Initiëren Differentiatie in Onsterfelijk Multipotent Otic Progenitor Cellen

Het algemene doel van deze procedure is om geïmmortaliseerde multipotente otische voorlopercellen te differentiëren in cellen van het binnenoor. Dus deze methode kan ons helpen sleutelvragen over auditieve regeneratie aan te pakken, zoals hoe otische voorlopers zich kunnen ontwikkelen tot haarcellen van de cochlea of auditieve neuronen. Belangrijk is dat deze techniek een in-vitro cellulair systeem biedt dat parallel kan worden gebruikt met in-vivo zoogdiermodelsystemen.

Het demonstreren van de procedure vandaag zal worden gedaan door Azadeh Jadali, een postdoctoraal onderzoeker in mijn lab, evenals Zhichao Song en Alejandra Laureano, twee afgestudeerde studenten in het lab. Na het bereiden van het kweekmedium zoals beschreven in het tekstprotocol, gebruik drie milliliters van deze vloeistof om een keer tien tot de zesde geïmmortaliseerde multipotente voorloper, of IMOP-cellen, in een 60 millimeter weefselkweekschaal te plaatsen. Incubeer de cellen gedurende vijf tot zeven dagen bij 37 graden Celsius met vijf procent koolstofdioxide.

Elke dag twee keer verdubbel het volume vloeistof in de kweek door vers medium toe te voegen. Om de cellen te passeren, draag ze eerst over van de kweekschaal naar een 15 milliliter conische buis. Plaats vervolgens de buis, bij 37 graden Celsius, gedurende vijf tot tien minuten.

Gedurende deze tijd, verwacht dat colonievormende otospheren zich verzamelen op de bodem van de conische via zwaartekrachtsedimentatie. Aspeer vervolgens de supernatant, wees voorzichtig om de palet niet te verstoren. Resuspendeer de otospheren door 0,5 milliliter van eerder voorbereide, voorverwarmde, een millimolaire EDTA versterkte gebalanceerde zout oplossing of HBSS toe te voegen, en pipet vervolgens twee tot drie keer op en neer.

Om de dissociatie van otospheren in enkele cellen te vergemakkelijken, plaats de conische in een incubator bij 37 graden Celsius. Periodiek slinger de oplossing en wanneer er geen otospheren meer worden waargenomen als sediment op de bodem van de buis, verplaats deze naar kamertemperatuur. Ga verder met het toevoegen van twee milliliter kweekmedium aan de cellen om de EDTA te neutraliseren.

En centrifugeer ze bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten bij 200 g. Aspeer vervolgens de verdunde EDTA-oplossing en was de cellen in vijf milliliter 1x PBS. Na het draaien van de cellen met dezelfde instellingen, aspeer de 1x PBS.

Voeg vervolgens 0,5 milliliter kweekmedium toe aan de conische. En resuspendeer het cellenpalet. Voor het tellen, verdun IMOP-cellen een op honderd in kweekmedium.

Voeg vervolgens 75 microliter van deze oplossing toe aan een cassette gepositioneerd in een microfluïdische deeltjesteller en bepaal het aantal cellen. Daarna, plaats een keer tien tot de zesde IMOP-cellen in een 60 millimeter weefselkweekschaal zoals eerder beschreven en herhaal deze passageprocedure elke vijf tot zeven dagen. Drie dagen na het plateren, gebruik zwaartekrachtsedimentatie om otospheren te verzamelen zoals eerder getoond.

Ga verder met het aspeeren van de supernatant. En resuspendeer de cellen voorzichtig in twee milliliter sensorisch epitheeldifferentiatiemedium. Gebruik vervolgens een tien milliliter grote porie pipet om de otospheren over te brengen naar een nieuwe 60 millimeter schaal.

Differentieer de otospheren gedurende tien dagen. Voeg elke dag twee milliliter vers differentiatiemedium toe aan de kweek. Daarna, oogst de otospheren opnieuw door zwaartekrachtsedimentatie.

En aspeer het gebruikte medium. Fixeer vervolgens de otospheren in vier procent paraformaldehyde in 1x PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de formaldehydeoplossing en was de cellen in 1x PBS met 0,1 procent Triton x100.

Ga verder door de otospheren te blokkeren in 1x PBS aangevuld met tien procent geitenserum en 0,1 procent Triton x100. Na een uur, vervang de blokkeringsbuffer met die welke de juiste verdunning van Cdkn1b of CDH1-antilichaam bevat. Incubeer vervolgens de cellen in primaire antilichaam gedurende de nacht bij vier graden Celsius.

En de volgende dag ga je verder met immunokleuring met behulp van fluorescentiegelabelde secundaire antilichamen, Phalloidin en Hoechst, zoals elders beschreven. Om voorbereid te zijn op beeldvorming, plaats montagemedium op een glazen dia. En introduceer vervolgens de gekleurde otospheren in het medium.

Leg vervolgens een deksel op het monster. Laat het montagemedium overnacht bij vier graden Celsius drogen en plaats de dia vervolgens op het podium van een omgekeerd microscoop uitgerust met een 16-bits CCD-camera. Gebruik de 20x 0,75 luchtlens om epifluorescentiebeelden te verkrijgen door gegevens te verzamelen van de blauwe, groene, rode en infrarode kanalen.

Reinig eerst ronde glazen deksels door ze in een steriele 100 millimeter plaat te plaatsen en ze onder te dompelen in 70 procent ethanol. Schud voorzichtig de deksels om ervoor te zorgen dat ze bedekt zijn en laat de schaal gedurende tien minuten op kamertemperatuur staan. Spoel vervolgens de deksels drie keer in steriele 1x PBS en vervolgens eenmaal in steriel water.

Laat vervolgens de deksels drogen door ze 15 minuten bloot te stellen aan UV-licht in een weefselkweekkast. Voor onmiddellijk gebruik, plaats een steriele deksel in elk putje van een 24-putjesplaat. Schud voorzichtig de plaat om ervoor te zorgen dat alle deksels plat liggen.

Bekleed vervolgens de deksels door 0,25 milliliter 1x PBS met 10 microgram per milliliter poly D lysine toe te voegen aan elk putje. Nadat de plaat gedurende een uur bij 37 graden Celsius is geïncubeerd, verwijder de poly D lysine-oplossing en was de putjes drie keer met steriele 1x PBS. Zodra de vloeistof van de laatste was is aspeerd, introduceer 0,25 milliliter 1x PBS met 10 microgram per milliliter Laminine in elk van de 24 putjes.

Na het incuberen van de plaat overnacht bij 37 graden Celsius, aspeer de Laminine-oplossing, was ver