en de oren.Verplaats de rat naar een laminaire flowkast en voer de rest van de procedure uit met aseptische technieken. Plaats de rat in het stereotaxische frame door eerst de oorstaven en vervolgens de mond- en neusstaf te bevestigen. Bedek het lichaam van de rat met een papieren deken om een daling van de lichaamstemperatuur te voorkomen.Breng een oogsmeermiddel aan om uitdroging van de ogen te voorkomen. Desinfecteer vervolgens de hoofdhuid volgens de goedgekeurde procedures. Hierbij wordt één procent jodium in 70% isopropyl gebruikt.Maak een kleine incisie in de middellijn van de hoofdhuid, schraap voorzichtig de membranen van de schedel weg en spoel met zoutoplossing. Laat de schedel drogen en zorg ervoor dat het bregma en de lambda duidelijk zichtbaar zijn. Vul nu een micro-injectiespuit van 10 µL (30 gauge, 20 mm) met recombinant AAV en plaats deze op de gemotoriseerde micro-injectiepomp die is aangesloten op het stereotaxische instrument.Voor de specifieke transductie van dopaminerge neuronen in de substantia nigra zijn recombinante AV-vectoren de eerste keuze vanwege hun hoge titers en efficiëntie bij het transduceren van dopaminerge neuronen. Test de doorstroming door een druppel AAV vrij te laten. Verwijder alle vrijgekomen AAV met een polyvalent reinigingsmiddel.Controleer visueel of het hoofd recht in het hoofdframe is gefixeerd. Controleer vervolgens of de schedel vlak ligt door eerst de naaldpunt naar bregma te bewegen en de hoogte op dit punt te meten, door de naaldpunt in dorso-ventrale richting te laten zakken tot deze de schedel raakt. Herhaal deze procedure bij lambda.Nadat de naald naar bregma is teruggebracht, wordt de naald in de anteroposterieure en mediolaterale richting verplaatst naar de stereotaxische coördinaten voor microinjectie. Noteer de coördinaten. Meet op de injectieplaats de hoogte van de schedel zoals eerder gedaan, en zorg ervoor dat deze niet meer dan 0,3 mm afwijkt van de hoogte van bregma.Boor vervolgens voorzichtig een gat van 2 mm in de schedel. Zodra het gat is geboord, wordt de hoogte van de dura gemeten om het referentiepunt te bepalen vanaf waar de dorso-ventrale coördinaat wordt toegepast. Penetreer de dura met een naald van gauge 26.Absorbeer eventueel bloed met het steriele gaasje en ga pas verder nadat alle bloedingen zijn gestopt. Breng nu langzaam de naald van de voorgevulde micro-injectiespuit in de hersenen tot de dorso-ventrale coördinaat. Pauzeer vervolgens één minuut.Inject vervolgens 3 µL AAV met een snelheid van 0,25 µL per minuut. Laat de naald na de injectie nog vijf minuten op zijn plaats zitten om terugstroming langs het naaldkanaal te voorkomen voordat u deze langzaam verwijdert. Hecht de hoofdhuid met gevlochten polyester 3.0 en desinfecteer de huid met 1% jodium en 70% isopropyl.Maak de neus- en mondstang los, gevolgd door de twee oorstangen, om het dier voorzichtig uit het stereotaxische instrument te verwijderen. Dien op dit moment analgesica toe en, indien nodig, een middel om de anesthesie om te keren. Plaats de rat vervolgens in een schone kooi op een warmteplaat die is ingesteld op 38 °C en houd het dier nauwlettend in de gaten tot het wakker wordt.Na de chirurgische ingreep kan de kinetiek van neurodegeneratie in het gehele dier worden bestudeerd met behulp van gedragstesten en PET-imaging, en na opoffering met immunohistochemische technieken. De cilindertest om het spontane gebruik van de voorpoten te evalueren, werd uitgevoerd op verschillende tijdstippen na micro-injectie van recombinant AAV dat A53T Mutation alpha synuclein tot expressie brengt in de substantia nigra. Vanaf drie weken na de injectie werd een significante motorische beperking waargenomen bij ratten die de mediane dosis ontvingen.Vier weken na de injectie werd een afname van 50% in het spontane gebruik van de contralaterale voorpoot waargenomen. De controle-dieren die eGFP kregen geïnjecteerd, vertoonden daarentegen geen asymmetrie in het gebruik van de voorpoten. Ratten die een hogere dosis recombinant AAV 2/7A53T alpha synucleïne ontvingen, vertoonden een meer uitgesproken beperking in het gebruik van de voorpoot 29 dagen na de injectie.Om aan te tonen dat de waargenomen motorische stoornis dopamine-afhankelijk was, werd een enkele dosis L-dopa toegediend. Toen de cilindertest 45 minuten na de L-dopa-behandeling werd herhaald, werd een volledig herstel van het gebruik van de voorpoot waargenomen bij de dieren die waren geïnjecteerd met recombinant AAV 2/7A53T alpha synucleïne. Om de kinetiek van de nigrostriatale dopaminerge neurodegeneratie in individuele dieren op een niet-invasieve manier in de loop van de tijd te volgen, werd de binding van de dopaminetransporter gekwantificeerd met behulp van positronemissietomografie voor kleine dieren met F-18FECT als radioligand.De DAT-binding in het ipsilaterale caudate budiman van ratten waarin recombinant AAV 2/7A53T alfa-synucleïne was geïnjecteerd, nam in de loop van de tijd significant af. Na 32 dagen werd een afname in DAT-binding tot 85% waargenomen. Als positieve controle induceerde injectie van het neurotoxine 6 OHDA in de SN binnen zeven dagen een verlies van 90% van de DAT-binding.Hersensecties van ratten die in de loop van de tijd waren gemicroïnjecteerd met recombinant AAV 2/7A53T alfa-synucleïne, werden immuunkleurig gemaakt voor tyrosinehydroxylase, een marker voor dopaminerge neuronen. Deze figuur demonstreert het progressieve verlies van dopaminerge neuronen over een periode van 29 dagen na de microïnjectie. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in 45 minuten worden uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om kwalitatief hoogwaardige finale vector-matches te gebruiken. Na deze procedure kunnen andere technieken, zoals niet-invasieve PET-beeldvorming, gedragsanalyse en immunohistochemische analyse, worden uitgevoerd om het niveau van neurodegeneratie en neuropathologie te bepalen. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u een virale vectorinjectie in de substantia nigra uitvoert om virale vectorgebaseerde diermodellen voor de ziekte van Parkinson te ontwikkelen.Vergeet niet dat het werken met virale vectoren gevaarlijk kan zijn en dat er bij deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het werken onder een laminaire flow en een correcte decomcontaminatie van afval.

development-an-alpha-synuclein-based-rat-model-for-parkinson-s

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source: Tagliafierro, L., et al. Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the lentiviral transduction of neural progenitor cells (NPCs) for targeted epigenetic modification of alpha-synuclein, a key protein in Parkinson’s disease. The protocol enables methyltransferase-mediated DNA methylation, reducing SNCA expression for studying gene regulation...

Lentiviral Transduction of Neural Progenitor Cells for Epigenetic Regulation of Alpha-Synuclein Expression

This video demonstrates a procedure to create a rat model of Parkinson's disease by injecting the neurotoxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the brain. The neurotoxin infusion into the medial forebrain bundle (MFB) specifically targets dopaminergic neurons responsible for motor control, leading to their destruction and replicating Parkinson's disease symptoms.

Generating the 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson&#39;s Disease

This video demonstrates the process of injecting a viral vector into the rat substantia nigra to model Parkinson's disease. It outlines the steps for preparing the rat, microinjecting the viral vector into the substantia nigra, and the recovery procedure.

A Viral Vector Injection into the Rat Substantia Nigra for Neurodegenerative Disease Modeling

Methoden voor een grootschalige centrale zenuwstelsel gene levering in de rat vallen. In dit voorbeeld is het doel om na te bootsen van een ziekte die het hele ruggenmerg aantast. De wijdverbreide transductie kan worden gebruikt voor een therapeutische eiwitten naar het CNS van een eenmalige, perifere administratie.

Methoden en Tips voor intraveneuze toediening van Adeno-associated Virus voor ratten en evaluatie van het centrale zenuwstelsel transductie

Het doel van dit protocol is bedoeld als een cel-gebaseerd systeem dat wordt uitgevoerd, de vorming van alpha-synuclein repliceert aggregaten in vivo. Alpha-synuclein intracellulaire insluitsels worden overgeënt in primaire neuronen door de internalisering en verspreiding van exogene toegediend aggregaten van inheemse microsomes-geassocieerde alpha-synuclein geïsoleerd van zieke alpha-synuclein transgene muizen.

Exogene toediening van Alpha-synuclein Microsomes-geassocieerde aggregaten te primaire neuronen als een krachtige cel Model van de vorming van fibrillen

Het doel van dit artikel is het schetsen van de stappen die nodig zijn voor de generatie van fibrillen van monomeer Alfa-synuclein, latere kwaliteitscontrole, en het gebruik van de voorgevormde fibrillen in vivo.

Generatie van Alfa-Synuclein voorgevormde fibrillen van monomeren en gebruik in vivo

Hier presenteren we een geautomatiseerde methode voor semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neuron nummer in de rat substantia nigra pars compacta.

Semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neurondichtheid in de substantia Nigra van knaagdiermodellen met behulp van geautomatiseerde beeldanalyse

Dit werk analyseert de vectordosis en blootstellingstijd die nodig is om neuro-inflammatie, neurodegeneratie en motorische stoornissen te induceren in dit preklinische model van de ziekte van Parkinson. Deze vectoren die coderen voor de menselijke α-synucleïne worden afgeleverd in de substantia nigra om de synucleïnepathologie geassocieerd met de ziekte van Parkinson samen te vatten.

Analyse van het muismodel van de ziekte van Parkinson geïnduceerd door Adeno-geassocieerde virale vectoren die coderen voor menselijk α-synucleïne

In dit artikel beschrijven we de identificatie van het adeno-geassocieerd virus serotype 3 (AAV3) als de meest efficiënte vector voor het richten van de menselijke lever kankercellen.

High-Efficiency transductie van leverkanker met behulp van recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 3 Vectoren

Een protocol voor het uitvoeren van unilaterale 6-OHDA letsels van de mediale voorhersenen bundel bij muizen wordt beschreven. Deze methode heeft een laag sterftecijfer (13,3%) met 89% van de overlevende dieren die&gt; 95% verlies van striatale dopamine en 90,63 ± -4,02% ipsiversive rotatie voorkeur voor de kant van de laesie.

Ontwikkeling van een eenzijdig-gelaedeerde 6-OHDA muismodel van de ziekte van Parkinson

Leer hoe je een virale vector-gebaseerd dierlijk model voor de ziekte van Parkinson ontwikkelt via stereotactische injectie in het centrale zenuwstelsel. Deze methode maakt gerichte genexpressie in specifieke hersengebieden mogelijk.

Ontwikkeling van een Alpha-synucleïne Based ratmodel van de ziekte van Parkinson via stereotactische injectie van een recombinant adeno-geassocieerde virale vector (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling van een Alpha-synucleïne Based ratmodel van de ziekte van Parkinson via stereotactische injectie van een recombinant adeno-geassocieerde virale vector

Meer video's verkennen