Name: Beeldvorming Serotonerge vezels in de muis Spinal Cord Met behulp van de DUIDELIJKHEID / CUBIC Techniek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Leer de CLARITY/CUBIC-methode voor 3D-beeldvorming van serotonerge vezels in het ruggenmerg van de muis. Deze techniek onthult vezels die traditionele histologie niet zichtbaar maakt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Australian Research Council Centre of Excellence for Integrative Brain Function (ARC Centre Grant CE140100007), een NHMRC projectsubsidie (#1086643). Prof. George Paxinos wordt ondersteund door een Senior Principal Research Fellow NHMRC-subsidie (#1043626).

Ethiek Verklaring: Alle procedures waarbij proefdieren volgen de richtlijnen van de Animal Care en Ethische Commissie (ACEC) aan de Universiteit van New South Wales (de goedgekeurde ACEC nummer 14 / 94A). 1. Voorbereiding van de Transparent Mouse Spinal Cord <ol><li> Bereiding van Ice Cold Hydrogel Solution <ol><li> Bereiding van 16% paraformaldehyde oplossing (PFA) <ol><li> Voeg 16 g paraformaldehyde poeder in 70 ml voorverwarmd gedistilleerd water (50-55 ° C) en roeren op een verhitte magnetische roerder totdat paraformaldehyd opgelost. Opmerking: Zorg ervoor dat de oplossing tot meer dan 55 ° C te verwarmen en te beseffen dat paraformaldehyde is giftig. </li><li> Breng de paraformaldehyde oplossing voor een cilinder en gedestilleerd water tot 100 ml. Koel het paraformaldehyde oplossing met een 4 ° C koelkast. </li></ol></li><li> Oplossen 125 mg VA-044 initiator in 26,25 ml gedestilleerd water en laat de oplossing in een 4° C koelkast. </li><li> Koel 5 ml acrylamide-oplossing (40%), 1,25 ml Bis-oplossing (2%) (NB: Bis en acrylamide oplossingen toxisch, kan genetische schade veroorzaken of kanker), 5 ml 10 x PBS, 12,5 ml 16% PFA oplossing en de VA-044 initiator oplossing op het ijs. </li><li> Meng de bovenstaande oplossingen op ijs. Let op: het totale volume is 50 ml. </li></ol></li><li> Perfusie en Collectie van de Muis Spinal Cord <ol><li> Verdoven een muis met een intraperitoneale injectie van ketamine (80 mg / kg) en xyzaline (5 mg / kg) verdund in 0,9% fysiologische zoutoplossing. De dosering voor muis lager dan die van ratten. </li><li> Op een geschikte kunststof oppervlak in een zuurkast, bevestig de ledematen van de muis van het lichaam (plakband voldoende) zodra de muis niet reageert op een snuifje haar huid van de voet. </li><li> Snijd de muis huid over de borst en vervolgens het bot borstkas naar het hart bloot te leggen met een schaar. </li><li> Met behulp van een peristaltische pomp, met een 25 G naald bevestigd aan The uiteinde van de buis, steek de naald in de linker ventrikel van het hart, knip de rechter atrium om een ​​uitgang voor het bloed te maken en dan beginnen wassen met 40 ml 0,9% fysiologische zoutoplossing een snelheid van ongeveer 10 ml / min. </li><li> Als het klaar is, perfuseren de muis met 35 ml ijskoude hydrogel oplossing. Opmerking: perfuseren met een snelheid van 10 ml / min tot zwelling van het zenuwweefsel te voorkomen. </li><li> Incise de huid over de rug met een mes en verwijder vervolgens de spieren naast de gewervelde. Na het snijden van de wervelbogen enerzijds en hen flipping aan de andere kant, neem het ruggenmerg van de wervelkolom met een fijne schaar. </li></ol></li><li> Wissen van de muis Spinal Cord <ol><li> Plaats het ruggenmerg in 15 ml hydrogel oplossing overnacht bij 4 ° C. </li><li> Verwijder 10 ml van de hydrogel oplossing en giet de rest van de oplossing met de ruggenmergsegmenten een 5 ml buisje. Vul het 5 ml buis met de hydrogel oplossing tot het volledig vol. </li><li> Stretch een klein stukje parafilm over de bovenkant van de 5 ml buis en wikkel parafilm rond de hals van de buis. Let op: Zorg ervoor dat de parafilm contact op met de hydrogel oplossing en er zijn geen luchtbellen tussen de hydrogel oplossing en de parafilm. </li><li> Zet de buis 5 ml in een 37 &#160; ° C oven gedurende de nacht. Let op de hydrogel oplossing totdat het wordt een gel. </li><li> Neem de 5 ml buis uit de oven en verwijder de gel uit de buis met een sleutel (zoals een geschept 1 ml pipet tip). Verwijder de gel uit het ruggenmerg weefsel door het steken van de grove weefsel aan de gel en neem dan de grove weefsel weg (de gel zal vasthouden aan het weefsel en zal daarom worden verwijderd door het weefsel). </li><li> Na het verwijderen van de gel uit het ruggenmerg weefsel, was het ruggenmerg 4 maal met 1 x PBS (pH 7,4) gedurende 24 uur op een schudapparaat. </li><li> Bereid de CUBIC clearingoplossing door het oplossen van 3,85 g ureum en 3,85 g N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine in 5,38 ml gedestilleerd water. Opmerking: Een hete roerder wordt gebruikt. Voeg 2,31 g polyethyleenglycol-mono-p-isooctylfenylether / Triton X-100 aan de oplossing zodra duidelijk is en afkoelt tot kamertemperatuur. Opmerking: 10 g van deze drie stoffen zijn voor één muis. </li><li> Snijd de muis ruggenmerg coronaal in 2-3 mm lange segmenten met een scheermesje en ze in 5 ml van de bovenstaande CUBIC clearingoplossing. Plaats op een schudder in de oven op 37 &#160; ° C gedurende 3 dagen. </li><li> Drie dagen later, verander de clearing oplossing voor een nieuwe. Noot: de bovenstaande oplossing wordt vóór gebruik bereid. </li><li> Twee tot drie dagen later na het vernieuwen van de CUBIC clearing oplossing, controleert u de transparantie van het weefsel tegen een papier met lettertype 8 letters. Als het transparant, kan de brieven worden gezien door het gewiste weefsel. Verwijder de clearingoplossing en voeg 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) om het weefsel 4 maal per dag (om de 6 uur) was. </li></ol></li></ol><ol><li> Incubeer het ruggemerg segmenten in de primaire antilichaamoplossing (anti-serotonine, opgewekt in konijnen, verdund 1: 100 in PBST) gedurende 3 dagen op een schudinrichting in een 37 ° C oven. </li><li> Verwijder de antilichaamoplossing en voeg 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) bij de ruggenmergsegmenten 4 maal per dag (om de 6 uur) in een 37 ° C oven te wassen. </li><li> Verwijder de PBST-oplossing en voeg de secundaire antilichaamoplossing (594 geconjugeerd geit anti-konijn IgG, verdund 1: 100 in PBST) om het weefsel gedurende 3 dagen geïncubeerd op een schudinrichting in een 37 ° C oven. </li><li> Verwijder de secundaire antilichaamoplossing en voeg 4 ml PBST de ruggenmergsegmenten 4 keer wassen per dag (om de 6 uur) op een schudinrichting in een 37 ° C oven. De volgende dag het weefsel gereed voor beeldvorming. </li></ol> 3. Imaging <ol><li> Verwijder de PBST-oplossing en voeg 4 ml 85% glycerol aan de brekingsindex van het weefsel zelfs. </li><li&gt; Controleer de helderheid van het weefsel. Zodra duidelijk is in ongeveer 1 uur, zet het weefsel op een grote, dunne glasplaatje waar het bedrijf kader van de multi-foto fluorescentiemicroscoop past. </li><li> Doe een paar druppels 85% glycerol naast het ruggenmerg weefsel en dekglaasje met een 22 x 50 mm glazen dekglaasje 2. Opmerking: De oriëntatie van het ruggenmerg bepaalt hoe het beeld eruit ziet. </li><li> Zet het glaasje op het bedrijf kader van de multi-foton fluorescentie microscoop en verplaatsen het weefsel in het licht pad. </li><li> Kies het Helium Neon laser lijn 594 nm en de intensiteit van de laser om het optimale niveau van de helderheid van het positieve signaal in het live-beeld te controleren. </li><li> Selecteer het scangebied van het ruggenmerg weefsel met de 20X objectief (in water, NA 0,7) en zet een z-stack maken, en de diepte van elke ingesteld op 3 pm stap. </li><li> Scan het weefsel van de bovenkant naar de onderkant van de z-stack onder 20X bezwaartieve en dan 63x objectief (in olie, NA 1.4) (stap grootte was 1 micrometer), respectievelijk. Reconstrueren 3D-video&#39;s met behulp van een 3D-software 28. </li></ol>

<ol><li>Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+raphe+magnus+modulation+of+response+of+rat+dorsal+horn+neurons+to+unmyelinated+fiber+inputs%3A+partial+involvement+of+serotonergic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways.</a> J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).</li>
<li>Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+from+the+brain+to+the+spinal+cord+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Projections from the brain to the spinal cord in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).</li>
<li>Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raphe+magnus+stimulation-induced+anti-nociception+in+the+cat+is+associated+with+release+of+amino+acids+as+well+as+serotonin+in+the+lumbar+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn.</a> Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).</li>
<li>Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+serotonin+metabolism+within+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+during+nucleus+raphe+magnus+stimulation%2C+as+revealed+by+in+vivo+electrochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection.</a> Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).</li>
<li>Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+patterns+of+serotonin+release+in+the+rat%27s+lumbar+spinal+cord+following+electrical+stimulation+of+the+nucleus+raphe+magnus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus.</a> Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).</li>
<li>Bullitt, E., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+course+of+descending+serotoninergic+pathways+innervating+the+rodent+dorsal+horn+and+lamina+X%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X.</a> J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).</li>
<li>Jones, S. L., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+patterns+of+serotoninergic+medullary+raphespinal+fibers+in+the+rat+lumbar+spinal+cord%3A+an+anterograde+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study.</a> J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).</li>
<li>Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonergic+innervation+of+the+dorsal+horn+of+rat+spinal+cord%3A+light+and+electron+microscopic+immunocytochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study.</a> J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).</li>
<li>Morrison, S. F., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+branching+patterns+and+funicular+trajectories+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons.</a> J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).</li>
<li>Barman, S. M., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axons+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons+branch+in+the+cervical+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord.</a> Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).</li>
<li>Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raphespinal+projections+in+the+North+American+opossum%3A+evidence+for+connectional+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity.</a> J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).</li>
<li>Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+serotonergic+projections+to+the+lumbar+spinal+cord+in+the+monkey+using+a+combined+retrograde+transport+and+immunocytochemical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique.</a> Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).</li>
<li>Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+somatotopic+organization+of+nuclei+projecting+via+the+dorsolateral+funiculus+in+rats%3A+a+retrograde+tracing+study+using+HRP+slow-release+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels.</a> Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Ertürk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+%283DISCO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li>
<li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn+Sci%22%5BJournal%5D)">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).</li>
<li>Spence, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+CLARITY+to+gray+matter+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Bringing CLARITY to gray matter atrophy.</a> NeuroImage. 101, 625-632 (2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+Alzheimer+brain+with+CLARITY%3A+senile+plaques%2C+neurofibrillary+tangles+and+axons+in+3-D%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D.</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).</li>
<li>Zhang, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Struct Funct. , (2015).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 781(2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OsiriX%3A+an+open-source+software+for+navigating+in+multidimensional+DICOM+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Digit+Imaging%22%5BJournal%5D)">OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images.</a> J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol beschreven laat zien hoe je het serotonerge vezels in de muis ruggenmerg met de gecombineerde DUIDELIJKHEID en CUBIC technieken. Er wordt een snellere zuiveringsproces ten opzichte van de passieve clearing protocol ontwikkeld door Cheung et al. 14 en Tomer et al. 15 en maakt het ruggenmerg weefsel goed worden ondersteund door de hydrogel tijdens het wissen. Een belangrijke stap bij vastlegging van de muis ruggenmerg, zoals gerapporteerd do...

Supraspinale projecties zijn verantwoordelijk voor de modulatie van diverse gedragingen zoals pijnperceptie. Een van de projecties die nociceptieve informatie vervoert, bevat serotoninerge vezels, die ontspringen uit de raphe en aangrenzende reticulaire kernen van de hersenstam1,2. Fysiologische en farmacologische studies hebben een verhoogde afgifte van serotonine aangetoond in de dorsale hoorn van het ruggenmerg na elektrische stimulatie van de raphe-kernen in de hersenstam3-5. Bij ratten en opossums hebben serotoninerge raphespinale vezels dichte terminalen, niet alleen in de dorsale hoorn6-8, maar ook in de intermediaire zone7,9,10, de ventrale hoorn7,11 en zelfs lamina 1012,13. Er zijn geen vergelijkbare studies bij muizen. De huidige studie had tot doel het terminatiepatroon van serotoninerge vezels afkomstig van de raphe-kernen en aangrenzende reticulaire kernen van de hersenstam in het muizenruggenmerg in kaart te brengen met behulp van de recent gepubliceerde CLARITY14 -methode en de modificatie ervan - CUBIC15. 
Conventionele fluorescentie of peroxidase-immunohistochemie van het ruggenmerg toont duidelijk de verdeling van serotoninerge vezels in de grijze stof van het ruggenmerg in dwarsdoorsneden van 30-40 µm dik. Deze benadering laat echter de continuïteit van de serotoninerge vezelbanen in de witte stof en hun zijtakken in de grijze stof niet zien. Hoewel de 3D-reconstructie van histologische secties onze kennis van vezelbanen heeft vergroot, blijft het een uitdaging voor histologen en anatomen om een enkele baan te volgen vanwege kleine vervormingen in het weefsel veroorzaakt door het snijden. Om dit obstakel te omzeilen hebben een aantal onderzoekers verschillende protocollen ontwikkeld voor het maken van de hele weefselstructuur doorzichtig en het verzamelen van een afbeelding van onveranderd weefsel in een enkel videobestand17-21. Tot nu toe zijn de door Deisseroth's groep ontwikkelde clear, lipid-exchanged, acrylamide-hybridized rigid, imaging/immunostaining compatible, tissue hydrogel (CLARITY)-techniek14,15 en CUBIC, ontwikkeld door Susaki et al16, het meest succesvol. Sinds de publicatie van de protocollen zijn veel onderzoekers begonnen deze technieken te gebruiken om verschillende aspecten van biologische weefsels te onderzoeken, inclusief niet alleen de hersenen22-25, maar ook het hart, nieren, darmen en de longen26,27. 
Door het muizenruggenmerg te fixeren met de hydrogeloplossing (CLARITY) en het helder te maken met de CUBIC-reagentia (wat een veel snellere methode is dan die beschreven in het oorspronkelijke CLARITY-protocol14,15), werd een ruggenmergtweegblok van 2-3 mm lang binnen twee weken helder gemaakt en immunofluorescentiekleuring voor serotonine voltooid in acht dagen. Met slechts een combinatie van chemische agentia kan conventionele immunohistochemie worden gebruikt om een afbeelding van individuele vezelbanen in een 3D-videobestand te creëren in ongeveer een maand.

```html
<table><tbody><tr><td>Photoinitiator VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>40% acrylamide oplossing</td><td>Bio Rad</td><td>161-0140</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution</td></tr><tr><td>2% Bis Oplossing</td><td>Bio Rad</td><td>161-0142</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=nl&amp;region=NL</td></tr><tr><td>ureum</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td>http://www.merckmillipore.com/NL/nl/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612</td></tr><tr><td>N,N,N&rsquo;,N&rsquo;-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethyleendiamine</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td>http://www.merckmillipore.com/NL/nl/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td>http://www.merckmillipore.com/NL/nl/product/TRITON&reg;-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462</td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=nl&amp;region=NL</td></tr><tr><td>serotonine antilichaam</td><td>Merck Millipore</td><td>AB938</td><td>http://www.merckmillipore.com/NL/nl/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938</td></tr><tr><td>geit anti konijn IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor&reg; 594 conjugaat</td><td>Life Technologies</td><td>A-11012</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>multi-foton microscoop</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5 MP STED</td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/</td></tr></tbody></table>
```

beeldvorming serotonerge vezels in de muis spinal cord met behulp van de duidelijkheid / cubic techniek

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Aflopend lange vezels aan het ruggenmerg essentieel voor vervoer, pijnperceptie en andere gedragingen. De vezelafwerking patroon in het ruggenmerg van de meerderheid van deze vezels systemen niet grondig onderzocht bij soorten. Serotonerge vezels, die uitsteken in het ruggenmerg, zijn onderzocht bij ratten en buidelratten op histologische secties en hun functionele betekenis is afgeleid op basis van hun vezelafwerking patroon in het ruggenmerg. Met de ontwikkeling van de duidelijkheid en vierkante technieken is het mogelijk dit vezelsysteem en de verdeling ervan in het ruggenmerg, die waarschijnlijk eerder onbekende eigenschappen van serotonerge supraspinale wegen onthullen onderzoeken. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het afbeelden van de serotonerge vezels in de muis ruggenmerg met behulp van de gecombineerde DUIDELIJKHEID en CUBIC technieken. Bij deze methode wordt perfusie van een muis met een hydrogel oplossing en verduidelijking van het weefsel met een combinatie van clearing reagentia. Ruggenmerg werd ontruimd in iets minder dan twee weken, en de daaropvolgende immunofluorescentiekleuring tegen serotonine werd in minder dan tien dagen afgerond. Met een multi-foton fluorescentiemicroscoop, werd het weefsel afgetast en een 3D beeld gereconstrueerd met behulp Osirix software.

Dit gedeelte toont de resultaten van serotonine antilichaam kleuring in de transparante muis ruggenmerg met behulp van een combinatie van duidelijkheid en CUBIC protocollen. We tonen aan dat serotonerge vezels in alle lagen van het ruggenmerg met een overwicht in het ventrale gedeelte van de ventrale hoorn zijn (figuur 1, zie ook Video 1). De controleweefsel geen positieve vezels (resultaat niet getoond). In de ventrale hoorn, dicht op elkaar gepakte ser...

Supraspinale projecties zijn belangrijk voor pijnperceptie en andere gedragingen, en serotonerge vezels zijn een van deze vezelsystemen. De huidige studie richtte zich op de toepassing van het gecombineerde CLARITY/CUBIC protocol op het muizenruggenmerg om de terminatie van deze serotonerge vezels te onderzoeken.

Beeldvorming Serotonerge vezels in de muis Spinal Cord Met behulp van de DUIDELIJKHEID / CUBIC Techniek

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Het algemene doel van dit CLARITY/CUBIC-experiment is om de 3D-kenmerken van serotonerge vezels in het ruggenmerg van de muis onthullen, die niet waarneembaar zijn via traditionele histologie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de neuroanatomie, zoals de vraag hoe serotonerge vezels over het ruggenmerg zijn verdeeld. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het mogelijk maakt om serotonerge vezels in situ te observeren, samen met de identificatie van vectoren die niet zichtbaar zijn met traditionele histologie.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de organisatie van het centraal zenuwstelsel, kan zij ook worden toegepast op andere systemen, zoals het cardiovasculaire systeem. We hebben deze methode voor het eerst overwogen toen we de beperkingen ondervonden van een traditionele traceringstechniek bij het analyseren van serotonerge vezels in het ruggenmerg van de muis. Begin met het fixeren van de ledematen van een geanestheseerde muis aan een plastic dissectieplateau in een zuurkast.Bevestig de afwezigheid van een reactie op een teenprikkel en gebruik een schaar om de huid over de borstkas open te maken. Open vervolgens de borstkas om het hart bloot te leggen en voer een naald van 25 gauge, verbonden met de slang van een peristaltische pomp, in de linker ventricle in. Knip het rechter atrium door om een uitgangspunt voor het bloed te creëren.Was daarna het hart met 40 milliliter 9 procent zoutoplossing met een snelheid van ongeveer 10 milliliter per minuut. Wanneer al het bloed is uitgespoeld, perfundeer het dier met 35 milliliter vers bereide, ijskoude hydrogel tegen dezelfde perfusiesnelheid. Maak vervolgens een incisie in de huid over de rug van de muis en ontleed de spieren naast de wervels.Nadat de wervelbogen aan één zijde zijn doorgeknipt en naar de andere zijde zijn omgeklapt, wordt het ruggenmerg met een fijne schaar uit de wervelkolom verwijderd. Plaats het ruggenmerg direct na het oogsten gedurende de nacht in 15 milliliters vers bereide hydrogeloplossing bij vier graden Celsius. Verwijder de volgende dag 10 milliliters van de hydrogel en giet de rest van de oplossing samen met het ruggenmerg in een buisje van vijf milliliter.Voeg verse hydrogeloplossing toe tot de buis vol is en span vervolgens een klein stukje parafilm over de bovenkant van de buis, waarbij u erop let dat de parafilm de hydrogel raakt en dat er geen luchtbellen tussen de oplossing en de film zitten. Het verwijderen van lucht uit de buis is de moeilijkste stap. Om er zeker van te zijn dat er geen bellen aanwezig zijn, dient u de buis langzaam te vullen met de hydrogeloplossing en vervolgens de parafilm voorzichtig over de bovenkant van de buis te plaatsen, zonder de gel te morsen.Wikkel nu een tweede stuk parafilm om de hals van de buis en incubeer het ruggenmerg een nacht in een oven op 37 graden Celsius. Wanneer de hydrogeloplossing een gel vormt, gebruik dan een sleutel om de gel en het neurale weefsel uit de buis te verwijderen. Om de hydrogel van het ruggenmerg te verwijderen, drukt u kort een grof weefsel tegen de gel.De gel zal aan het weefsel kleven terwijl het wordt verwijderd. Wanneer het ruggenmerg schoon is, wordt het in PBS geplaatst voor vier wasbeurten van zes uur op een schudmachine. Na 24 uur wordt het ruggenmerg met een scheermesje coronaal in segmenten van twee tot drie millimeter lang gesneden en worden de weefselstukjes overgebracht naar vijf milliliter vers bereide CUBIC-clearingsolutie.Schud de stukken 72 uur lang in de oven op 37 °C en vervang vervolgens de drie dagen oude kleuringsoplossing door vers bereide kleuringsoplossing. Controleer twee tot drie dagen later de transparantie van het weefsel tegenover papier met letters in lettertype 8. Wanneer de letters door het geklaarde weefsel zichtbaar zijn, vervang dan de CUBIC-kleuringsoplossing door vier milliliter verse PBST voor vier wasbeurten van zes uur.Om de segmenten van het ruggenmerg te kleuren voor fluorescentiebeeldvorming, wordt het weefsel drie dagen lang op een schudplaat in een oven van 37 °C geïncubeerd in de passende primaire antilichaamoplossing. Na afloop van de kleuring met het primaire antilichaam wordt het weefsel in vier milliliter PBST ondergedompeld voor vier wasbeurten van zes uur in de oven van 37 °C. Vervolgens wordt de PBST vervangen door de passende secundaire antilichaamoplossing voor nog eens drie dagen op de schudplaat in de oven van 37 °C.Was op de vierde dag de ongebonden secundaire antistoffen weg met PBST, zoals zojuist gedemonstreerd. Om de segmenten te beelden, wordt de laatste PBST-wasstap vervangen door vier milliliter glycerol van 85 procent om de brekingsindex van het weefsel gelijkmatig te maken. Controleer na ongeveer een uur de transparantie van het weefsel.Wanneer het weefsel transparant is, brengt u de segmenten van het ruggenmerg over naar een grote, dunne glazen objectglas. Plaats vervolgens een paar druppels 85 procent glycerol naast het ruggenmergweefsel en dek het weefsel af met een dekglas van 22 bij 50 millimeter. Plaats het objectglas in de houder van de microscoop en beweeg het weefsel in de lichtweg.Select vervolgens de Helium-Neon-laser en controleer de helderheid van het positieve signaal in het live-beeld om de intensiteit van de laser aan te passen. Gebruik bij de optimale laserintensiteit een 20x objectief om het scangebied van het ruggenmergweefsel te selecteren. Stel het instrument vervolgens zo in dat er een z-stack wordt gemaakt met een stapgrootte van drie micron per stack.Scan tot slot het weefsel van boven naar beneden van de z-stapel, eerst onder het 20x objectief, gevolgd door een z-stapel scan onder het 63x objectief. Vervolgens kan 3D-software worden gebruikt om de passende 3D-video's te reconstrueren. Hier kan de aanwezigheid van serotonerge vezels in alle laminae van het ruggenmerg worden waargenomen, met een overweging in het ventrale deel van de ventralis horn.In het ventrale hoorn bevinden zich dichtgepakte serotonerge vezels in het ventraal-mediale gebied, die zich uitstrekken naar het laterale deel van het ventrale hoorn, waarbij sommige immunopositieve vezels zich ook uitstrekken vanuit het ventrale hoorn naar het dorsale hoorn of het centraal kanaal. Immunopositieve vezels zijn aanwezig in alle laminae van het dorsale hoorn, maar er is een kleine opening tussen de positieve vezels in lamina twee en vier, met name in het laterale deel van het dorsale hoorn. In een horizontale doorsnede kan worden waargenomen dat dichtgepakte serotonerge vezels in het ventrale hoorn, langs de longitudinale as van het ruggenmerg, regelmatig zijtakken uitstoten langs de as die loodrecht op het vezelbundel staat.Deze takken divergeren verder langs hun pad naar het laterale gedeelte van het ventrale hoorn. In vergelijking met deze takken zijn die welke zich naar de middellijn uitstrekken onregelmatiger en kleiner. Onder het 63x objectief is waarneembaar dat de serotonerge vezels in het dorsale hoorn langs de as van het ruggenmerg lopen en op verschillende punten langs het pad van het tract eindigen, met dikke vezels die sporadisch verspreid zijn tussen de dunne vezels.Zodra deze techniek beheerst is, kan deze in minder dan drie weken worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals dubbele kleuring met cholineacetyltransferase-antilichamen, worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden over de vraag of serotonerge vezels eindigen op motorische neuronen. Na de ontwikkeling van deze techniek is de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van biomedische beeldvorming om de complexe ruimtelijke relaties tussen verschillende celtypen in dierspecimens of menselijke weefsels te verkennen.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u ruggenmergweefsel van muizen kunt klaren voor 3D-beeldvorming na immunofluorescentiekleuring.

imaging-serotonergic-fibers-mouse-spinal-cord-using-claritycubic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een minimaal invasieve protocol om de muis te wervelkolom te stabiliseren en uit te voeren...

In vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met behulp van twee-foton Microscopie

Source: Pekarek, B. T., et. al., Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing. J. Vis. Exp. (2021)In this video, we demonstrate the preparation, imaging, and analysis of a cleared mouse brain to examine dendritic arbors, spine morphology, and neuronal distribution using confocal microscopy and 3D reconstruction techniques.

Confocal Microscopy Imaging of Intact Dendritic Arbors and Spine Morphology in a Cleared Mouse Brain

Om beelden met hoge resolutie te verkrijgen van fluorescerend gelabelde cellen binnen grote weefsels, zouden de biologische monsters ideaal geïmagingd moeten worden zonder te snijden. 3DISCO is een eenvoudige weefselklaringsprocedure gebaseerd op sequentiële incubatie met organische oplosmiddelen. Na klaring worden de organen transparant, waardoor een volledige laserscan van het specimen mogelijk is.

Imaging Ontruimde Intact Biological Systems op cellulair niveau door 3DISCO

In deze video, beschrijven we een werkwijze voor het implanteren van een chronische optische beeldvorming kamer via dorsale ruggenmerg van een levende muis. De kamer, chirurgische ingreep, en chronische beeldvorming worden beoordeeld en aangetoond.

Een procedure voor het implanteren van een Spinal Kamer voor Longitudinaal In Vivo Beeldvorming van de Muis Spinal Cord

Een nieuw ex vivo voorbereiding voor het afbeelden van de muis ruggenmerg. Dit protocol maakt twee-foton beeldvorming van levende cellulaire interacties gehele ruggenmerg.

Twee-foton Imaging van Cellular Dynamics in de Muis Spinal Cord

Optische klaringstechnieken revolutioneren de manier waarop weefsels worden gevisualiseerd. In dit rapport beschrijven we aanpassingen van het oorspronkelijke Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol dat consistentere en goedkopere resultaten oplevert.

Optische Clearing van de Muis centrale zenuwstelsel met passieve DUIDELIJKHEID

Hier presenteren we een protocol om de CLARITY-methode van de hersenweefsels aan te passen voor volledig gemonteerde retinas om de kwaliteit van standaard immunohistochemische kleuring en hoge resolutie beeldvorming van retinale neuronen en hun subcellulaire structuren te verbeteren.

Immunostaining van Whole-Mount Retinas met de CLARITY Tissue Clearing Method

Neuronale dendritische morfologie ligt vaak ten grondslag aan functie. Inderdaad, veel ziekteprocessen die de ontwikkeling van neuronen beïnvloeden, manifesteren zich met een morfologisch fenotype. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en krachtige methode voor het analyseren van intacte dendritische priëlen en hun bijbehorende stekels.

Beeldvorming en kwantificering van intacte neuronale dendrieten via CLARITY Tissue Clearing

Het protocol biedt een gedetailleerde methode van neuronale beeldvorming in hersensegmenten met behulp van een weefselzuiveringsmethode, ScaleSF. Het protocol omvat hersenweefselvoorbereiding, weefselverheldering, behandeling van gewiste plakjes en confocale laserscanmicroscopie beeldvorming van neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus.

Een weefselzuiveringsmethode voor neuronale beeldvorming van mesoscopische tot microscopische schalen

Minimaal invasieve technieken en een eenvoudig laboratoriumapparaat verbeteren de reproduceerbaarheid van het ruggenmergletselmodel door operatieve schade aan de proefdieren te verminderen en anatomisch morfologisch onderhoud mogelijk te maken. De methode is de moeite waard omdat de betrouwbare resultaten en reproduceerbare procedure het onderzoek naar de mechanismen van ziekteherstel vergemakkelijken.

Het opzetten van een muiskneuzingsletselmodel op basis van een minimaal invasieve techniek

Leer de CLARITY/CUBIC-methode voor 3D-beeldvorming van serotonerge vezels in het ruggenmerg van de muis. Deze techniek onthult vezels die traditionele histologie niet zichtbaar maakt.

Beeldvorming Serotonerge vezels in de muis Spinal Cord Met behulp van de DUIDELIJKHEID / CUBIC Techniek

Meer video's verkennen