Name: Initiëren Differentiatie in Onsterfelijk Multipotent Otic Progenitor Cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Leer het differentiëren van iMOP-cellen naar binnenoorceltypen voor auditieve regeneratie. Deze methode helpt onderzoekers om cochleaire haarcellen en auditieve neuronen te ontwikkelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund (K.Y.K.), Busch Biomedical Research Grant (K.Y.K.) en de Rutgers Faculty Development Grant (K.Y.K.).

1. Behoud van Self-vernieuwing in IMOP Cellen <ol><li> Bereid iMOP cultuur media: DMEM / F12, 1X B27 supplement, 25 ug / ml carbenecillin en 20 ng / ml bFGF. Maak 50 ml iMOP voedingsbodems met steriele reagentia. Warmen 49 ml DMEM / F12 in een 50 ml conische in een 37 ° C waterbad. <ol><li> Ontdooi 50X B27 supplement en filter gesteriliseerd 100 mg / ml carbenecillin porties gedurende 5 min in een 37 ° C waterbad. Ontdooien 100 ug / ml bFGF portie bij kamertemperatuur. Voeg 1 ml 50X B27, 10 pi 100 pg / ml bFGF en 12,5 pl van 100 mg / ml carbenecillin in DMEM / F12. </li></ol></li><li> Gebruik 3 ml medium in een 60 mm weefselkweekplaat te kweken iMOP cellen. Voeg vers medium aan culturen om de andere dag verdubbeling van de omvang van de media. Zorg ervoor dat de concentratie van bFGF niet beneden 5 ng / ml. <ol><li> Culture iMOP cellen bij 37 ° C met 5% CO 2 Passage cellen na 5-7 dagen kweek zoals aangegeven in de onderstaande stappen. Transfer cultuur aan een 15ml conische met behulp van een 10 ml pipet tip. </li></ol></li><li> Voeg 1 mM EDTA in HBSS door verdunning van 0,1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 in 50 ml HBSS. Pre-warm 1 mM EDTA in HBSS in een 37 ° C waterbad. </li><li> Oogst cellen door zwaartekracht sedimentatie of centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 min. bij kamertemperatuur. Zwaartekracht sedimentatie, plaats de 15 ml conische met de culturen in de 37 ° C incubator voor 5-10 min. Na die tijd acht de otospheres verzamelen op de bodem van de 15 ml conische. OPMERKING: Overmatig middelpuntvliedende kracht kan celschade veroorzaken. </li><li> Zorgvuldig aspireren bracht media met een pipet 2 ml aspireren zonder de celpellet. Voeg 0,5 ml voorverwarmd 1 mM EDTA HBSS oplossing pellet cel. Met behulp van een pipet P1000, voorzichtig pipet op en neer 2-3 keer. Plaats conisch bij 37 ° C en incubeer gedurende &lt;5 min tot dissociatie in afzonderlijke cellen vergemakkelijkt. </li><li> Wervelen voorzichtig de cel oplossing om te bepalen of otospheres worden gescheiden. Als er geen otobollen sediment op de bodem van de conische worden de cellen gedissocieerd. De incubatietijd kan variëren. OPMERKING: Langdurige incubatie met EDTA leidt tot overmatige celdood. </li><li> Verwijder cellen van 37 ° C, voeg 2 ml van de media om te neutraliseren en verdun de EDTA. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren out verdunde EDTA met een pipet 2 ml opzuigen en voeg 5 ml 1X PBS aan de cellen te wassen. </li><li> Spin cellen neer op 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuigen uit 1X PBS met een pipet 2 ml opzuigen. Resuspendeer de cellen met behulp van een P1000 pipet 0,5 ml iMOP kweekmedium door zachtjes en neer te pipetteren 2 - 3 keer. </li><li> Tellen cellen met behulp van een microfluïdische deeltje teller met de juiste cassettes 28. Een samenvloeiing plaat van iMOP cellen ~ 6 X10 bevatten 6 cellen. Verdun de cellen 1: 100 in media en voeg 75 ul celoplossing in de cassette voor het tellen. Plaat 1 x 10 6 cellen in een 6 cm schotel in iMOP Culture media (~ 1: 10 verdunning). Passage iMOPs elke 5-7 dagen. OPMERKING: Cellen die grote otospheres vorm of in de onderkant van de weefselkweekschaal zullen differentiëren. Cellen zullen ook sterven als de culturen zijn meer dan confluent. </li></ol> 2. invriezen en ontdooien IMOP Cellen <ol><li> Bereid synthetisch invriesmedium door ontdooien en equilibreren van de oplossing tot 4 ° C voor het invriezen cellen. </li><li> Verzamel cellen uit confluente 6 cm schaaltje iMOP cellen. Gebruik een pipet 10 ml en overdracht cellen (~ 6 - 8 x 10 6 cellen) in een 15 ml conische. </li><li> Oogst cellen door zwaartekracht sedimentatie of centrifugeren bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Als de otospheres klein zijn, zullen de cellen niet te regelen door de zwaartekracht sedimentatie. Optioneel: Tellen cellen met behulp van stap 1,9 tot totale aantal cellen te bepalen. </li><li> Zuig bracht media met behulp van een 2 ml opzuigen pipet terwijl de losse cel pellet achter. </li><li> Voeg 0,25 ml van synthetische bevriezing media ce mengenlls bij een dichtheid van 5 x 10 ~ 5 om 3 x 10 6 cellen / ml. Voorzichtig pipet cellen met een P1000 pipet. Breng de celsuspensie om cryogene flesjes met een P1000 pipet met 1 ml gefilterd tip. </li><li> Plaats de flacons in een alcoholvrije bevriezing container en zet de container invriezen bij -80 ° C tot de temperatuur 1 ° C per minuut te verlagen tot de temperatuur bereikt -80 ° C. </li><li> Voor langdurige opslag van cellen dragen de flesjes de dampfase van vloeibare stikstof opslagtank. Te ontdooien cellen voor cultuur, evenwicht cryogene flacon met bevroren cellen bij -80 ° C. </li><li> Pre-warm iMOP cultuur media in een 37 ° C waterbad. </li><li> Ontdooi de bevroren flacon snel door zwenken van de bodem van de flacon in een 37 ° C waterbad. Voeg 1 ml voorverwarmde iMOP cultuur media om ontdooide cellen eenmaal de laatste ijskristal verdwijnt. Overdracht cellen in een 15 ml conische en voeg een extra 4 ml iMOP cultuur media </li><li> Spin de co 15 mlnische gedurende 5 min. bij 200 xg en zuig het verbruikte media. Resuspendeer de cellen in 2 ml kweekmedium iMOP en plaat cellen in een 6 cm schaaltje. Incubeer kweken bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende expansie. </li></ol> 3. Differentiatie IMOP cellen in Sensory epitheel <ol><li> Bereid 50 ml iMOP sensorische epitheel differentiatie media: DMEM / F12, 1X B27 supplement, 25 ug / ml carbenecillin. Maak 50 ml iMOP sensorische epitheel differentiatie media. Warmen 49 ml DMEM / F12 in een 50 ml conische in een 37 ° C waterbad. Dooi 50X B27 supplement en 100 mg / ml carbenecillin monsters gedurende 5 min. in een 37 ° C waterbad. Voeg 1 ml 50X B27 en 12,5 pl van 100 mg / ml carbenecillin in DMEM / F12. </li><li> Om te oogsten, distantiëren, resuspendeer en te tellen cellen herhaal stappen 1,4-1,9 </li><li> Plaat 1 x 10 6 cellen in een 6 cm schotel op dag -3 behulp iMOP cultuur media. Op dag 0, overdracht kweken met een pipet 10 ml in een 15 ml conische. Verzamel de otobollen door zwaartekracht sedimentatie zoals vermeld in stap 1,6. Aspireren out bracht media met een pipet 2 ml opzuigen en laat de otospheres aan de onderzijde van de conische. </li><li> Add zachtjes in 2 ml van de zintuiglijke epitheel differentiatie media. Transfer otospheres een 6 cm schaaltje met een grote diameter 10 ml pipet. OPMERKING: Mechanische scheren van harde pipetteren kunnen cellen distantiëren van de otospheres. </li><li> Voeg 2 ml vers sensorische epitheel differentiatie media culturen om de andere dag. Eventueel kunnen de cellen worden verzameld door zwaartekracht sedimentatie en media vervangen. </li><li> Verzamel otospheres op dag 10 door de overdracht aan een 15 ml conische en waardoor de otospheres om sediment, zoals vermeld in stap 1.6.Aspirate de media bracht met een 2 ml opzuigen pipet en laat de otospheres ongestoord. </li><li> Fix otospheres door incubatie in 4% formaldehyde in 1X PBS gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Verwijderen formaldehyde-oplossing, wassen otospheres met wasbuffer (1X PBS met 0,1% Triton-100) vóór incuberen in blokkerende buffer (1X PBS dat 10% normaal geit serum en 0,1% Triton X-100) gedurende 1 uur. <ol><li> Vervang de buffer en incubeer monsters in het blokkeren van buffer met verdunde antilichaam. Incubeer bij 4 ° C. Spoelmonsters met 1 x PBS bevattende 0,1% Triton X-100 onder de otosphere aan immunokleuring 27. Transfer otospheres in 1X PBS en plaats otospheres in montage media op een glasplaatje met een P1000 pipet. Doe een dekglaasje over het monster en laat fixeermiddelen drogen bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Verwerven epifluorescentie beelden met behulp van een omgekeerde microscoop setup uitgerust met een 16 bit CCD-camera en hetzij een 20X 0,75 lucht of een 40x 1,3 NA olie-immersie objectief. Verzamel fluorescentie van verschillende kleur kanalen met de vermelde (excitatie en emissie) golflengten: blauw (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), groen (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), rood (562 ± 20nm / en 625 ± 20nm) en infrarood (628 ± 20nm / en 692 ± 20nm). </li></ol> 4. Het testen van EDU Incorporation <ol><li> Op dag -3, plaat 1 x 10 6 iMOP cellen in een 6 cm schaaltje. Drie dagen later op dag 0, oogst, dissociëren, resuspendeer tellen cellen door stap 1,4-1,9. </li><li> Plaat 2,5 x 10 5 cellen in iMOP cultuur media en 5 x10 5 cellen in de sensorische epitheel differentiatie media in verschillende putjes van een 6 goed gerecht. </li><li> Bepaal het percentage cellen in S-fase van Edu opname op dag 3 met een EDU incorporatie assay <ol><li> Voeg EDU stock direct naar iMOP kweken tot een uiteindelijke concentratie van 1 uM EDU verkrijgen in het kweekmedium. </li><li> Incubeer edu in iMOP culturen 2 uur en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2. Oogst, scheiden en het verzamelen van cellen herhaal stappen 1,4-1,9. In de 4% formaldehyde in 1X PBS gedurende 15 min. bij RT om cellen te repareren. Oogst de cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijderen formaldehyde-oplossing en properly beschikken. </li><li> Etiket kernen van cellen met Hoechst en opgenomen Edu met groene fluorescentie kleurstof-azide volgens het protocol van de fabrikant. Opmerking: Alle wassingen worden uitgevoerd met 1X PBS, 3% BSA en 0,1% Tween 20. Was de cellen tweemaal met 1X PBS. </li><li> Mount cellen op een dia met antifade reagens en plaats een 1,5 deksel glas over het monster. Acquire fluorescentiebeelden van gelabelde cellen met behulp van een epifluorescentie microscopie. </li></ol></li></ol> 5. Differentiatie-IMOP Afgeleid Neuronen <ol><li> Maak 50 ml van neuronale differentiatie media: Neurobasal media, 1X B27 supplement, 2 mM L-glutamine. Ontdooi fles 50X B27 en 200 mM L-glutamine bij 37 ° C waterbad gedurende 5 min. Voeg 1 ml 50X B27 en 0,5 ml 200 mM L-glutamine tot 48,5 ml Neurobasal medium. </li><li> Coat dekglaasje door het plaatsen van 12 mm rond 1,5 dekglaasjes in een steriele 10 cm plaat en voeg 70% EtOH om de plaat te steriliseren en reinigen van de dekglaasjes. </li><li> Voorzichtig schudden de baairslips te zorgen dat ze worden behandeld in ethanol. Laat de plaat gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Spoel de dekglaasjes 3 keer met steriele 1X PBS te spoelen de resterende ethanol. Spoel de dekglaasje eenmaal met steriele H 2 0 te spoelen resterende 1X PBS. </li><li> Zuig het H 2 0 met een pipet 2 ml opzuigen en laat de dekglaasjes drogen. Maak de dekglaasjes aan UV-licht in de weefselkweek kap voor 15 min. Bewaren coverslips in een steriele omgeving als het niet onmiddellijk wordt gebruikt. </li><li> Plaats een 12 mm rond dekglaasje in elk putje van een 24 goed gerecht. Schud voorzichtig plaat zodat de dekglaasjes plat op de bodem van de put. </li><li> Ontdooien 2 mg / ml poly-D-lysine voorraadoplossing bij kamertemperatuur en verdun tot een 10 ug / ml poly-D-lysine-concentratie in 1X PBS. Voeg 0,25 ml van 10 ug / ml poly-D-lysine aan de putjes. Laat de plaat in de 37 ° C incubator gedurende 1 uur. </li><li> Was de putjes 3 keer met steriel 1X PBS. Dooi 10 mg / ml laminine voorraad oplossing bij kamertemperatuur en verdund tot 10 ug / ml in 1X PBS. Voeg 0,25 ml van 10 ug / ml laminine werkoplossing in een enkel putje van een 24 meerdere putjes. Incubeer de plaat bij 37 ° C incubator. Zuigen de laminine oplossing om met een 2 ml opzuigen pipet. </li><li> Was het dekglaasje 3 keer met 1X PBS door toevoegen van 1 ml 1X PBS met een P1000 pipet en de 1X PBS verwijderd door opzuigen met een pipet 2 ml opzuigen. Vertrekken 1X PBS van de laatste wasbeurt in het goed totdat cellen zijn klaar om te worden verzilverd. Initiëren neuronale differentiatie door het oogsten, dissociatie en het tellen van cellen in stappen 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 cellen in een 6 cm schotel op dag -3. </li><li> Op dag 0, oogsten, dissociëren en tel cellen door het herhalen van 1,4-1,9. Zaad 1 x 10 5-1,5 x 10 5 iMOP cellen in 0,5 ml voorverwarmde neuronale differentiatie media per putje in een 24 multi-well schotel. Aspireren en voeg voorverwarmd neuronale differentiatie media culturen om de andere dag. </li><li> Fix iMOP afgeleide neuronen in 4% formaldehyde gedurende 15 min. eent RT op dag 7. Verwijder formaldehyde oplossing, wassen iMOP-afgeleide neuronen met wasbuffer (1 x PBS bevattende 0,1% Triton X-100) vóór incuberen in blokkerende buffer (1X PBS dat 10% normaal geit serum en 0,1% Triton X-100) gedurende 1 uur. <ol><li> Vervang de buffer en incubeer monsters in het blokkeren van buffer met verdunde antilichaam. Incubeer bij 4 ° C. Spoelmonsters met 1 x PBS bevattende 0,1% Triton X-100 onderworpen cellen immunokleuring 27. Was de dekglaasje met 1X PBS voordat u op de montage media. Laat de fixeermiddelen gedroogd bij 4 ° C voor het verkrijgen epifluorescentie beelden als genoemd in stap 3,8. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Petit, C., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+genes+underlying+deafness+to+hair-bundle+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function.</a> Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%27temporary%27+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss.</a> J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+age-related+hearing+loss+by+early+noise+exposure%3A+evidence+of+a+misspent+youth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth.</a> J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).</li>
<li>Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+aminoglycoside+ototoxicity+and+targets+of+hair+cell+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection.</a> Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).</li>
<li>Brigande, J. V., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quo+vadis%2C+hair+cell+regeneration%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Quo vadis, hair cell regeneration?</a> Nat Neurosci. 12 (6), 679-685 (2009).</li>
<li>Groves, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+hair+cell+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">The challenge of hair cell regeneration.</a> Exp Biol Med (Maywood). 235 (4), 434-446 (2010).</li>
<li>Okano, T., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+for+the+inner+ear%3A+recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Amplif%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions.</a> Trends Amplif. 16 (1), 4-18 (2012).</li>
<li>Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Inner+ear+stem+cells--an+oxymoron%2C+but+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why?</a> Stem Cells. 30 (1), 69-74 (2012).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+auditory+evoked+responses+by+human+ES-cell-derived+otic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors.</a> Nature. 490 (7419), 278-282 (2012).</li>
<li>Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+inner+ear+sensory+epithelia+from+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nature. , (2013).</li>
<li>Oshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+hair+cell-like+cells+from+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 141 (4), 704-716 (2010).</li>
<li>Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2Fprogenitor+cells+derived+from+the+cochlear+sensory+epithelium+give+rise+to+spheres+with+distinct+morphologies+and+features%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 10 (2), 173-190 (2009).</li>
<li>Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+and+purification+of+hair+cell+and+supporting+cell+progenitors+from+the+embryonic+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea.</a> Brain Res. 1091 (1), 282-288 (2006).</li>
<li>Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+and+differentiation+of+mammalian+sensory+hair+cell+progenitors%3A+a+requirement+for+EGF+and+periotic+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme.</a> Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).</li>
<li>Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+inner+ear+stem+cells+to+functional+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons.</a> Dev Neurobiol. 68 (5), 669-684 (2008).</li>
<li>Oshima, K., Senn, P., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+sphere-forming+stem+cells+from+the+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear.</a> Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).</li>
<li>Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+murine+pluripotent+stem+cell-derived+neural+progenitors+following+transplantation+into+mouse+cochleae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae.</a> Cell Transplant. 21 (4), 763-771 (2012).</li>
<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409(2012).</li>
<li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+the+late+otocyst+stage+mouse+inner+ear+by+transuterine+microinjection+of+a+retroviral+vector+encoding+alkaline+phosphatase+and+an+oligonucleotide+library%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library.</a> PLoS One. 8 (7), e69314(2013).</li>
<li>Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+reveals+three+different+progenitor+pools+for+neurosensory+elements+in+the+otic+vesicle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle.</a> J Neurosci. 32 (46), 16424-16434 (2012).</li>
<li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+relationships+between+mechanosensory+cells+and+the+neurons+that+innervate+them+in+the+chicken+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear.</a> Development. 132 (7), 1687-1697 (2005).</li>
<li>Raft, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+Ngn1+and+Math1+coordinates+the+production+of+neurons+and+sensory+hair+cells+during+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development.</a> Development. 134 (24), 4405-4415 (2007).</li>
<li>Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged+1+regulates+the+restriction+of+Sox2+expression+in+the+developing+chicken+inner+ear%3A+a+mechanism+for+sensory+organ+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification.</a> Development. 138 (4), 735-744 (2011).</li>
<li>Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+overlapping+expression+pattern+of+SOX2+and+SOX9+in+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development.</a> Gene Expr Patterns. 9 (6), 444-453 (2009).</li>
<li>Kiernan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+is+required+for+sensory+organ+development+in+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear.</a> Nature. 434 (7036), 1031-1035 (2005).</li>
<li>Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+induces+neuronal+formation+in+the+developing+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea.</a> J Neurosci. 30 (2), 714-722 (2010).</li>
<li>Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-MYC+transcriptionally+amplifies+SOX2+target+genes+to+regulate+self-renewal+in+multipotent+otic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 47-60 (2015).</li>
<li>Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+mammalian+cell+counts%2C+cell+size+and+cell+health+using+the+Moxi+Z+mini+automated+cell+counter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Levenstein, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+support+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).</li>
<li>Furue, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+promotes+the+growth+of+human+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (36), 13409-13414 (2008).</li>
<li>Lotz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+levels+of+FGF2+maintain+undifferentiated+stem+cell+cultures+with+biweekly+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding.</a> PLoS One. 8 (2), e56289(2013).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+inner+ear+of+the+mouse%3A+a+radioautographic+study+of+terminal+mitoses%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses.</a> Acta Otolaryngol. , Suppl 220. 1-44 (1967).</li>
<li>Matei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smaller+inner+ear+sensory+epithelia+in+Neurog+1+null+mice+are+related+to+earlier+hair+cell+cycle+exit%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit.</a> Dev Dyn. 234 (3), 633-650 (2005).</li>
<li>Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morphogenetic+wave+of+p27Kip1+transcription+directs+cell+cycle+exit+during+organ+of+Corti+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development.</a> Development. 133 (15), 2817-2826 (2006).</li>
<li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p27%28Kip1%29+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. 126 (8), 1581-1590 (1999).</li>
<li>Hasson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unconventional+myosins+in+inner-ear+sensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia.</a> J Cell Biol. 137 (6), 1287-1307 (1997).</li>
<li>Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+vs+type+II+spiral+ganglion+neurons+exhibit+differential+survival+and+neuritogenesis+during+cochlear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development.</a> Neural Dev. 6, 33(2011).</li>
<li>Bermingham, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1%3A+an+essential+gene+for+the+generation+of+inner+ear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells.</a> Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).</li>
<li>Izumikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+hair+cell+replacement+and+hearing+improvement+by+Atoh1+gene+therapy+in+deaf+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals.</a> Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).</li>
<li>Kim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuroD-null+mice+are+deaf+due+to+a+severe+loss+of+the+inner+ear+sensory+neurons+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development.</a> Development. 128 (3), 417-426 (2001).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+BETA2%2FNeuroD1+in+development+of+the+vestibular+and+auditory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems.</a> Genes Dev. 14 (22), 2839-2854 (2000).</li>
<li>Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin+1+null+mutant+ears+develop+fewer%2C+morphologically+normal+hair+cells+in+smaller+sensory+epithelia+devoid+of+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 1 (2), 129-143 (2000).</li>
<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Blanchard, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+conversion+of+fibroblasts+into+peripheral+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Monitoring IMOP Cultures Een protocol voor het handhaven zelfvernieuwing en differentiatie bevorderen van een nieuw iMOP cellijn wordt beschreven en aanvullende plating formaten worden opgenomen (tabel 1). Verschillende kritische stappen die helpen met routine expansie en differentiatie van iMOP cellen worden genoteerd. Vergelijkbaar met pluripotente stamcellen culturen, iMOP cellen hebben in theorie een onbeperkte levensduur. Opdat cellijnen goed worden ond...

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/53692">Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells</a>.
One of the authors' names was corrected from:
Jadali Azadeh
to:
Azadeh Jadali

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/53692">Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells</a>.

Erratum: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

De organen van het binnenoor, de cochlea, utriculus, sacculus en drie halfcirkelvormige kanalen, bemiddelen het vermogen om te horen en te balanceren. In de cochlea zetten haarcellen geluiden om in elektrische signalen die worden doorgegeven aan de spiraalganglionneuronen (SGN). De SGN's genereren actiepotentialen om neurale signalen door het auditieve circuit te verspreiden. Genetische mutaties, ototoxische geneesmiddelen en blootstelling aan harde geluiden dragen bij aan het afsterven van haarcellen en SGN's, wat resulteert in gehoorverlies1-4. Eenmaal verloren, worden deze cellen niet vervangen. Het gebruik van iPSC en ESC om nieuwe haarcellen of SGN's te genereren, biedt grote belofte voor therapieën voor het vervangen van cellen in het binnenoor5-8. Een snelle vooruitgang heeft aangetoond dat pluripotente stamcellen en uit het binnenoor afgeleide voorlopers zich kunnen differentiëren in haarcellen en SGN's in verschillende rijpheidsstadia. Zoogdierlijke embryonale stamcellen (ESC) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) kunnen worden gebruikt om functionele haarcellen en SGN's te genereren9-11. Stamcellen en voorlopercellen afgeleid uit het zoogdierlijke binnenoor zijn ook aangetoond om haarcellen en neuronen te vormen met eigenschappen van hun in vivo cellulaire tegenhangers12-16. 
Gebruik van iPSC of ESC-afgeleide otische voorlopers om verloren haarcellen en SGN's te vervangen vereist efficiënte differentiatie. Onjuiste differentiatie of aanhoudende proliferatie van geënt stamcel-afgeleide voorlopers in het binnenoor kan de functie van het binnenoor verslechteren en een tumorgeen risico vormen, zoals teratoombevorming in het binnenoor17. Er is een duidelijke behoefte aan het ontwikkelen van kweekcondities en het begrijpen van de differentiatie van otische voorlopers. Een strategie bij het ontwikkelen van deze methoden is om celbestemmingsbeslissingen na te bootsen die worden gemaakt door neurosensorische voorlopers tijdens de ontwikkeling van het binnenoor. Protocollen die proliferatie voorkomen en otische voorlopers direct naar haarcellen of SGN's leiden, zullen helpen de veiligheid en effectiviteit van vervangingstherapieën te verbeteren. 
Tijdens de ontwikkeling begint het binnenoor met het verdikken van het oppervlakte ectoderm in een beperkt gebied tussen rhombomeren 5 en 6 om de otische placode te worden. Terwijl de otische placode invagineert om een otische beker te vormen, geeft een verzameling cellen in het voorste gebied van de otische beker aanleiding tot het neural-sensorisch-competente domein (NSD), dat voorlopers bevat van haarcellen en neuronen van het binnenoor18. Bestmmingsonderzoek van muis, kip en zebravis ontwikkelende binnenoor suggereren meerdere populaties van neurosensorische voorlopers die aanleiding geven tot de sensorische haarcellen, omringende ondersteunende cellen en otische neuronen19-22. Het high mobility group transcriptiefactor, Sox2, is betrokken bij sensorische celspecificatie en wordt gebruikt als een marker voor binnenoor voorlopers23,24. Hypomorfe mutaties die de Sox2 expressieniveaus in het binnenoor verlagen, resulteren in het verlies van de haarcellen, ondersteunende cellen en SGN's in de cochlea25,26. 
Om otische voorlopercellen te bestuderen die celbestemmingsbeslissingen ondergaan, werd eerder een bestemmingsbeperkte geïmmortaliseerde multipotente otische voorloper (iMOP) cellijn van Sox2-uitdrukkende cochleaire voorlopers gevestigd. iMOP cellen werden oorspronkelijk afgeleid van embryonale E12.5-13.5 cochlea en geïnfecteerd met een c-Myc retrovirus27. iMOP cellen kunnen continu prolifereren als kolonievormingscellen die bekend staan als otosferen en hebben de capaciteit om te differentiëren in haarcellen, ondersteunende cellen en SGN's27. Het begrijpen van de capaciteit van iMOP cellen om te differentiëren in verschillende otische lijnen, maakt de toepassing van deze bevindingen mogelijk om efficiënt iPSC of ESC-afgeleide haarcellen en SGN's te genereren. Efficiënte differentiatieprotocollen zullen nieuwe wegen openen voor celvervangingstherapieën van binnenoorziekten die ongevoelig zijn voor conventionele behandelingen. Een cruciale kwestie bij het genereren van otische cellen door in vitro celkweek is om differentiatiemarkeringen te hebben die helpen bepalen of cellen zich aan het differentiëren zijn. Cdkn1b (p27KIP) is uitgebreid gebruikt als een vroege marker voor differentiatie in het zich ontwikkelende binnenoor, echter, is de expressie van Cdkn1b in iMOP cellen en hoe het correleert met differentiatie niet behandeld. In deze studie worden de huidige kweekcondities en hoe Cdkn1b expressie correleert met andere markeringen van iMOP differentiatie beschreven.

```html
<table>
 <tbody>
 <tr>
 <td>CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers</td>
 <td>BioCision</td>
 <td>BCS-405</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cryogenic Vials (2 ml)</td>
 <td>Corning</td>
 <td>430654</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>72230-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM/F12</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>11320-082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal Medium</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>21103</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10010-023</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14025-092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B27 Supplement (50X) Serum Free</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>17504-044</td>
 <td>Opgeslagen als 1 ml aliquoten</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamine(200 mM)</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>25030-081</td>
 <td>Opgeslagen als 5 ml aliquoten</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Natural Mouse Laminin</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>23017-015</td>
 <td>Opgeslagen als 1 mg/ml aliquoten</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>C10337</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Synth-A-Freeze Cryopreservation Media</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>A12542-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Prolong Gold Antifade Mountant</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>47743-736</td>
 <td>Opgeslagen als 10 mg/ml 100 µl aliquoten</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moxi Z Mini Automated Cell Counter</td>
 <td>Orflo</td>
 <td>MXZ001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moxi Z Cassette Type S</td>
 <td>Orflo</td>
 <td>MXC002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF)</td>
 <td>Peprotech</td>
 <td>450-33</td>
 <td>Opnieuw gesuspendeerd in 0,1% BSA in H20 en opgeslagen als 20 mg/ml aliquoten</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-Lysine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7886</td>
 <td>Opnieuw gesuspendeerd in 1X PBS en opgeslagen als 10 mg/ml 100 µl aliquoten</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Carbenicillin, Disodium Salt</td>
 <td>Thermo Fisher Scientific</td>
 <td>BP2648-1</td>
 <td>Opnieuw gesuspendeerd in 10 mM Hepes pH 7.4 en opgeslagen als 100 mg/ml aliquoten</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml pipet individueel verpakt paperback (200/doos)</td>
 <td>Thermo Fisher Scientific</td>
 <td>1367811D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml pipet individueel verpakt paperback (200/doos)</td>
 <td>Thermo Fisher Scientific</td>
 <td>1367811E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate</td>
 <td>Thermo Fisher Scientific</td>
 <td>130188</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate</td>
 <td>Thermo Fisher Scientific</td>
 <td>130184</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue Culture Treated 6 cm Dish</td>
 <td>Thermo Fisher Scientific</td>
 <td>130181</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 µm</td>
 <td>Thermo Fisher Scientific</td>
 <td>SLGV033RS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 µl verlengde filtertip</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>1120-3810</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TipOne filter pipet tips 1 - 20 µl filtertip</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>1120-1810</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TipOne filter pipet tips 1 - 200 µl filtertip</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>1120-8810</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TipOne filter pipet tips 101 - 1000 µl filtertip</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>1126-7810</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml conische buizen steriele 20 zakken van 25 buizen (500 buizen)</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>1475-0511</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml conische buizen steriele 20 zakken van 25 buizen (500 buizen)</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>1500-1211</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
```

initiëren differentiatie in onsterfelijk multipotent otic progenitor cellen

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Het gebruik van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) of embryonale stamcellen (ESC) voor celvervangende therapieën belooft veel. Verschillende beperkingen, waaronder lage opbrengsten en heterogene populaties van gedifferentieerde cellen, belemmeren de voortgang van stamceltherapieën. Een bestemd geïmmortaliseerde multipotente otische voorloperceellijn (iMOP) werd gegenereerd om de efficiënte differentiatie van grote aantallen functionele haarcellen en spiraalganglionneuronen (SGN) voor binnenoorcelvervangende therapieën te vergemakkelijken. Uitgaande van gedissocieerde culturen van enkele iMOP-cellen, werden protocollen beschreven die celcyclusexit en differentiatie bevorderen door terugtrekking van basic fibroblast growth factor (bFGF). Een significante afname van proliferende cellen na bFGF-terugtrekking werd bevestigd met behulp van een EdU-celproliferatie-assay. Tegelijkertijd met een afname in proliferatie, resulteerde succesvolle differentiatie in expressie van moleculaire markers en morfologische veranderingen. Immunokleuring van Cdkn1b (p27KIP) en Cdh1 (E-cadherine) in iMOP-afgeleide otospheren werd gebruikt als indicator voor differentiatie in binnenoorzintuiggebiedsepitheel, terwijl immunokleuring van Cdkn1b en Tubb3 (neuronaal β-tubuline) werd gebruikt om iMOP-afgeleide neuronen te identificeren. Het gebruik van iMOP-cellen biedt een belangrijk hulpmiddel voor het begrijpen van celbestemmingsbeslissingen gemaakt door binnenoorneurosensorische voorlopers en zal helpen bij het ontwikkelen van protocollen voor het genereren van grote aantallen iPSC- of ESC-afgeleide haarcellen en SGN's. Deze methoden zullen de inspanningen versnellen voor het genereren van otische cellen voor vervangende therapieën.

bFGF Intrekking Verlaagt Proliferatie in IMOP Cellen Om het proliferatieve vermogen van cellen iMOP verminderen en leiden iMOP differentiatie van cellen, werd bFGF uit de kweken genomen. Om te bevestigen dat groeifactor terugtrekking vermindert proliferatie, werd Edu incorporatie werkzaam als proliferatietest. Het percentage cellen die EDE overgenomen uit otospheres gekweekt met iMOP kweekmedia (bevattende bFG...

De huidige protocollen om geïmmortaliseerde multipotente otische voorlopercellen (iMOP) en otische differentiatie te onderhouden worden beschreven. Cultuurcondities en moleculaire markers die differentiatie naar sensorische epitheel en spiraalvormige ganglionneuronen (SGN) aangeven, worden benadrukt.

Initiëren Differentiatie in Onsterfelijk Multipotent Otic Progenitor Cellen

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Het algemene doel van deze procedure is om geïmmortaliseerde multipotente otische voorlopercellen te differentiëren in cellen van het binnenoor. Dus deze methode kan ons helpen sleutelvragen over auditieve regeneratie aan te pakken, zoals hoe otische voorlopers zich kunnen ontwikkelen tot haarcellen van de cochlea of auditieve neuronen. Belangrijk is dat deze techniek een in-vitro cellulair systeem biedt dat parallel kan worden gebruikt met in-vivo zoogdiermodelsystemen.Het demonstreren van de procedure vandaag zal worden gedaan door Azadeh Jadali, een postdoctoraal onderzoeker in mijn lab, evenals Zhichao Song en Alejandra Laureano, twee afgestudeerde studenten in het lab. Na het bereiden van het kweekmedium zoals beschreven in het tekstprotocol, gebruik drie milliliters van deze vloeistof om een keer tien tot de zesde geïmmortaliseerde multipotente voorloper, of IMOP-cellen, in een 60 millimeter weefselkweekschaal te plaatsen. Incubeer de cellen gedurende vijf tot zeven dagen bij 37 graden Celsius met vijf procent koolstofdioxide.Elke dag twee keer verdubbel het volume vloeistof in de kweek door vers medium toe te voegen. Om de cellen te passeren, draag ze eerst over van de kweekschaal naar een 15 milliliter conische buis. Plaats vervolgens de buis, bij 37 graden Celsius, gedurende vijf tot tien minuten.Gedurende deze tijd, verwacht dat colonievormende otospheren zich verzamelen op de bodem van de conische via zwaartekrachtsedimentatie. Aspeer vervolgens de supernatant, wees voorzichtig om de palet niet te verstoren. Resuspendeer de otospheren door 0,5 milliliter van eerder voorbereide, voorverwarmde, een millimolaire EDTA versterkte gebalanceerde zout oplossing of HBSS toe te voegen, en pipet vervolgens twee tot drie keer op en neer.Om de dissociatie van otospheren in enkele cellen te vergemakkelijken, plaats de conische in een incubator bij 37 graden Celsius. Periodiek slinger de oplossing en wanneer er geen otospheren meer worden waargenomen als sediment op de bodem van de buis, verplaats deze naar kamertemperatuur. Ga verder met het toevoegen van twee milliliter kweekmedium aan de cellen om de EDTA te neutraliseren.En centrifugeer ze bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten bij 200 g. Aspeer vervolgens de verdunde EDTA-oplossing en was de cellen in vijf milliliter 1x PBS. Na het draaien van de cellen met dezelfde instellingen, aspeer de 1x PBS.Voeg vervolgens 0,5 milliliter kweekmedium toe aan de conische. En resuspendeer het cellenpalet. Voor het tellen, verdun IMOP-cellen een op honderd in kweekmedium.Voeg vervolgens 75 microliter van deze oplossing toe aan een cassette gepositioneerd in een microfluïdische deeltjesteller en bepaal het aantal cellen. Daarna, plaats een keer tien tot de zesde IMOP-cellen in een 60 millimeter weefselkweekschaal zoals eerder beschreven en herhaal deze passageprocedure elke vijf tot zeven dagen. Drie dagen na het plateren, gebruik zwaartekrachtsedimentatie om otospheren te verzamelen zoals eerder getoond.Ga verder met het aspeeren van de supernatant. En resuspendeer de cellen voorzichtig in twee milliliter sensorisch epitheeldifferentiatiemedium. Gebruik vervolgens een tien milliliter grote porie pipet om de otospheren over te brengen naar een nieuwe 60 millimeter schaal.Differentieer de otospheren gedurende tien dagen. Voeg elke dag twee milliliter vers differentiatiemedium toe aan de kweek. Daarna, oogst de otospheren opnieuw door zwaartekrachtsedimentatie.En aspeer het gebruikte medium. Fixeer vervolgens de otospheren in vier procent paraformaldehyde in 1x PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de formaldehydeoplossing en was de cellen in 1x PBS met 0,1 procent Triton x100.Ga verder door de otospheren te blokkeren in 1x PBS aangevuld met tien procent geitenserum en 0,1 procent Triton x100. Na een uur, vervang de blokkeringsbuffer met die welke de juiste verdunning van Cdkn1b of CDH1-antilichaam bevat. Incubeer vervolgens de cellen in primaire antilichaam gedurende de nacht bij vier graden Celsius.En de volgende dag ga je verder met immunokleuring met behulp van fluorescentiegelabelde secundaire antilichamen, Phalloidin en Hoechst, zoals elders beschreven. Om voorbereid te zijn op beeldvorming, plaats montagemedium op een glazen dia. En introduceer vervolgens de gekleurde otospheren in het medium.Leg vervolgens een deksel op het monster. Laat het montagemedium overnacht bij vier graden Celsius drogen en plaats de dia vervolgens op het podium van een omgekeerd microscoop uitgerust met een 16-bits CCD-camera. Gebruik de 20x 0,75 luchtlens om epifluorescentiebeelden te verkrijgen door gegevens te verzamelen van de blauwe, groene, rode en infrarode kanalen.Reinig eerst ronde glazen deksels door ze in een steriele 100 millimeter plaat te plaatsen en ze onder te dompelen in 70 procent ethanol. Schud voorzichtig de deksels om ervoor te zorgen dat ze bedekt zijn en laat de schaal gedurende tien minuten op kamertemperatuur staan. Spoel vervolgens de deksels drie keer in steriele 1x PBS en vervolgens eenmaal in steriel water.Laat vervolgens de deksels drogen door ze 15 minuten bloot te stellen aan UV-licht in een weefselkweekkast. Voor onmiddellijk gebruik, plaats een steriele deksel in elk putje van een 24-putjesplaat. Schud voorzichtig de plaat om ervoor te zorgen dat alle deksels plat liggen.Bekleed vervolgens de deksels door 0,25 milliliter 1x PBS met 10 microgram per milliliter poly D lysine toe te voegen aan elk putje. Nadat de plaat gedurende een uur bij 37 graden Celsius is geïncubeerd, verwijder de poly D lysine-oplossing en was de putjes drie keer met steriele 1x PBS. Zodra de vloeistof van de laatste was is aspeerd, introduceer 0,25 milliliter 1x PBS met 10 microgram per milliliter Laminine in elk van de 24 putjes.Na het incuberen van de plaat overnacht bij 37 graden Celsius, aspeer de Laminine-oplossing, was ver

initiating-differentiation-immortalized-multipotent-otic-progenitor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Beschrijven we een klein molecuul-gebaseerd protocol voor de differentiatie van muis embryonale stamcellen in de oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's). Dit protocol genereert Olig2 + NG2 + OPC's met een hoge efficiëntie met 30 dagen van differentiatie. We beschrijven ook een methode om "spike" OPC's die kunnen vuren actiepotentialen genereren.

Differentiatie van embryonale stamcellen in de oligodendrocyt Voorlopers

Primaire, menselijke foetale hersenen-afgeleide, multipotentiële progenitorcellen...

Progenitor afgeleide oligodendrocyt Cultuur System van menselijke foetale hersenen

This video demonstrates the differentiation of human embryonic stem cells, or hESCs, directly into neural progenitor cells without using feeder cells or any intermediate steps. The selective inhibition of bone morphogenetic protein or BMP and transforming growth factor-beta, or TGF-β, signaling pathways leads to hESCs differentiation into neural progenitor cells, or NPCs.

Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Neural Progenitors

This video demonstrates the process of generating oligodendrocyte precursor cells (OPCs) from human embryonic stem cells, followed by the maturation of OPCs to oligodendrocytes. This process of generating oligodendrocytes opens numerous avenues to improve research and treatment of neurodegenerative diseases, including Alzheimer's.

Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Oligodendrocytes

This video demonstrates the establishment of a co-culture of human induced neurons (iNs) and induced oligodendrocyte precursor cells (iOPCs). iNs are mixed with iOPCs in a co-culture and then incubated to support the maturation of both iNs into neurons and iOPCs into oligodendrocytes. Neurons form synaptic connections with other neurons and oligodendrocytes, while oligodendrocytes develop myelin sheaths around the neurons' axons.

A Co-culture Method to Model Neuron-Oligodendrocyte Interactions

This video demonstrates the differentiation of immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells into sensory epithelial cells. It outlines the steps involved in culturing iMOP cells, forming otospheres, inducing differentiation, and visualizing cellular components and differentiation markers through fluorescence microscopy to confirm successful cell differentiation.

Differentiating Otic Progenitor Cells Into Sensory Epithelial Cells Followed by Immunostaining

The video demonstrates the differentiation of immortalized multipotent otic progenitors (iMOPs) into spiral ganglion neurons (SGNs) and immunofluorescence-based confirmation of the differentiation. The iMOPs are plated onto culture substrate-coated coverslips in a neuronal differentiation medium for differentiation into SGNs. The differentiated cells are labeled with antibodies specific for neuronal differentiation markers and analyzed under a microscope to confirm differentiation.

Differentiating Immortalized Multipotent Otic Progenitors into Spiral Ganglion Neurons and Evaluating the Differentiation

In de afgelopen jaren de vorming van kiemcellen middels in vitro kweekmethoden is aangetoond met behulp van verschillende soorten van somatische stamcellen. Dit artikel zal visueel presenteren de differentiatie van pasgeboren muizen afgeleide stamcellen om vroeg eicel-achtige cellen.

Differentiatie van pasgeboren muis Skin afgeleide stamcellen in Germ-achtige cellen<em&gt; In vitro</em

Het protocol presenteert de herprogrammering van perifere bloed mononucleaire cellen voor het opwekken van neurale stamcellen door Sendai virus infectie, differentiatie van iNSCs in Dopaminerge neuronen, transplantatie van de voorlopers van de DA in de eenzijdig-lesioned De ziekte van Parkinson, en de evaluatie van de veiligheid en werkzaamheid van de in de SC afgeleide DA-precursoren voor PD-behandeling.

Generatie van geïnduceerde neurale stamcellen uit perifere mononucleaire cellen en differentiatie naar precursoren voor Dopaminerge neuron voor transplantatie studies

De neuron-gliale interacties bij neurodegeneratie worden niet goed begrepen als gevolg van ontoereikende hulpmiddelen en methoden. Hier beschrijven we geoptimaliseerde protocollen om geïnduceerde neuronen, oligodendrocytenvoorlopercellen en oligodendrocyten te verkrijgen uit menselijke pluripotente stamcellen en geven we voorbeelden van de waarden van deze methoden bij het begrijpen van celtypespecifieke bijdragen bij de ziekte van Alzheimer.

Generatie van menselijke neuronen en oligodendrocyten uit pluripotente stamcellen voor het modelleren van neuron-oligodendrocyteninteracties

Dit protocol presenteert de differentiatie van humane osteoclasten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en beschrijft methoden voor de karakterisering van osteoclasten en osteoclastprecursoren.

Differentiatie en karakterisering van osteoclasten van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Leer het differentiëren van iMOP-cellen naar binnenoorceltypen voor auditieve regeneratie. Deze methode helpt onderzoekers om cochleaire haarcellen en auditieve neuronen te ontwikkelen.

Initiëren Differentiatie in Onsterfelijk Multipotent Otic Progenitor Cellen

Meer video's verkennen