Name: Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Leer de isolatie en flowcytometrische analyse van glioom-infiltrerende perifere mononucleaire bloedcellen bij muizen. Deze methode levert tijdsafhankelijke kwantitatieve gegevens over immuuncelinfiltratie en activeringsstatus in de vroege tumor-micro-omgeving van de hersenen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health / Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (NIH / NINDS) verleent R01-NS074387, R01-NS057711 en R21-NS091555 naar MGC; NIH / NINDS verleent R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 en R21-NS084275 om PRL; subsidies van Leah&#39;s Happy Hearts, Universiteit van Michigan Comprehensive Cancer Center uitgereikt aan MGC en PRL; de afdeling Neurochirurgie, Universiteit van Michigan School of Medicine; Michigan Institute for Clinical and Health Research, ondersteund door NIH-subsidie ​​2UL1-TR000433; de Universiteit van Michigan Cancer Biology Training Grant ondersteund door NIH / NCI (National Cancer Institute) subsidie ​​T32-CA009676; de Universiteit van Michigan Training in Klinische en Basic Neurowetenschappen ondersteund door NIH / NINDS verlenen T32-NS007222; en de Universiteit van Michigan Medical Scientist Training Program ondersteund door NIH / NIGMS (Nationaal Instituut voor Algemene Geneeskunde Wetenschappen) verlenen T32-GM007863. De auteurs van eenopnieuw dankbaar voor de wetenschappelijke leiding en ondersteuning ontvangen van Dr. Karin Muraszko en de afdeling Neurochirurgie; M. Dahlgren, D. TOMFORD en S. Napolitaanse voor een uitstekende administratieve ondersteuning; M. Dzaman voor uitstekende technische bijstand; en Phil F. Jenkins voor genereuze steun voor de aankoop van een Zeiss 3D Scanning Electron Microscope. We erkennen ook Kuchroo laboratorium Harvard Medical School, waaruit een gemodificeerde versie van de dichtheidscentrifugatie media-gemedieerde strategie voor het isoleren van mononucleaire cellen hersenen werd getrokken.

<ol><li>Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+molecular+understanding+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma.</a> J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).</li>
<li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBTRUS+statistical+report%3A+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro Oncol. 16, Suppl 4. iv1-63 (2014).</li>
<li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523, 337-341 (2015).</li>
<li>Kennedy, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages+in+glioma%3A+friend+or+foe%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oncol.%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe?</a> J Oncol.. 2013, 486912(2013).</li>
<li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).</li>
<li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophages+promote+glioma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59, 472-485 (2011).</li>
<li>Kmiecik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+CD3%2B+and+CD8%2B+tumor-infiltrating+immune+cells+correlate+with+prolonged+survival+in+glioblastoma+patients+despite+integrated+immunosuppressive+mechanisms+in+the+tumor+microenvironment+and+at+the+systemic+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level.</a> J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).</li>
<li>Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+infiltrate+differences+in+pilocytic+astrocytoma+and+glioblastoma%3A+evidence+of+distinct+immunological+microenvironments+that+reflect+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology.</a> J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial%2Fmacrophage+expression+of+interleukin+10+in+human+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas.</a> Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).</li>
<li>El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+increase+in+CD4%2BCD25%2BFOXP3%2B+regulatory+T+cells+in+tumor-infiltrating+lymphocytes+of+human+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme.</a> Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).</li>
<li>Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+regulation+of+human+monocytic%2Fmicroglial+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation.</a> J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).</li>
<li>Curtin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB1+mediates+endogenous+TLR2+activation+and+brain+tumor+regression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression.</a> PLoS Med. 6, e10(2009).</li>
<li>Curtin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+recruits+plasmacytoid+dendritic+cells+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain.</a> J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).</li>
<li>Mineharu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+brain+tumor+microenvironment+enhances+the+efficacy+of+dendritic+cell+vaccination%3A+implications+for+clinical+trial+design%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design.</a> Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).</li>
<li>Larocque, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+overrides+brain+immune+privilege+and+facilitates+recognition+of+a+neo-antigen+without+causing+autoimmune+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).</li>
<li>Curtin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treg+depletion+inhibits+efficacy+of+cancer+immunotherapy%3A+implications+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials.</a> PLoS One. 3, e1983(2008).</li>
<li>Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunostimulation+and+conditional+cytotoxic+gene+therapy+provide+long-term+survival+in+a+large+glioma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model.</a> Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).</li>
<li>Dewey, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+brain+inflammation+and+persistent+herpes+simplex+virus+1+thymidine+kinase+expression+in+survivors+of+syngeneic+glioma+treated+by+adenovirus-mediated+gene+therapy%3A+implications+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials.</a> Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).</li>
<li>Baker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+eradicate+galectin-1-deficient+glioma+in+the+absence+of+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity.</a> Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).</li>
<li>Baker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+glioma+formation%3A+iterative+perivascular+glioma+growth+and+invasion+leads+to+tumor+progression%2C+VEGF-independent+vascularization%2C+and+resistance+to+antiangiogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy.</a> Neoplasia. 16, 543-561 (2014).</li>
<li>Ormerod, M. G., Novo, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOrmerod%2C+MG+%22Flow+cytometry+%3A+a+basic+introduction%22">Flow cytometry : a basic introduction</a>. , (2008).</li>
<li>Stirling, D. P., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+inflammatory+response+after+murine+spinal+cord+injury+revealed+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry.</a> J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).</li>
<li>Hirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+and+phenotype+of+activated+microglia%2Fmacrophages+within+the+spinal+cord+of+the+hyperostotic+mouse+%28twy%2Ftwy%29+changes+in+response+to+chronic+progressive+spinal+cord+compression%3A+implications+for+human+cervical+compressive+myelopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy.</a> PLoS One. 8, e64528(2013).</li>
<li>Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+Ly-6G+on+myeloid+lineage+cells+in+mouse+bone+marrow.+RB6-8C5+mAb+to+granulocyte-differentiation+antigen+%28Gr-1%29+detects+members+of+the+Ly-6+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family.</a> J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).</li>
<li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Res. 69, 431-439 (2009).</li>
<li>Holland, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+activation+of+Ras+and+Akt+in+neural+progenitors+induces+glioblastoma+formation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice.</a> Nat Genet. 25, 55-57 (2000).</li>
<li>Lynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral-induced+high-grade+gliomas+in+rats%3A+the+effects+of+PDGFB%2C+HRAS-G12V%2C+AKT%2C+and+IDH1-R132H%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H.</a> Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).</li>
<li>de Vries, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+robust+transgenic+high-grade+glioma+mouse+models+for+therapy+intervention+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies.</a> Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).</li>
<li>Uhrbom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ink4a-Arf+loss+cooperates+with+KRas+activation+in+astrocytes+and+neural+progenitors+to+generate+glioblastomas+of+various+morphologies+depending+on+activated+Akt%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt.</a> Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).</li>
<li>Marumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+mouse+glioma+model+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors.</a> Nat Med. 15, 110-116 (2009).</li>
<li>Assanah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+progenitors+in+adult+white+matter+are+driven+to+form+malignant+gliomas+by+platelet-derived+growth+factor-expressing+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses.</a> J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een robuuste en reproduceerbare werkwijze voor het isoleren en flowcytometrische analyse van PBMC die de vroege muizenhersenen tumor micro geïnfiltreerd. Glioom celsuspensies worden gegenereerd in een concentratie die door de experimentator die stereotactisch worden geënt in het striatum van de hersenen van muizen. Muizen worden vervolgens gedood op vooraf bepaalde tijdstippen gespecificeerd door het experimentele ontwerp en hun hersenen worden geoogst en verwerkt tot glioma infiltreren PBMCs die...

Gliomen zijn een klasse van neuro hersenkanker voortvloeien uit getransformeerde glia binnen het centrale zenuwstelsel (CZS). Van alle gliomen, World Health Organization (WHO) graad IV glioma of glioblastoom (GBM) is de meest voorkomende en dodelijke 1. GBM is zeer ongevoelig is voor de huidige standaard-of-care bestaat uit tumorresectie zoveel mogelijk gevolgd door bestraling plus gelijktijdige en adjuvante chemotherapie met temozolomide 2. Deze dodelijke vormen van kanker dragen een sombere prognose slechts 15-18 maanden van overleving vanaf het moment van de initiële diagnose slechts 5% van de patiënten overleven van de ziekte na 5 jaar 3. De aanwezigheid van de bloed-hersenbarrière (BBB), gebrek aan professionele antigenpresenterende cellen (APCs), en de eerder geïdentificeerde bestaan ​​van bonafide lymfatische structuren binnen de hersenen 4 hebben geleid tot het begrip GBM immuun bevoorrecht. Echter, vele studies nu show dat deze hersenen kanker inderdaad wekken de werving van perifere immuuncellen die zijn overwegend myeloïde in oorsprong die monocyten, macrofagen, en myeloide suppressor cellen (MDSCs) 5 bevatten. GBM heeft ook invloed op de activiteit van de hersenen-resident microglia om pro-tumorigene 6,7 geworden. Lymfoïde cellen, zoals CD8 + T-cellen 8 en CD56 + natuurlijke killercellen 9 zijn ook aanwezig in de tumor micro-omgeving, maar in veel kleinere aantallen, een feit toe te schrijven aan immunosuppressieve werking aangezet door-glioom afgeleide factoren op tumor-geassocieerde macrofagen ( TAM) 10. CD4 + T-cellen zijn ook aanwezig in GBM, maar veel van deze populatie uit tevens CD25 en Foxp3, makers van immunosuppressieve regulerende T (T reg) cellen 11. De totale immunosuppressieve staat GBM culmineert in het bevorderen van immunologische ontsnappen en tumorprogressie 12. <p class= &quot;jove_content&quot;&gt; Een beter begrip van de mechanismen van GBM immunosuppressie is cruciaal voor de ontwikkeling van effectieve immunotherapeutische strategieën om het immuunsysteem te stimuleren tegen de tumor. In de afgelopen 15 jaar ons lab heeft gewerkt om de mechanismen van hersentumor immunosuppresson om effectieve nieuwe anti-GBM immunotherapeutics 13-19 ontwikkelen overwinnen. Het hoogtepunt van dit werk heeft nu geleid tot een klinische proef ontworpen om een ​​gecombineerde cytotoxische en immuun-stimulerende therapeutische voor patiënten met nieuw gediagnosticeerde GBM (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01811992) te evalueren. Onze meest recente werk toont aan dat muis en rat CNS GL26-1 GBM cellen blokkeren anti-tumor NK cell immune surveillance door het produceren van grote hoeveelheden van de β-galactoside-bindende lectine galectine-1 (gal-1) 20. Dit werd aangetoond door het onderdrukken van de expressie van gal-1 in glioomcellen via shRNA gemedieerde gen knockdown. In vitro Experiments bleek dat gal-1-deficiënte glioomcellen gewoonlijk vermeerderd in cultuur, maar onderging een snelle afstoting kort na intracraniale enting in syngene C57BL / 6J of RAG1 - / - muizen, waardoor de onafhankelijkheid vaststelling van T- en B-cellen op deze vorm van tumor afstoting. NK cel immunodepletie met anti-asialo GM 1 anti- serum of monoklonale antilichamen NK1.1 geleid tot volledig herstel van intracraniale gal-1-deficiënte glioom groei, waardoor de rol van NK-cellen in gal-1-deficiënte glioom afstoting. We tonen nu dat immunodepletie van Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen voldoende om gal-1-deficiënte glioom afstoting ondanks de aanwezigheid van NK-cellen, dus een onmisbare ondersteunende rol van myeloïde cellen onthullend het verlenen van hulp NK-gemedieerde gal -1-deficiënte tumor lysis (ongepubliceerde gegevens). Deze onverwachte resultaat heeft geleid tot een algemeen protocol voor de isolatie en analyse van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC&#39;s) ontstaan ​​dieinfiltreren de hersenen tumor micro kort na intracraniële implantatie zodat we beter het immuunsysteem infiltratie gebeurtenissen die gal-1-deficiënte glioom afwijzing predikaat kunnen karakteriseren. De methode wordt hier aangetoond met behulp van de muis GL26 glioom cellen die constitutief uitdrukkelijke mCitrine fluorescerend eiwit, genaamd GL26-Cit, dat directe tumorcel visualisatie mogelijk te maken door fluorescentiemicroscopie 21. Deze cellen worden geënt stereotactisch in de hersenen van syngene C57BL / 6J-muizen en kunnen groeien voor 24, 48 of 72 uur voorafgaand aan euthanasie muis. -Glioom infiltreren PBMC&#39;s worden vervolgens geïsoleerd en immunolabeled met behulp van anti -CD45, -GR-1, -CD11b en -NK1.1 celoppervlak antilichamen samen met intracellulaire immunolabeling voor granzyme B (GzmB). Deze specifieke combinatie van antilichamen maakt de identificatie van tumor infiltrerende Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen en NK1.1 + NK-cellen, celtypen we bEen betrokken bij gal-1-deficiënte tumor afstoting. De immune infiltratie profiel van gal-1-deficiënte GL26-Cit glioom, aangeduid hier als GL26-Cit-gal1i, wordt vervolgens vergeleken met die van gliomen expressie normale niveaus van gal-1 genoemd GL26-Cit-NT dat een niet bevatten targeting controle shRNA hairpin. Het protocol begint met een beschrijving over hoe de cultuur GL26-Cit glioom cellen in vitro, die wordt gevolgd door een uitleg over hoe orthotopically engraft deze cellen in het striatum van syngene C57BL / 6J muizen. Het gaat dan verder naar de stappen die betrokken zijn bij de isolatie en immunokleuring van glioma-infiltrerende PBMCs voor flowcytometrische analyse sommen. Het protocol wordt afgesloten met een toelichting van de standaard data-analyse en grafische weergave. De demonstratie laat zien dat zowel Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen en NK1.1 + NK-cellen preferentieel ophopen in de gal-1-deficiënte hersenen tumor micro-omgeving binnen 48hr van de tumor implantatie, een resultaat dat helpt verklaren waarom deze tumoren sneller ondergaan volledige tumorlysis ongeveer 1 week na de tumor implantatie 20. De werkwijze is gemakkelijk aan een aantal verschillende in vivo experimentele modellen waarin temporele gegevens immune infiltratie in de hersenen vereist. Een enkele experimentalist kan het protocol uitvoeren van hersenen oogst tot cytometrische analyse van glioom infiltreren PBMCs stromen in ongeveer 4-6 uur, afhankelijk van het aantal monsters worden geanalyseerd. De werkwijze kan ook worden gecombineerd met experimenten gericht op het profiel van circulerende PBMCs in tumor dragende muizen ter vergelijking met die die de hersenen infiltreren zo te immunosuppressie fenotypes specifiek geïnduceerd door de tumor micro identificeren karakteriseren. De toepassing van deze en soortgelijke methoden moeten een beter begrip van de betrokken zijn bij de smokkel van perifere immuuncellen in de hersenen tumor micro factoren te vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modification of Eagles Medium</td><td>Gibco</td><td>12430-054</td><td>met 4,5 g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES en fenolrood&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate-buffered Saline&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td>zonder calciumchloride of magnesiumchloride</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>10.000 U/ml Penicillin; 10.000 &mu;g/ml Streptomycin&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>G418 sulfate&nbsp;</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>GN-04</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>van Streptomyces alboniger</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternatief&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30030.01</td><td>in DPBS met EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Phase contrast hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>0,1 mm diep</td></tr><tr><td>Trypan blauw kleurstof</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Steriele 0,9% NaCl injectie, USP</td><td>Hospira</td><td>NDC: 0409-4888</td><td>10 ml flacons</td></tr><tr><td>0,6 ml conische polypropyleenmi microtubes</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-272</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezole hydrochloride injectie</td><td>Orion Pharma</td><td>NDC: 52483-6298</td><td>5 mg/ml oplossing</td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride injectie</td><td>Fort Dodge</td><td>NDC: 0409-2051</td><td>100 mg/ml oplossing</td></tr><tr><td>Dexmedetomidine hydrochloride injectie</td><td>Zoetis</td><td>NDC: 54771-2805</td><td>0,5 mg/ml oplossing</td></tr><tr><td>Xylazine hydrochloride injectie</td><td>Lloyd</td><td>NDC: 61311-481</td><td>100 mg/ml oplossing</td></tr><tr><td>Carprofen injectie</td><td>Pfizer</td><td>NDC: 61106-8501</td><td>50 mg/ml oplossing</td></tr><tr><td>Buprenorfine hydrochloride injectie</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>NDC: 12496-0757</td><td>0,3 mg/ml ampullen</td></tr><tr><td>1 ml tuberculine spuiten&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>26G x &frac12; (0,45 mm x 13 mm) spuitnaalden&nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische knipschaar</td><td>3M</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Providoon-jood oplossing</td><td>Aplicare</td><td>82-217</td><td>NDC: 52380-1905</td></tr><tr><td>Steriele petrolatum oogzalf&nbsp;</td><td>Dechra</td><td>NDC: 17033-211</td><td></td></tr><tr><td>70% isopropylalcohol preparaatkussentjes</td><td>Kendall</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Steriele gaas</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td>niet geweven, 4" x 4", 4-laags&nbsp;</td></tr><tr><td>1,7 ml conische polypropyleen microtubes</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td></td></tr><tr><td>Muis stereotactische frame</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische lamp</td><td>Philips Burton</td><td>CS316W</td><td>Coolspot II variabele schijnwerper</td></tr><tr><td>Gebogen dissectietang</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>5431</td><td></td></tr><tr><td>Colibri retractoren&nbsp;</td><td>FST</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Snoerloze precisie boormachine</td><td>Dremel&nbsp;</td><td>1100-01</td><td>Stylus model; 7,2-Volt Lithium-Ion met dockingstation</td></tr><tr><td>Graveermes</td><td>Dremel</td><td>105</td><td>1/32" of 0,8 mm bitsdiameter</td></tr><tr><td>Microliter spuit</td><td>Hamilton</td><td>75</td><td>Hamilton Microliter Spuiten 700-serie; 5 &mu;l volume</td></tr><tr><td>Microliter spuitnaalden</td><td>Hamilton</td><td>7762-06</td><td>33 G, kleine hub RN NDL, 1,5 inch, puntstijl 3, 6/PK</td></tr><tr><td>Ethilon 3-0 zwarte monofilament nylon hechtdraad&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>1663</td><td></td></tr><tr><td>Magneet roerlat</td><td>VWR</td><td>74950-296</td><td>7,9 mm diameter x 50 mm lengte (5/16" diameter x 2" lengte)</td></tr><tr><td>1 L glazen schroefdop opslagfles</td><td>Corning</td><td>1395</td><td>Type 1, Klasse A borosilicaatglas</td></tr><tr><td>Heparine natrium&nbsp;</td><td>Sagent</td><td>NDC: 25021-400</td><td>1.000 U/ml oplossing</td></tr><tr><td>Peristaltiekpomp</td><td>Cole Parmer Instruments Group</td><td>77200-60</td><td>Master Flex Easy Load II console drive</td></tr><tr><td>gecomprimeerd carbogen (95% O2 / 5% CO2)</td><td>beschikbaar bij lokale verkoper</td><td>N/A</td><td>A-type, grote cilinder&nbsp;</td></tr><tr><td>20 G x 1 &frac12;" aluminium hub stompe naalden</td><td>Kendall</td><td>8881202363</td><td>0,9 mm x 38,1 mm</td></tr><tr><td>Polyurethaan ijsemmer</td><td>Fisherbrand</td><td>02-591-45</td><td>Capaciteit: 0,152 oz. (4,5L)</td></tr><tr><td>Collageenase (Type I-S)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1639</td><td>van Clostridium histolyticum&nbsp;</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS002007</td><td>>2.000 Kunitz units per mg drooggewicht</td></tr><tr><td>Antistatische polystyreen hexagonale weegschalen</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>20157-3</td><td>top I.D. 115 mm, base I.D. 85 mm, 203 ml volume&nbsp;</td></tr><tr><td>Roestvrijstalen enkele blad scheermesjes&nbsp;</td><td>Garvey</td><td>40475</td><td></td></tr><tr><td>Botrongeurs</td><td>FST</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>FST</td><td>13014-14</td><td></td></tr><tr><td>Grote dissectiescharen</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Kleine dissectiescharen</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Stompe uiteinden tang</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>13250</td><td></td></tr><tr><td>7 ml glazen Dounce weefselmol

isolatie en flow cytometrische analyse van glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Ons laboratorium heeft onlangs aangetoond dat natuurlijke killer (NK) cellen in staat zijn het uitroeien orthotopically geïmplanteerde muizen GL26 en rat CNS-1 maligne glioom kort na intracraniale enting als de kankercellen deficiënt zijn weergegeven in hun expressie van de β-galactoside-bindende lectine galectine -1 (gal-1). Meer recent werk toont nu dat een bevolking van Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen is cruciaal voor dit effect. Om een ​​beter inzicht in de mechanismen waarmee NK- en myeloïde cellen samen om gal-1-deficiënte tumor afstoting verlenen we hebben een uitgebreid protocol voor de isolatie en analyse van glioma-infiltrerende perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) ontwikkeld. De werkwijze wordt hier aangetoond door PBMC infiltratie in de tumor micro-omgeving van gal-1-expressie GL26 gliomen met die rendered gal-1-deficiënte via shRNA knockdown. Het protocol begint met een beschrijving van hoe de cultuur en voor te bereiden GL26 ceLLS voor enting in de syngene C57BL / 6J muis hersenen. Het verklaart vervolgens de stappen die betrokken zijn bij de isolatie en flowcytometrische analyse van glioom infiltreren PBMC&#39;s uit het begin van de hersenen tumor micro. De werkwijze is aanpasbaar aan een aantal in vivo experimentele modellen waarin temporele gegevens immune infiltratie in de hersenen vereist. De werkwijze is gevoelig en zeer reproduceerbare, zoals glioom-infiltrerende PBMCs worden geïsoleerd uit intracraniale tumoren 24 uur na tumor implantatie met gelijke waargenomen vanaf tijdstip afgestemd tumoren gedurende onafhankelijke experimenten celtellingen hoogte. Eén experimentalist kan de werkwijze van hersenen oogst tot cytometrische analyse van glioma infiltrerende PBMCs stromen ongeveer 4-6 uur afhankelijk van het aantal te analyseren monsters. Alternatieve glioma modellen en / of cel-specifieke detectie antilichamen kunnen eveneens worden gebruikt ter beoordeling van experimentalisten om de infiltratie van een aantal andere immun beoordelene celtypen van belang, zonder de noodzaak voor wijziging van de algemene procedure.

De volgende gating strategie wordt gebruikt voor een typisch experiment: FSC-A vs. SSC-A → SSC-H vs. SSC-W → FSC-H vs FSC-W → CD45 vs. count → Gr-1 vs. CD11b → NK1.1 vs. tellen. Gates geplaatst Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen en NK1.1 + NK-cellen worden vervolgens gestratificeerd op basis GzmB expressie (Figuur 5A). Backgating die cellen geïdentificeerd als NK1.1 + NK-cellen en Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen in onze experimenten op FSC...

Hier voorgesteld is een eenvoudige methode voor het isoleren en flowcytometrische analyse van glioma infiltrerende perifere mononucleaire cellen die tijdsafhankelijk kwantitatieve gegevens over het aantal en activeringsstatus van immuuncellen die het begin hersentumor micro oplevert.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Het algemene doel van deze procedure is om het aantal perifere bloedmononucleaire cellen dat is geïnfiltreerd in de vroege hersentumormicro-omgeving te karakteriseren en te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van hersentumorimmunologie door factoren te identificeren die belangrijk zijn voor het verkeer van perifere immuuncellen naar de hersentumormicro-omgeving. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het tijdsafhankelijke kwantitatieve gegevens oplevert over het aantal en de activeringsstatus van leukocyten die dit CZS zijn binnengekomen.Nadat een verdoofde muis in een stereotactisch frame is geplaatst, maakt u een twee centimeter lange middenincisie over de schedel van het voorste bot tot het achterste bot met behulp van een scalpelmes. Trek vervolgens de huid bij de incisie terug met behulp van Collibra-retractoren. Laat daarna een microlieterspuit uitgerust met een 33 gauge naald direct boven de bma zakken.Pas de positie van de naald aan om de doelsite voor tumorimplantatie te bereiken. Gebruik vervolgens een enkele milliliter tuberculine-sering uitgerust met een 26 gauge naald om deze locatie te markeren

isolation-flow-cytometric-analysis-glioma-infiltrating-peripheral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het huidige artikel beschrijft een snelle protocol om efficiënt te isoleren mononucleaire cellen van hersenen en het ruggenmerg weefsels die effectief kan worden gebruikt voor flowcytometrische analyses.

Isolatie van hersenen en ruggenmerg mononucleaire cellen met behulp van Percoll Verlopen

Deze video protocol toont de toepassing van de fluorescente kleurstof carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) voor de identificatie en scheiding van verschillende sub-populaties van cellen in humane glioblastoma gebaseerd op de frequentie van de celdeling.

Identificatie en isolatie van Slow-delende cellen in Human Glioblastoma Met behulp van Carboxy fluoresceïne succinimidylester (CFSE)

The video demonstrates the isolation of tumor-infiltrating peripheral blood mononuclear cells from a mouse brain using mechanical dissociation and enzymatic digestion. This is followed by density gradient centrifugation to collect the immune cells for further analysis.

Isolating Tumor-Infiltrating Immune Cells from a Murine Brain

Ontsteking speelt een centrale rol in de pathogenese van ischemische beroerte. Toenemend bewijs suggereert dat het als een tweesnijdend zwaard werkt, wat vroege hersenschade verergert, maar ook bijdraagt aan later herstel. Dit protocol beschrijft de isolatie van immuuncellen uit de ischemische hersenen en hun daaropvolgende flowcytometrische fenotypering.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen

Dit protocol geeft een analyse van de macrofage subpopulaties in het centraal zenuwstelsel van het volwassen muis door middel van flowcytometrie en is nuttig voor het bestuderen van meerdere markers die door deze cellen worden uitgedrukt.

Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry

Dit protocol werd ontwikkeld om tumormicro-milieukomponenten kwantitatief te identificeren bij glioblastoom-patiëntresecties onder toepassing van chromogene immunohistochemie en ImageJ.

Kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire microomgeving bij patiëntenglioblastoomresecties

Dit manuscript presenteert een protocol om actieve experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) bij muizen te induceren. Een methode voor de isolatie en karakterisering van de geïnfiltreerde lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt ook gepresenteerd om te laten zien hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van cns auto-immuunziekte.

Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis

We presenteren een methode voor het repliceren van de micro-omgeving van de glioomtumor aan het invasieve front die interstitiële vloeistofstroom omvat. Dit model is een hyaluronzuur-collageen I hydrogel in een weefselkweekinzetstuk waar een vloeistofdrukkop op kan worden aangebracht. Invasie kan worden gekwantificeerd en cellen kunnen worden geïsoleerd of gelyseerd.

Een fotopolymeriseerbaar hyaluronzuur-collageenmodel van de invasieve glioommicro-omgeving met interstitiële stroom

Het identificeren van microglia (MG) en perifere infiltrerende macrofagen (Mø) in beschadigde ruggenmerg is moeilijk. In dit protocol werd flowcytometrie (FCM) gebruikt om respectievelijk M1-achtige MG, M2-achtige MG, M1-achtige Mø en M2-achtige Mø te identificeren. Deze technologie kan ook worden toegepast op andere ziekten van het centrale zenuwstelsel om de rol van MG en Mø te begrijpen.

Identificatie van microglia en perifere infiltrerende macrofagen in het beschadigde ruggenmerg met behulp van flowcytometrie

Hier presenteren we een protocol om de immuuncelfunctie na een ischemische beroerte te beoordelen met behulp van flowcytometrische analyse in een mini-beroertemodel. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek van neuro-immuuninteracties mogelijk en kan worden aangepast voor het bestuderen van andere neurodegeneratieve ziekten, waardoor ons begrip van immuunresponsen bij beroertepathologie wordt vergroot.

Isolatie en flowcytometrische beoordeling van neuro-immuuninteracties in een mini-beroerte muizenmodel

Leer de isolatie en flowcytometrische analyse van glioom-infiltrerende perifere mononucleaire bloedcellen bij muizen. Deze methode levert tijdsafhankelijke kwantitatieve gegevens over immuuncelinfiltratie en activeringsstatus in de vroege tumor-micro-omgeving van de hersenen.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Meer video's verkennen