Huisstijlen Opname Procedure voor het meten van de Slaap in Muizen
25 januari 2016
De registratie van elektro-encefalogram (EEG) en elektromyogram (EMG) bij muizen die zich vrij kunnen bewegen, is een cruciale stap om gedrag en fysiologie te correleren met slaap en waakzaamheid. Het experimentele protocol dat hier wordt beschreven, biedt een kabelgebaseerd systeem voor het verkrijgen van EEG- en EMG-opnamen bij muizen.
Het algemene doel van deze polygrafische opnameprocedure is om de waakzame toestand van muizen te bepalen en de tijd te meten die wordt doorgebracht in waakzaamheid, snelle oogbewegingsslaap of niet-snelle oogbewegingsslaap. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in bijna elk neurowetenschappelijk veld dat gedrag en fysiologie wil correleren met de activiteit van corticale neuronen bij dieren in beweging. Het grote voordeel van deze techniek is dat er veel knooppunten, elektro-encefalogram en elektromyogram kunnen worden geregistreerd en deze kunnen worden gecombineerd met andere hersenimplantaten zoals optische vezels en infusiekanules.
Visuele demonstratie van deze methode is erg belangrijk omdat de implantatie van de elektrode correct moet worden uitgevoerd en de kwaliteit van de elektrode is uiterst kritiek om de fysieke toestanden te beoordelen. Het demonstreren van de procedure zal door Yohko Takata worden gedaan, een postdoc uit mijn laboratorium. Voordat u begint, steriliseer alle chirurgische hulpmiddelen in een hete parelsterielisatiemachine.
Zodra is bevestigd dat de muis verdoofd is door een knijpen in de teen, scheer het haar op het hoofd en de nek. Bevestig vervolgens het huis op het stereotactische frame en fixeer het hoofd tussen de twee oorbeugels. Breng vervolgens oogzalf aan in de ogen om uitdroging te voorkomen.
Ga door met het reinigen van de geschoren huid met alcohol en jodium gebaseerde scrubs. Snijd vervolgens langs de middenlijn met een scalpel om de schedel bloot te leggen en bevestig de huid aan de zijkant met clips om het operatiegebied open te houden. Maak vervolgens twee gaten met een hardmetalen snijder met een 0,8 millimeter boor.
Plaats een gat boven het frontale corticale gebied. Plaats het tweede gat boven het pariëtale gebied van de rechterhersenhelft. Gebruik vervolgens een juwelenschroevendraaier om roestvrijstalen EEG-opnameschroeven in de gaten te schroeven.
Breng de schroeven in met slechts twee tot twee en een halve draai om een epidurale positionering boven de cortex te verkrijgen. De schroeven mogen niet schudden eenmaal geplaatst. Dit is erg belangrijk.
Bevestig nu de elektrodenassemblage met de pinnen omhoog op de schedel. De elektroden moeten rechtop worden bevestigd. Gebruik een wattenstaafje om de positie van de elektrode te helpen bevestigen en lijm de elektrode vast met cyanoacrylaat gevolgd door tandcement.
Maak vervolgens kleine gaatjes in de trapezius en breng de EMG-elektrode in die gaatjes. Naai vervolgens de huid met zijdedraad met een diameter van 0,1 millimeter. Verwijder nu de muis uit het stereotactische frame en plaats deze op een verwarmingspad.
Geef de muis intraperitoneale injecties van ampicilline en meloxicam en monitor de muis totdat deze weer in sternal liggende positie is. Huis de muis vervolgens alleen. Een week na het implanteren van de elektroden, brengt u de muis over naar een experimentele kooi in een geluiddichte opnamekamer.
Bevestig de EEG/EMG-elektrodenassemblage op de muis aan een opnamekabel die is aangesloten op een slipring. Verbind de AD-converterkabel met een EEG/EMG-signaalfilterversterker die is aangesloten op de slipring. Gebruik een AD-converter om het signaal om te zetten in een 128 hertz digitaal signaal en ten slotte het signaal op te nemen op een computer.
Habitueer de muis gedurende twee tot drie dagen in de opnamekamer. Als de EEG/EMG-opname medicijntoedieningen omvat, moet de muis elke dag zachtjes worden behandeld, alsof er een medicijntoediening wordt gegeven. Start vervolgens de EEG/EMG-opnamesoftware.
Om te beginnen, klikt u op het tabblad Informatie over gegevensbestand en klikt u op het vak naast de bestandsnaam. Voer een bestandsnaam in en klik op Opslaan. Selecteer vervolgens in het tabblad Opnamevoorwaarden alle EEG/EMG-kanalen die moeten worden opgenomen.
Selecteer ook de Bemonsteringsfrequentie onder dit tabblad. Controleer nu in het tabblad Kanaalinformatie of de geselecteerde kanalen correct worden weergegeven. Zodra dit is bevestigd, start u de opname door eerst het tabblad Timer-instelling te selecteren.
Klik vervolgens op monitor om EEG en EMG weer te geven. Als de signalen correct worden weergegeven, stelt u de kloktijd in voor het begin en het einde van de opname in het gebied Hoofdtimer. Klik vervolgens op de knop Monitor om de opname te starten.
Neem nu de signalen op onder basislijnomstandigheden en verschillende behandelingsvoorwaarden gedurende meerdere dagen. Wanneer het experiment is voltooid, euthaniseer de muis met pentobarbital. Start de software voor EEG/EMG-analyse.
Open de EEG/EMG-ruwe gegevens, een KCD-bestand. Klik op het tabblad Slaap en stel de Epoch-tijd in op 10 seconden. Selecteer vervolgens Multi-screening om alle tien seconden epochen automatisch in drie fasen te scoren op basis van de amplituden van de EEG en de EMG en op basis van de spectrale analyse van de EEG.
Klik vervolgens op de FFT-voorwaarde voor EEG-tabblad. Stel daar de parameters voor de spectrale analyse in. Gebruik 256 datapunten die overeenkomen met elke twee seconden EEG, gebruik de hamming-vensterfunctie en gebruik een gemiddelde van vijf spectra per epoch.
Klik vervolgens op Ok. Klik nu op Start screening om de automatische screening te starten. Open vervolgens de opgeslagen gegevens, die zijn opgeslagen in een RAF-bestandsindeling, en controleer de resultaten van de automatische screening. Corrigeer indien nodig de resultaten als deze niet aan de standaardcriteria voldoen.
Om een correctie aan te brengen, klikt u op en houdt u de linkermuisknop ingedrukt op een onjuist beoordeelde epoch en sleept u de cursor over de reeks onjuist beoordeelde epochen. Laat de linkermuisknop los en selecteer de juiste gedragstoestand in het pop-upvenster. Onder basislijnomstandigheden vertoonden de muizen een duidelijke circadiane slaap-waakcyclus die consistent was met hun nachtelijke aard.
Tijdens de 12 uur durende lichtperiode sliepen de muizen gemiddeld 6,7 uur NREM-slaap en 0,9 uur REM-slaap. Terwijl tijdens hun 12 uur durende duisternisperiode waakzaamheid overheersend was. Andere
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een polygrafische registratieprocedure voor het beoordelen van de waaktoestand van vrij bewegende muizen via EEG- en EMG-metingen. De methode stelt onderzoekers in staat om gedrag en fysiologie te correleren met slaaptoestanden, wat inzicht biedt in de activiteit van corticale neuronen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Gedragsanalyse
Achtergrond
- Electroencephalogram (EEG) en electromyogram (EMG) registraties zijn essentieel voor het bestuderen van slaap en waakzaamheid.
- De techniek kan worden gecombineerd met andere hersenimplantaten voor een uitgebreide gegevensverzameling.
- Een correcte implantatie van de elektroden is cruciaal voor nauwkeurige metingen.
- Visuele demonstraties verbeteren het begrip van de chirurgische procedure.
Doel van de studie
- Om de waaktoestand van muizen te bepalen.
- Om de tijd die in verschillende slaaptoestanden wordt doorgebracht te meten.
- Om fysiologische gegevens te correleren met gedragsobservaties.
Gebruikte methoden
- Polygrafische registratie van EEG en EMG bij muizen.
- Gebruik van een kabelgebaseerd systeem voor data-acquisitie.
- Chirurgische implantatie van elektroden onder steriele omstandigheden.
- Visuele demonstratie van de implantatieprocedure.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle registratie van meerdere fysiologische signalen.
- Mogelijkheid om slaap en waakzaamheid te beoordelen bij vrij bewegende muizen.
- Integratie met andere experimentele opstellingen is haalbaar.
- De kwaliteit van de elektrodeplaatsing heeft een aanzienlijke invloed op de nauwkeurigheid van de gegevens.
Conclusies
- Deze methode is essentieel voor het begrijpen van de relatie tussen gedrag en fysiologie.
- Het biedt een kader voor toekomstige studies in diverse neurowetenschappelijke vakgebieden.
- Een juiste techniek en uitrusting zijn cruciaal voor betrouwbare resultaten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Een nauwkeurige beoordeling van slaap-waaktoestanden in preklinische modellen is essentieel voor het verminderen van risico's bij geneesmiddelkandidaten die op het centraal zenuwstelsel zijn gericht, door gedragstypen te koppelen aan de onderliggende neurale activiteit. Deze polygrafische registratiemethode maakt kwantitatieve, longitudinale monitoring van waaktoestanden bij vrij bewegende muizen mogelijk, wat de mechanistische validatie van slaapmodulerende verbindingen ondersteunt. De techniek biedt translationele continuïteit van target-interactie naar functionele output, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen in vroege discovery-pipelines.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door EEG/EMG-gedefinieerde slaaptoestanden te correleren met farmacologische of genetische manipulaties.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele validatie van targets via objectieve, kwantificeerbare metingen van de waaktoestand die mechanistische ambiguïteit verminderen.
- Predictieve waarde: Genereert dosis-respons- en tijdverloopgegevens die het vertrouwen in target-engagement en padmodulatie vergroten.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert gestandaardiseerde, hoogwaardige EEG- en EMG-signalen die geschikt zijn voor geautomatiseerde scoringspijplijnen met gebruik van spectrale analyse en amplitudedrempels.
- Kwantitatieve output: Levert epoch-gebaseerde classificatie van waaktoestand, NREM-slaap en REM-slaap, wat reproduceerbare vergelijkingen tussen groepen mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Compatibel met chronische registratie-opstellingen, waardoor longitudinale beoordelingen over verschillende behandelcondities en circadiane cycli mogelijk zijn.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert de menselijke slaaparchitectuur via kwantificeerbare NREM- en REM-slaapmetrieken, ter ondersteuning van studies naar slaapstoornissen en neuropsychiatrische aandoeningen.
- Afstemming met translationele biomarkers: Verschuivingen in het EEG-powerspectrum (delta 0,5–4 Hz voor NREM, theta 6–10 Hz voor REM) dienen als kwantificeerbare biomarkers voor overgangen tussen slaaptoestanden.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Gegevens over de slaap-waakverdeling informeren de preklinische veiligheids- en effectiviteitsprofielering, in het bijzonder voor CNS-actieve verbindingen die de arousal of sedatie beïnvloeden.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing tot lead-optimalisatie, en biedt fysiologische read-outs die de brug slaan tussen moleculaire interventie en gedragsmatige output bij de ontwikkeling van neuropsychiatrische geneesmiddelen.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothese-gestuurd onderzoek naar neurale circuits die arousal en slaap-waakovergangen reguleren via celtype-specifieke manipulaties in combinatie met fysiologische read-outs.
- Screening: Maakt reproduceerbare monitoring van de waaktoestand in assay-ready formaat mogelijk voor het evalueren van effecten van verbindingen op de slaaparchitectuur over 24-uurs cycli.
- Analytica: Powerspectrumanalyse en geautomatiseerde epoch-scoring leveren kwantitatieve, vergelijkbare read-outs voor het beoordelen van door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in slaapduur en fragmentatie.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de continuïteit naar preklinische validatie door menselijke slaap-EEG-fenotypes en circadiane regulatie te modelleren in een genetisch hanteerbaar systeem.
- Hergebruik binnen de organisatie: Herbruikbare chirurgische en registratie-infrastructuur ondersteunt longitudinale studies over meerdere projecten, waardoor de opstartlast per studie wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door de ambiguïteit tussen moleculaire effecten en functionele slaap-waakresultaten te verminderen.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde workflows voor elektrodenimplantatie en signaalacquisitie verbeteren de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en experimentele batches.
- Strategische waarde: Maakt vroege identificatie van off-target effecten in het CZS mogelijk, wat de kapitaalefficiëntie verbetert en uitval in een laat stadium door onvoorziene slaapstoornissen vermindert.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen op basis van slaap-waakprofielen, waardoor beslissingen over verdere ontwikkeling worden afgestemd op overwegingen met betrekking tot de therapeutische index.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in stereotactische chirurgie, EEG/EMG-signaalacquisitie en spectrale analyse voor slaapstadiëring.
- Afhankelijk van een stabiele registratie-infrastructuur, inclusief sleepringen, versterkers en software die in staat is tot FFT-gebaseerde EEG-analyse en geautomatiseerde statusclassificatie.
- Vereist standaardisatie tussen teams met betrekking tot elektrodeplaatsing, filterparameters en scoringscriteria om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten correcties voor verschillende muizenstammen, leeftijden of comorbide modellen die de basislijn van de slaaparchitectuur of de signaalkwaliteit kunnen beïnvloeden.
- Praktische beperkingen omvatten de chirurgische hersteltijd, gedragsbeperkingen door de tethering en de noodzaak van habituatie aan de registratiekamers om door stress geïnduceerde slaapfragmentatie te minimaliseren.
