Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Het algemene doel van deze procedure is om het aantal perifere bloedmononucleaire cellen dat is geïnfiltreerd in de vroege hersentumormicro-omgeving te karakteriseren en te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van hersentumorimmunologie door factoren te identificeren die belangrijk zijn voor het verkeer van perifere immuuncellen naar de hersentumormicro-omgeving. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het tijdsafhankelijke kwantitatieve gegevens oplevert over het aantal en de activeringsstatus van leukocyten die dit CZS zijn binnengekomen.

Nadat een verdoofde muis in een stereotactisch frame is geplaatst, maakt u een twee centimeter lange middenincisie over de schedel van het voorste bot tot het achterste bot met behulp van een scalpelmes. Trek vervolgens de huid bij de incisie terug met behulp van Collibra-retractoren. Laat daarna een microlieterspuit uitgerust met een 33 gauge naald direct boven de bma zakken.

Pas de positie van de naald aan om de doelsite voor tumorimplantatie te bereiken. Gebruik vervolgens een enkele milliliter tuberculine-sering uitgerust met een 26 gauge naald om deze locatie te markeren door voorzichtig het periost te excoriëren. Boor vervolgens een gat in de schedel op de doelsite met de 0,8 millimeter boorslijp totdat deze de onderliggende dura mater bereikt tijdens het boren.

Breng intermitterende druk aan gevolgd door snel verwijderen van de boorslijp uit het schedeloppervlak om overmatige warmte en kracht te voorkomen. Spoel vervolgens de microlieterspuit met 0,9% natriumchloride in een 1,7 milliliter conische polypropyleen microbuis om ervoor te zorgen dat de naald niet verstopt is. Knipper voorzichtig met de 0,6 milliliter conische polypropyleen microbuis die de tumorcellen bevat, meerdere keren om de cellen grondig te resuspenderen.

Trek vervolgens twee microliters cellen op in de microlieterspuit en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit worden gebracht. Spuit een microlieters van de cellen op een 70% isopropylalcohol prep pad, waardoor exact een microlieters van tumorcellen in de spuit achterblijft. Breng daarna de naald naar beneden totdat deze de dura mater raakt.

Laat vervolgens de naald 3,5 millimeter in de hersenen zakken en trek vervolgens de naald langzaam en soepel 0,5 millimeter terug. Lever de cellen af door de zuiger van de spuit gedurende één tot twee minuten in te drukken. Om transcardiale perfusie uit te voeren op de diep verdoofde muis.

Steek een stompe naald in het linker ventrikel van het hart. Gebruik een klein paar dissectiescharen om het rechter atrium af te knippen om exsanguinatie mogelijk te maken, perfuseer het muiscirculatiesysteem met tyro-oplossing gedurende enkele minuten totdat de lever en longen volledig zijn uitgebleekt door het gebrek aan bloed. Zorg ervoor dat er geen grote hoeveelheid bloed uit het rechter atrium blijft stromen.

Voordat u de 20 gauge aluminium hub stompe naald uit het linker ventrikel verwijdert. Nadat de naald is verwijderd, ontgrendelt u de muis van de uitgedreven polystyreenschuim blok en draait u de muis met de buik naar beneden. Gebruik een groot paar dissectiescharen om het hoofd te scheiden van de rest van het lichaam.

Snij vervolgens de hoofdhuid op de middenlijn met behulp van een klein paar dissectiescharen die van het achterste bot tot aan de snuit werkt om de schedel bloot te leggen. Trek vervolgens de huid aan beide zijden van de schedel terug en houd de schedel stevig vast. Gebruik een paar bot URS om voorzichtig door de schedel te breken, beginnend bij het achterste bot en naar voren te werken om de dorsale en laterale oppervlakken van de hersenen volledig bloot te leggen.

Het oogsten van de muizenhersenen uit de schedel zonder deze te beschadigen, kan in eerste instantie moeilijk zijn. Degenen met weinig ervaring met de techniek kunnen willen proberen dit meerdere keren uit te voeren voordat ze de eigenlijke experimenten uitvoeren. Zodra de schedelbeenderen zijn verwijderd, draait u het hoofd van de muis met de buik naar boven.

Snij de hersenzenuwen aan de basis van de hersenen om deze los te maken van de schedel. Gebruik in deze procedure een schone scheermes met één zijde om het gebied van de hersenen dat de tumor bevat, te isoleren door een sagittale snede door het midden van de hersenen te maken. Om de twee hemisferen te dissecteren, draai de ipsilaterale hemisfeer met de mediale zijde naar beneden en maak een coronale snede bij het cerebellum en een andere snede bij de reukbol om het doelweefsel met de tumorimplantatie te isoleren.

Plaats vervolgens het doelweefsel in de gelabelde glazen down weefselmolen met één milliliter DPBS. Duw de zuiger helemaal naar beneden en draai zeven keer om het weefsel te verstoren. Daarna tilt u de zuiger omhoog om de vloeistof te laten bezinken naar de bodem van de weefselmolen.

Herhaal deze stap driemaal. Draai echter slechts vier keer de zuiger tijdens de volgende twee herhalingen en drie keer tijdens de laatste herhaling. Om overmatig draaien van het hersenweefsel te voorkomen.

Breng vervolgens drie volumes van één milliliter ijskoud DPBS aan op de zijkanten van de zuiger om de resterende hersensubstantie in de weefselmolen te spoelen. We suspenderen vervolgens de TRID hersensubstantie door op en neer te pipetteren en plaatsen in een gelabelde 15 milliliter centrifugebuis op ijs. Spoel de zijkanten van de down weefselmolen met een extra milliliter ijskoud DPBS en voeg toe aan dezelfde 15 milliliter centrifugebuis.

Houd alle buizen met TRID hersensubstantie op ijs totdat alle monsters zijn verwerkt. Draai vervolgens de TRID hersensubstantie in de 15 milliliter centrifugebuizen met 740 keer G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens de supernatant en suspendeer het gepelletiseerde hersenweefsel opnieuw in één milliliter van een eerder bereid mengsel van collageenase en DNA een spijsverteringsenzym.

Plaats de 15 milliliter centrifugebuizen in een reageerbu