Ontwikkeling van een Alpha-synucleïne Based ratmodel van de ziekte van Parkinson via stereotactische injectie van een recombinant adeno-geassocieerde virale vector
28 februari 2016
Dit manuscript beschrijft hoe virale vector-gemedieerde lokale gen-levering een aantrekkelijke manier biedt om transgenen in het centrale zenuwstelsel tot expressie te brengen. Het protocol schetst alle cruciale stappen om een injectie met een virologisch vector uit te voeren in de substantia nigra van de rat om een op een virologisch vector gebaseerd diermodel voor de ziekte van Parkinson te ontwikkelen.
Het algemene doel van deze procedure is om een op een viraal vector gebaseerd diermodel voor de ziekte van Parkinson te ontwikkelen via stereotactische injectie in het centrale zenuwstelsel. Deze methode kan worden gebruikt om normale diermodellen te ontwikkelen die preklinische geneesmiddelentests mogelijk maken en kan gunstig zijn voor het bestuderen van het moleculaire mechanisme van de ziekte van Parkinson, evenals veel andere neurodegeneratieve aandoeningen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt voor specifiek targeting van hersengebieden.
Hoge insnijding kan worden bereikt in de hersenexpressie en dat het kan worden gebruikt om diermodellen te maken in specifieke diersoorten en -rassen. De verschillende uiteindelijke vectorsystemen zijn ontwikkeld. De keuze van het vectorsysteem hangt af van de grootte van de insnijding die u wilt uitdrukken, de duur van de genexpressie, de geluiden die u wilt targeten en bioveiligheidskwesties.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Annelies Aertgeerts, een technicus uit ons laboratorium. Begin met het goed anesthetiseren van een acht weken oude vrouwelijke Wistar-rat volgens goedgekeurde protocollen. Controleer of een chirurgisch anesthesieniveau is bereikt door elke poot samen te knijpen en let op een afwezigheid van de onttrekkingsreflex.
Gebruik vervolgens een MicroTransponder-implanteerapparaat om een MicroTransponder op de rug van de rat te plaatsen. Controleer of de MicroTransponder correct is gepositioneerd en of er een uitlezing kan worden verkregen. Knip nu het haar op de hoofdhuid van de rat en breng lokaal verdovingsmiddel aan op de hoofdhuid en oren.
Breng de rat over naar een laminaire stromingskast en voer de rest van de procedure uit met behulp van een aseptische techniek. Plaats de rat in het stereotactische frame door de oorgrepen te bevestigen, gevolgd door de mond- en neusgreep. Bedek de romp van de rat met een papieren deken om een daling van de lichaamstemperatuur te voorkomen.
Breng een oculair smeermiddel aan om uitdroging van de ogen te voorkomen. Desinfecteer vervolgens de hoofdhuid volgens goedgekeurde procedures. Hiervoor wordt 1 procent jodium in 70%isopropyl gebruikt.
Na het maken van een kleine insnijding in de middenlijn van de hoofdhuid, schraap voorzichtig de membranen op de schedel weg en spoel af met zoutoplossing. Laat de schedel drogen en zorg ervoor dat bregma en lambda duidelijk zichtbaar zijn. Vul nu een micro-injectiespuit van 10 microliter, 30 gauge 20 milometer met recombinant AAV en plaats deze op de gemotoriseerde micro-injectiepomp die is aangesloten op het stereotactische instrument.
Voor specifieke transactie van de dopaminerge neuronen van de substantia nigra zijn recombinante AV-vectoren de eerste keuze vanwege hun hoge titers en efficiëntie voor het transduceren van dopaminerge neuronen. Test de stroom door een druppel AAV vrij te geven. Gooi eventueel vrijgekomen AAV weg in een polyvalent reinigingsmiddel.
Controleer visueel of het hoofd recht in het hoofdframe is gefixeerd. Controleer vervolgens of de schedel plat is, door eerst het puntje van de naald naar bregma te verplaatsen en de hoogte op dit punt te meten, door het puntje van de naald in de dorso-ventrale richting te laten zakken tot het de schedel raakt. Herhaal de procedure bij lambda.
Nadat de naald is teruggekeerd naar bregma, verplaats de naald in de voorste achterste en mediale laterale richting naar de stereotactische coördinaten voor micro-injectie. Schrijf de coördinaten op. Op de injectieplaats meet u de hoogte van de schedel zoals eerder, en zorg ervoor dat deze niet meer dan 0,3 mm afwijkt van de hoogte van bregma.
Boor vervolgens voorzichtig een twee millimeter gat in de schedel. Zodra het gat is geboord, meet u de hoogte van de dura om de referentie te bepalen van waaruit de dorso-ventrale coördinaat wordt toegepast. Dring door de dura met een 26 gauge naald.
Absorbeer al het bloed met steriel weefsel en ga pas verder als alle bloeding is gestopt. Laat nu langzaam de naald van de voorgeladen micro-injectiespuit in de hersenen zakken tot de dorso-ventrale coördinaat. En pauzeer gedurende één minuut.
Injecteer vervolgens drie microliters AAV met een snelheid van 0,25 microliter per minuut. Laat na de injectie de naald nog vijf minuten op zijn plaats blijven om terugstroming langs de naaldspoor te voorkomen voordat u deze langzaam verwijdert. Naai de hoofdhuid met gecodeerde gevlochten polyester 3.0 en desinfecteer de huid met een procent jodium en 70%isopropyl.
Om de neus- en mondgreep los te maken, en vervolgens de twee oorgrepen, verwijdert u voorzichtig het dier uit het stereotactische instrument. Dien op dit moment pijnstillers toe en, indien nodig, een anesthesie-omkeringsmiddel. Plaats de rat vervolgens in een schone kooi op een verwarmingsplaat ingesteld op 38 graden Celsius en bewaak het nauwgezet totdat het wakker wordt.
Na de operatie kan de kinetica van neurodegeneratie in het hele dier worden bestudeerd met behulp van gedragstests en PET-beeldvorming en na het opofferen, met behulp van immunohistochemische technieken. De cilindertest om het spontane gebruik van de voorpoot te evalueren, werd uitgevoerd op verschillende tijdstippen na micro-injectie van recombinant AAV dat A53T Mutation alpha synucleïne tot expressie brengt in de substantia nigra. Vanaf drie weken na injectie werd een significante motorische beperking waargenomen bij ratten die de mediaan dosis hadden gekregen.
Vier weken na injectie werd een 50% afname in spontaan contralateraal voorpootgebruik waargenomen. Terwijl de controle eGFP-geïnjecteerde dieren geen asymmetrie in voorpootgebruik vertoonden. Ratten die een hogere dosis recombinant AAV 2/7A53T alpha synucleïne ontvingen, vertoonden een meer uitgesproken beperking van voorpootgebruik op 29 dagen na injectie.
Om te bewijzen dat de waargenomen motorische beperking dopamine-afhankelijk was, werd een enkele dosis L-doba toegediend. Toen de cilindertest 45 minuten na de L-dopa-behandeling werd herhaald, werd een volledige herstel van het voorpootgebruik waargenomen bij de recombinant AAV 2/7A53T alpha synucleïne geï
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een methode voor het ontwikkelen van een op virale vectoren gebaseerd diermodel voor de ziekte van Parkinson via stereotactische injectie in het centrale zenuwstelsel. Deze techniek maakt gerichte genexpressie in specifieke hersengebieden mogelijk, wat preklinisch medicijnonderzoek en de studie van neurodegeneratieve aandoeningen faciliteert.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Gentherapie
- Neurodegeneratieve aandoeningen
Achtergrond
- Genoverdracht via virale vectoren is een effectieve methode voor genexpressie in de hersenen.
- Deze benadering kan diermodellen creëren voor het bestuderen van ziekten zoals de ziekte van Parkinson.
- Specifieke targeting van hersengebieden vergroot de relevantie van de modellen.
- Verschillende vectorsystemen kunnen worden aangepast op basis van de onderzoeksbehoeften.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar diermodel voor de ziekte van Parkinson te ontwikkelen.
- Om preklinische tests van potentiële therapieën te faciliteren.
- Om de moleculaire mechanismen ten grondslag aan de ziekte van Parkinson te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Stereotactische injectie van virale vectoren in de substantia nigra.
- Selectie van vectorsystemen op basis van gengrootte en expressieduur.
- Targeting van specifieke dierstammen en soorten voor modelontwikkeling.
- Beoordeling van genexpressieniveaus in de hersenen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle genoverdracht naar gerichte hersengebieden.
- Vestiging van een functioneel diermodel voor de ziekte van Parkinson.
- Waargenomen hoge niveaus van transgene expressie.
- Potentieel voor verdere studies naar neurodegeneratieve mechanismen.
Conclusies
- De methode biedt een waardevol instrument voor onderzoek naar de ziekte van Parkinson.
- Aflevering via virale vectoren kan het begrip van neurodegeneratie verbeteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen het testen van nieuwe therapeutische strategieën omvatten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol maakt de ontwikkeling mogelijk van een gericht ratmodel voor de ziekte van Parkinson via stereotactische toediening van recombinante AAV-vectoren in de substantia nigra, ter ondersteuning van mechanistische risicoreductie van alfa-synucleïne-pathologie. Het model faciliteert de preklinische evaluatie van dopaminerge neurodegeneratie en therapeutische interventies, wat voorspellend vertrouwen biedt voor doelwitvalidatie in programma's voor neurodegeneratieve ziekten. Door regio-specifieke transgene expressie en kwantificeerbare gedragsmatige en beeldvormende eindpunten te bereiken, sluit deze benadering aan bij vroege discovery-workflows die gericht zijn op pathway-verduidelijking en lead-identificatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om alpha-synucleïne-gemedieerde dopaminerge neurodegeneratie te onderzoeken in een ziekterellevant systeem.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie via regio-specifieke transgeenexpressie en gedragsfenotypering.
- Voorspellende waarde: Levert kwantitatieve motorische en beeldvormende uitkomsten die correleren met dopaminerg verlies, wat bijdraagt aan preklinische triage.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gevalideerde biologische systemen met meetbare neurodegeneratieve fenotypes voor compound screening.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare resultaten via de cilindertest en DAT-bindings-PET-imaging ter voorbereiding van assays.
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform mogelijk voor verschillende neurodegeneratieve targets door aanpassing van vectoren en coördinaten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Modelleert het progressieve verlies van nigrostriatale dopaminerge neuronen dat de pathofysiologie van de ziekte van Parkinson weerspiegelt.
- Mechanische Risicoreductie: Verbindt de overexpressie van alpha-synucleïne met dopamine-afhankelijke gedragsdeficiënties en neurodegeneratie.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen op basis van dosisafhankelijke neurodegeneratie en de responsiviteit op L-dopa.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinisch onderzoek naar werkzaamheid, waardoor een iteratieve beoordeling van neurodegeneratieve mechanismen en therapeutische kandidaten mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van de toxiciteit van alfa-synucleïne en de verduidelijking van signaalpaden in dopaminerge neuronen.
- Screening: Maakt assay-ontwikkeling mogelijk met kwantitatieve gedragsmatige en neuro-imaging eindpunten voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Biedt kwantificering van DAT-binding via PET en tyrosinehydroxylase-immunohistochemie als translationele biomarkers voor neurodegeneratie.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt moleculaire manipulatie met functionele uitkomsten, wat de preklinische continuïteit ondersteunt.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het modelleren van neurodegeneratieve targets via stereotactische virale toediening.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie door reproductie van belangrijke fenotypen van de ziekte van Parkinson.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde chirurgische en injectieprocedures waarborgen de reproduceerbaarheid tussen verschillende locaties en studies.
- Strategische waarde: Maakt vroegere, datagestuurde go/no-go-beslissingen mogelijk door mechanistische ambiguïteit bij target-engagement te verminderen.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van therapieën gericht op alfa-synucleïne op basis van dosis-respons- en reversibiliteitsgegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in stereotactische chirurgie, de omgang met virale vectoren en anesthesie bij knaagdieren.
- Afhankelijk van infrastructuur voor microtomie, immunohistochemie, PET-imaging en gedragstesten.
- Vereist standaardisatie van coördinaten, vectortiters en doseringsschema's tussen verschillende teams.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten de selectie van de promoter, serotype-tropisme en het ontwerp van het transgen voor verschillende doelgebieden.
- Praktische beperkingen omvatten chirurgische variabiliteit, diffusie van de vector buiten de doelnuclei en soortspecifieke expressiekinetiek.
