Name: Toedienen en het detecteren van eiwit Marks op Insecten voor Verspreiding Onderzoek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Leer hoe u insecten markeert met eiwitten voor verspreidingsonderzoek en deze detecteert met ELISA-technieken. Deze eenvoudige, kosteneffectieve methode maakt het mogelijk om migratiepatronen en de verspreiding van invasieve soorten te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiering werd verstrekt door USDA CRIS 5347-22620-021-00D en, gedeeltelijk, door de Landbouw en Voedselvoorziening Research Initiative Competitive Grant niet. 2011-67009-30141 van de USDA Nationaal Instituut voor Voedsel en Landbouw. We zijn dankbaar voor de technische ondersteuning van Johanna Nassif. We danken ook Paul Baker, David Horton, Diego Nieto en Frances Sivakoff voor het verstrekken van een aantal van de foto&#39;s die in figuur 3.

1. Interne Mark Retention en Detection Procedure <ol><li> Interne markeringsprocedure <ol><li> Verzamel insecten van belang (n ≈ 100 personen) van een laboratorium kolonie gekweekt op een kunstmatig dieet of uit het veld en te verdelen in twee schone opfok containers. </li><li> Plaats een regelmatige 20 ml voeding packet (alleen negatieve controlebehandeling) in een van de containers. Aanvulling op een tweede 20 ml kunstmatige voeding pakket met 1,0 ml van een 1,0 mg / ml kip IgG / IgY oplossing, meng goed, en plaats deze in de andere container. Opmerking: Als het insect van belang niet over een kunstmatige voeding, kan het merk op of in welke voeding ze normaal opgelopen op (bijvoorbeeld, groene bonen, mot eieren, water, suiker, honing) worden geplaatst. </li><li> Laat de insecten om hun voedselopname te hervatten voor 24 uur. </li></ol></li><li> Interne mark retentie procedure <ol><li> Verwijder de voeding pakketten van elke container en leveren de insecten wi andere voedselbron om erachter staan ​​over de duur van het experiment (bijvoorbeeld groene bonen). </li><li> Verzamel een cohort (n = 20) insecten per dag (of op elk gewenst tijdsinterval) van elke behandeling en onmiddellijk bij -20 ° C te bevriezen. </li></ol></li><li> Sandwich ELISA-procedure <ol><li> Voeg 50 ul van konijn anti-kippen IgY primair antilichaam verdund 1: 500 in Tris gebufferde zoutoplossing (TBS) aan elk putje van een schone ELISA microplaat en incuberen gedurende ten minste 1 uur bij RT (noot: de microplaten kan ook worden geïncubeerd O / N bij 4 ° C). </li><li> Gooi het antilichaam van de plaat en blok elk putje met 300 ul van een 1,0% vetvrije droge melk oplossing gedurende 30 min. </li><li> Tijdens het wachten op de vorige incubatie stappen, plaatst bevroren insecten individueel in 1,6 ml microcentrifuge buizen met 1,0 ml TBS. </li><li> Grind elk insect met een schone stamper totdat grondig gehomogeniseerd en voeg 100 ul van elk monster aan een individu en van de ELISAbord. Laat de monsters geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Voeg 100 ul negatieve (alleen TBS) en positieve (eiwit in TBS) controles aan putjes in de eerste kolom van elke ELISA-plaat. Ook, voeg 100 pl negatieve controles insect (alleen insecten) naar de 8 putjes in de laatste kolom van elke plaat (Figuur 1). Laat de controlemonsters te incuberen bij kamertemperatuur 1 uur. Merk op dat de sjabloon in figuur 1 is de template wij want ons standaard assays. De plaatsing van de monsters in de putjes is aan het oordeel van de onderzoeker. </li><li> Was elk putje drie maal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) -tween en voeg 50 ul van konijn anti-kip IgG / IgY geconjugeerd met mierikswortelperoxidase verdund 1: 10.000 in 1% melk-oplossing en incubeer gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Was elk putje drie keer met PBS-Tween en voeg 50 pl tetramethylbenzidine (TMB) substraat aan elke well. </li><li> Na 10 min, lees de putjesmet een microplaat spectrofotometer ingesteld op een golflengte van 650 nm. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> Figuur 1 een schematisch diagram toont de genormaliseerde goed benaming voor een typische 96 gats ELISA microtiterplaat. Elke plaat bevat 7 putjes gewijd aan Tris-gebufferde zoutoplossing negatieve controles (TBS), een goed gewijd aan een positieve controle proteïne (Pos Ctrl), 80 individuele putten gewijd aan heroverde insecten (Monster 1 ... 80), en 8 putten gewijd aan ongemarkeerde (negatieve) insect controles (Neg Ctrl 1 ... 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 2. Externe Mark, retentie en Detection Procedure <ol><li> Externe kentekens procedure <ol><li> Verzamel insecten van belang (n ≈ 100individuen) uit een laboratorium kolonie of van het veld en plaats in twee 1,0 L plastic containers met een 2,5 cm diameter geperforeerd uit de zijkant van elke container. </li><li> Spuit de insecten in de eerste houder met 1,0 ml dH 2 O (negatieve controlebehandeling) met een medische verstuiver. Spuit de insecten in de tweede houder met 1,0 ml van een 5,0% oplossing van kippen eiwit met een medische verstuiver. </li><li> Bevestig de slang van de vernevelaar op een standaard laboratorium luchtuitlaat en vervolgens de monding van de vernevelaar in de 2,5 cm opening van de houder. Schakel vervolgens de luchtuitlaat langzaam tot de vernevelaar produceert een damp. </li><li> Blijven spuiten (markering) tot het eiwit oplossing is afgegeven (ong. 2-5 min). </li><li> Verwijder de vernevelaar en plaats een kurk in het gat van de plastic container. Laat de insecten bij kamertemperatuur staan ​​totdat de oplossing volledig droog. </li></ol></li><li> Externe merk retentie procedure<ol><li> Plaats elke behandeling van droge insecten in een andere schone fokken container latere blootstelling aan de markering te voorkomen. </li><li> Voedsel en water toe te voegen aan de schone containers om de insecten te houden over de duur van de studie. </li><li> Verzamel een cohort (n = 20) van insecten van elke behandeling dagelijks en onmiddellijk bij -20 ° C te bevriezen. </li></ol></li><li> Indirecte ELISA-procedure <ol><li> Plaats de bevroren insecten afzonderlijk in 1,6 ml microcentrifugebuisjes en voeg 1,0 ml TBS. </li><li> Week de monsters gedurende 1 uur op een rondschudapparaat ingesteld op 120 rpm. </li><li> Voeg negatieve en positieve controles, zoals beschreven in stap 1.3.5. </li><li> Na het weken, Pipetteer 100 ul aliquot van elk monster in een van de 80 aangeduide monster putjes op een nieuwe 96 gats ELISA platen zoals getoond in figuur 1 Laat de monsters te incuberen gedurende 1 uur bij RT (noot:. De microplaten kan ook geïncubeerd O / N bij 4 ° C). </li><li> Was de putjes drie maal metPBS-Tween en voeg 300 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing met 1% runderserumalbumine (PBS-BSA) aan elk putje. </li><li> Na 30 minuten bij kamertemperatuur twee keer wassen met PBS-Tween. </li><li> Voeg 50 ul van konijn-anti-ovalbumine primair antilichaam verdund 1: 8000 in PBS-BSA-Silwet (0,05%) aan elk putje en incubeer gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Was elk putje drie keer met PBS-Tween en voeg 50 pl geit anti-konijn IgG geconjugeerd met mierikswortel peroxidase verdund 1: 2000 in PBS-BSA-Silwet (0,05%) gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Was elk putje drie keer met PBS-Tween en voeg 50 ul van TMB substraat aan elke well. </li><li> Na 10 min, lees de putjes van een microplaat spectrofotometer ingesteld op een golflengte van 650 nm. </li></ol></li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Bereken de gemiddelde absorptie waarde van de 8 negatieve controle insecten op elke ELISA-plaat en berekent vervolgens de standaarddeviatie op basis van de gepoolde negatieve controles weerm alle ELISA-platen van een bepaalde studie 12. </li><li> Voeg zesmaal de gepoolde standaarddeviatie van het gemiddelde resultaat voor elke ELISA-plaat met een ELISA positieve drempelwaarde te verkrijgen. Elke insect monster waarbij een absorptie die gelijk is aan of groter is dan deze waarde wordt als positief voor de aanwezigheid van het eiwit merk is. </li></ol>

Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie is uitsluitend voor het verstrekken van specifieke informatie en impliceert geen aanbeveling of goedkeuring van het Amerikaanse ministerie van Landbouw. USDA is een gelijke kans provider en werkgever.

De geleedpotigen eiwit immunomarking procedure werd voor het eerst beschreven bijna een kwart eeuw geleden 9. Sindsdien is de procedure aangepast aan de verspreiding patronen van een breed scala van geleedpotigen met behulp van zowel intern als extern beheerd IgG / IgYs bestuderen. Deze eiwitten zijn standvastig markers gebleken voor uiteenlopende insectensoorten tot nu toe getest. Zoals hierboven genoemd, de belangrijkste beperking voor het gebruik van IgG / IgYs is dat ze erg duur. Bijgevolg IgG / IgYs zijn...

Het volgen van de beweging van atropodenplagen, natuurlijke vijanden (parasieten en predatoren) en bestuivers in de natuur is van essentieel belang voor een beter begrip hoe de ecosysteemdiensten te verbeteren. De belangrijkste component voor de meeste dispersie onderzoek is een betrouwbare methode om de geleedpotigen (s) van belang coderen. Een verscheidenheid van materialen (bijvoorbeeld verven, kleurstoffen, gekleurde stof, markeringen, zeldzame elementen, eiwitten) zijn gebruikt om geleedpotigen markeren hun populatiedynamiek, dispersie capaciteiten beoordelen voeden gedrag en andere ecologische interacties 1,2. De geschiktheid van een merker voor een bepaalde spreiding onderzoek afhankelijk van het type studie uitgevoerd zijn. Er zijn drie grote indelingen voor het markeren van geleedpotigen: (1) mark-afgifte herovering (MRR), (2) mark-capture, en (3) self-mark-capture. Voor mark-afgifte herovering onderzoek, de onderzoeker markeert meestal de geleedpotigen collectief in het laboratory en vrijgeeft op een centraal punt in het veld. De geleedpotigen worden vervolgens heroverd op verschillende ruimtelijke en temporele intervallen met behulp van verschillende inrichtingen (bijv sweep net, vacuüm, vangplaat) 3,4,5. De heroverd monsters worden vervolgens onderzocht op het specifieke merk te onderscheiden vrijgelaten uit inheemse individuen. Voor mark-capture onderzoek, de onderzoeker geldt meestal het merk direct in het veld met behulp van spuitapparatuur (bv rugzak sproeier, giek en nozzle spuit). De beste markers voor mark-capture onderzoek zijn goedkoop en gemakkelijk aan te brengen op de habitat van de geleedpotigen&#39;s. Voor self-mark-capture onderzoek, de onderzoeker geldt meestal merken een geleedpotigen aas 6,7 of nestingang 8. Op zijn beurt, de geleedpotigen markeert zelf intern door het verslinden van de gemarkeerde aas of extern door &quot;borstelen&quot; tegen de mark zodra ze uit het nest. Zoals hierboven vermeld, zijn vele soorten markers ons geweested van verschillende geleedpotigen taggen. Echter, weinig bruikbaar voor alle drie de verspreiding onderzoekscategorieën. De ontwikkeling van het eiwit immunomarking procedure een grote doorbraak voor het markeren van insecten. Immunomarking zet een eiwit label geleedpotigen intern of extern die op zijn beurt wordt gedetecteerd met een anti-eiwit-specifieke enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA). De eerste dergelijke proteïne markers gebruikt waren konijn immunoglobuline (IgG) en kip IgG / IgY 9,10. Ze bleek te zijn zeer effectief punten voor MRR en zelf-mark-capture onderzoek (zie bespreking). Helaas, IgG / IgY eiwitten zijn duur en daarom niet praktisch voor mark-capture onderzoek en de meeste vormen van self-mark-capture onderzoek. Vervolgens werden de tweede generatie eiwitdetectie ELISA&#39;s ontwikkeld voor de eiwitten die in kip eiwit (albumine), koemelk (caseïne) en sojamelk (trypsineremmer eiwit). Elke test is zeer gevoelig, specifiek en,Belangrijker gebruikt eiwitten die veel goedkoper zijn dan de IgG / IgY eiwitten 11 zijn. Deze eiwitten zijn effectief voor MRR, mark-capture, en zelf-mark-capture onderzoek (zie bespreking) bewezen. In dit artikel beschrijven we en demonstreren hoe eiwitten merk retentie laboratorium studies uit te voeren. Dergelijke onderzoeken zijn de eerste fase van het onderzoek voor elk type veld dispersie studie. Specifiek, is het essentieel dat de onderzoekers weten hoe lang de markering op de beoogde geleedpotigen worden gehandhaafd dan het opstarten van veld dispersie studies. Hier beschrijven we en laten zien hoe je intern en extern te markeren insecten voor MRR, mark-capture, en zelf-mark-capture veld type studies. Vervolgens hebben we laten zien hoe de aanwezigheid van de merken op te sporen met indirecte en sandwich ELISA.

<table><tbody><tr><td>Food storage container (for insect rearing)</td><td>Rubbermaid/Tupperware</td><td>Various sizes</td><td>Various manufacturers &amp; vendors. Mesh fabric is glued in a window</td></tr><tr><td>Small volume nebulizer (Micro Mist)</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>Beschikbaar online en in medische winkels. Andere merken werken ook.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap</td><td>Continental Lab Products</td><td>4445.X</td><td>Elke vergelijkbare soort zal werken. We geven de voorkeur aan merken met gemakkelijk te openen deksels.</td></tr><tr><td>Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid)</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>Dit ontwerp is leuk omdat het de buizen niet te druk maakt.</td></tr><tr><td>Dispenser, repeater</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Iets soortgelijks zal helpen om het doseren te versnellen.</td></tr><tr><td>Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>Beschikbaar bij verschillende leveranciers. Pestles kunnen worden schoongemaakt en geautoclaveerd voor hergebruik.</td></tr><tr><td>BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom)</td><td>BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation pipette, manual (20-200 &micro;l)</td><td>VistaLab</td><td>1057-0200 of 1070-0200</td><td>Elke vergelijkbare soort zal werken. Dit model is ergonomisch.</td></tr><tr><td>Reservoirs, sterile reagent</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>Iets soortgelijks zal werken.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 &micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td>Als u een elektronische versie moest kiezen, is dit formaat het nuttigst.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (10-300 &micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730361</td><td>Iets soortgelijks zal werken.</td></tr><tr><td>Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&nbsp;</td><td>Iets soortgelijks zal werken voor handmatig wassen van platen.</td></tr><tr><td>Microplate reader with absorbance detection</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 250</td><td>Iets soortgelijks zal werken.</td></tr><tr><td>Chicken IgG/IgY</td><td>United States Biological</td><td>I1903-15R</td><td>Ook verkrijgbaar bij andere bronnen</td></tr><tr><td>Egg whites</td><td>Grocery store</td><td>&ldquo;All Whites&rdquo;, &ldquo;Egg Beaters&rdquo;, etc.</td><td>Meng 5 ml met 95 ml dH2O voor 5% oplossing</td></tr><tr><td>Tris (Trizma Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2.42 g/L om TBS te maken</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29.22 g/L om TBS te maken en 8.0&nbsp;g&#8288;/&#8288;L voor PBS</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1.14 g/L voor PBS</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0.2 g/L voor PBS</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0.2 g/L voor PBS</td></tr><tr><td>Tween 20, EIA grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>Voeg 0.5 ml per L toe aan PBS nadat de zouten zijn opgelost.</td></tr><tr><td>PBS met 1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>Meng 1 pakket in 1 L dH2O</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Meng 100 &micro;l in 50 ml TBS</td></tr><tr><td>Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%)</td><td>Grocery store</td><td></td><td>Meng 10 g met 1 L dH2O voor 1% oplossing</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Meng 100 &micro;l in 1 L van 1% melk</td></tr><tr><td>Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>Verdun 125 &micro;l in 1 L PBS-BSA</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>Verdun 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, voeg vervolgens 1.3&nbsp;ml Silwet toe</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>Voeg als laatste ingrediënt toe</td></tr><tr><td>TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

toedienen en het detecteren van eiwit marks op insecten voor verspreiding onderzoek

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Monitoring geleedpotige beweging is vaak nodig om geassocieerd populatiedynamiek, dispersie patronen, voorkeuren waardplant, en andere ecologische interacties beter te begrijpen. Geleedpotigen worden meestal bijgehouden in de natuur door tagging ze met een uniek merk en vervolgens opnieuw verzamelen ze in de tijd en ruimte om hun verspreiding vermogen te bepalen. Naast de fysieke markeringen, bijvoorbeeld gekleurde stof of verf, verschillende soorten eiwitten hebben bewezen zeer effectief voor het markeren van geleedpotigen ecologische onderzoek. Eiwitten kunnen inwendig en / of uitwendig worden toegediend. De eiwitten kunnen vervolgens worden gedetecteerd ingehaald geleedpotigen met een proteïne-specifieke enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Hier beschrijven we protocollen voor extern als intern tagging geleedpotigen met eiwit. Twee eenvoudige experimentele voorbeelden worden gedemonstreerd: (1) een intern eiwit merk geïntroduceerd om een ​​insect door een eiwit verrijkte dieet en (2) een externe eiwit topisch een merktekenpplied een insect met een medische verstuiver. Vervolgens hebben we betrekking hebben een stap-voor-stap handleiding van de sandwich en indirecte ELISA methoden die worden gebruikt om eiwitten te merken detecteren op de insecten. In deze demonstratie worden verschillende aspecten van de overname en de detectie van eiwit markers op geleedpotigen merk afgifte-hervangst, mark-capture en soorten self-mark-capture van het onderzoek besproken, samen met de verschillende manieren waarop de immunomarking procedure is geweest aangepast om een ​​groot aantal onderzoeksdoelen passen.

Interne markering: De resultaten van de interne retentie markering proef zijn weergegeven in Figuur 2A. De berekende ELISA kritische drempelwaarde was 0,054. Algemeen (alle vier de sample data gecombineerd), de insecten behandeld zonder eiwit leverde constant laag ELISA waarden (X = 0,038 ± 0,002, n = 80). Omgekeerd alle insecten gevoed het eiwit verrijkte voeding lev...

Eiwitten worden vaak gebruikt om geleedpotigen te markeren voor verspreidingsonderzoek. Methoden voor het toedienen van interne en externe eiwitmarkeringen op geleedpotigen worden gedemonstreerd. Technieken voor het detecteren van eiwitmarkeringen, hetzij via indirecte of sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA's), worden ook geïllustreerd.

Toedienen en het detecteren van eiwit Marks op Insecten voor Verspreiding Onderzoek

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

Het algemene doel van deze demonstratie is om te beschrijven hoe insecten met eiwitten kunnen worden gemarkeerd voor verspreidings- of migratieonderzoek. In deze demonstratie zijn methoden opgenomen over hoe de markeringen kunnen worden gedetecteerd door middel van een sandwich of een indirecte enzym-gekoppelde immunosorbeertest. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van insectenverspreidingsonderzoek.Het kan worden gebruikt om insectenmigratiepatronen, insectenplantenvoorkeuren en verspreiding van invasieve soorten te bestuderen. De voordelen van deze techniek zijn dat de detectiemethode eenvoudig en goedkoop is. Geschikt voor hoge doorvoer, en de dieren kunnen gemakkelijk direct in hun natuurlijke habitat worden gemarkeerd.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen, omdat het moeilijker lijkt dan het is, omdat de meeste veldonderzoekers niet de ervaring hebben met deze eenvoudige techniek. Ik had het idee voor deze methode voor het eerst in 1989. We fokten grote oog-roofdieren op een kunstmatig dieet.We waren bang dat deze beestjes niet effectieve roofdieren zouden zijn op een Lygus-ongedierplaag nadat ze lange tijd in gevangenschap waren grootgebracht op een onnatuurlijk dieet. Met andere woorden, ze zouden gedomesticeerd zijn. We hadden een veilige, effectieve en goedkope methode nodig om ze na hun vrijlating in het veld te onderscheiden van hun inheemse tegenhangers.Geen van de huidige markeringsmethoden voldeed aan deze criteria. Een eerdere ervaring die ik had met de ELISA-procedure om predator-darminhoudanalyses voor Lygus-specifiek eiwitresten uit te voeren, gaf me het idee om een ​​vreemde eiwitvlek op de in het laboratorium gefokte predator aan te brengen. Op zijn beurt konden we de in het veld verzamelde grote oog-beestjes analyseren op Lygus-resten en op de resten van het vreemde eiwit.Verzamel om te beginnen ongeveer 100 insecten van belang uit een laboratoriumkolonie of uit het veld, en verdeel ze in twee schone kweekcontainers. Laad een container met een reguliere 20 milliliter dieetpacket, om als negatieve controle te dienen. Voor de andere, doordrenk een dieetpacket met een milligram kippen IgG-IgY.Voeg een milliliter oplossing toe en meng grondig. Gebruik indien nodig wat de insecten normaal gesproken worden gevoerd in plaats van het packet. Na 24 uur van het fokken op deze dieetpackets, voorzie beide groepen insecten van normale ongemarkeerde voeding.Verzamel op de gewenste tijdsintervallen 20 individuele insecten uit elke cohort. Vries ze in op min 20 graden Celsius, totdat alle vereiste cohorten voor het experiment zijn verzameld. Om een 96-wellplaat voor de ELISA voor te bereiden, voegt u aan elke put 50 microliters konijn anti-kippen IgY primaire antilichaam toe, verdund een op 500 in Tris-gebufferde zoutoplossing, of TBS.Laat de geladen plaat minimaal een uur bij kamertemperatuur of een nacht bij vier graden Celsius incuberen. Leg later de putten leeg en voeg 300 microliters blok-oplossing toe aan elke put. Dit is een oplossing van een procent vetvrije droge melk.Laat de plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Tijdens de blok-incubatie, brengt u individuele bevroren insecten over naar microcentrifugebuisjes die zijn geladen met een milliliter TBS. Homogeniseer vervolgens elk insect grondig met een schone stamper.Wanneer de plaat klaar is, laadt u elk putje met 100 microliters van een gehomogeniseerd insectenmonster. Elke 96-wellplaat biedt plaats aan 80 specimens. Laat de eerste en laatste kolom van de plaat leeg voor controles.Laad in de eerste kolom zeven 100 microliter aliquoten van TBS alleen, en laad een put met 100 microliters TBS met eiwit-positieve controle. Laad in de laatste kolom 100 microliters van acht individuele ongemarkeerde insectenpreparaten. Laat de monsters minimaal een uur bij kamertemperatuur incuberen.Na de incubatie, wast u de putten voorzichtig drie keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing Tween, of PBS-Tween. Uit onze ervaring hebben we geleerd dat de meeste fouten optreden tijdens de wasstappen. Spetteren kan leiden tot een hoge frequentie van vals-positieve reacties, dus wees voorzichtig.Voeg na de wasbeurten 50 microliters konijn anti-kippen IgG-IgY toe, geconjugeerd aan paardenradenperoxidas, en verdund een op 10.000 in een procent melk-oplossing. Laat de oplossing gedurende minimaal een uur bij kamertemperatuur in de putjes incuberen. Was vervolgens de plaat drie keer met PBS-Tween uit, zoals eerder.Laad vervolgens de putten met 50 microliters TMB-substraat. U kunt meteen een kleurverandering beginnen te zien. Laat de plaat gedurende 10 minuten incuberen voordat u deze leest met een microplaat-spectrofotometer.Lees de plaat op 650 nanometer en noteer de waarden. Om insecten extern te markeren, bereidt u een liter plastic flessen met toegangsgaten voor en verdeelt u 100 insecten in twee flessen. Spuit vervolgens de insecten in een container met een milliliter gedestilleerd water, dat als negatieve controle dient.Bevestig vervolgens een medische vernevelaar aan een luchtuitlaat en pas de luchtstroom aan zodat de vernevelaar damp produceert. Spuit de andere insecten met een milliliter vijf procent kippen-eiwitoplossing. Het spuitproces zou tussen de twee en vijf minuten moeten duren om te voltooien.Kork vervolgens de gaten en laat de oplossing volledig op kamertemperatuur drogen. Eenmaal gedroogd, brengt u de insecten terug naar hun normale kweekcontainers, met hun standaarddieet en houdt u ze zoals gewoonlijk. Verzamel later de insecten op vooraf bepaalde tijdsintervallen voor het testen.Om de externe markeringsretentie te controleren, gebruikt u een procedure die identiek is aan de ELISA-test voor het testen van de interne markeringsretentie, met kleine wijzigingen. Nadat de insecten zijn overgebracht naar microcentrifugebuisjes met TBS, laat ze een uur op een orbitale shaker draaien met 120 RPM, in plaats van ze te homogeniseren. Na het weken van de

administering-detecting-protein-marks-on-arthropods-for-dispersal

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Dit protocol bevat instructies voor het klonale-cellijn selectie en een calcium-bioluminescentie test om de structuur-activiteit relaties van gesynthetiseerd geleedpotigen neuropeptiden op hun verwante GPCR's te analyseren. Deze test kan gebruikt worden voor receptor deorphanization en structuur-activiteit relatie studies voor synthetische analoog ontwerp en peptide / drug-lead discovery.

Een Calcium Bioluminescentie Assay voor functionele analyse van Mosquito ( Aedes aegypti) En Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G eiwit-gekoppelde receptoren

Werkwijze snel scherm waardplant vluchtige door meting van de elektrofysiologische reactie van volwassen navel orangeworm...

Electroantennographic Bioassay als een screeningsinstrument voor Host Plant Vluchtige stoffen

This video demonstrates the visualization of protein-protein interactions at the Drosophila neuromuscular junction (NMJ) using Proximity Ligation Assay (PLA). After isolating the body walls, interacting proteins are probed with primary antibodies and PLA-conjugated secondary antibodies. The proximity of the interacting proteins facilitates the ligation of probes with connector oligonucleotides, forming circular DNA, which is then amplified by rolling circle amplification. Fluorescent probes...

Detection of Protein-Protein Interactions in Drosophila Larvae Using a Proximity Ligation Assay

Dit protocol toont hoe Proximity Ligatie Assay kunnen worden toegepast voor aantonen in situ eiwit-eiwit interacties bij de Drosophila larven neuromusculaire junctie. Met deze techniek worden Schijven grote en Hu-li tai Shao aangetoond dat een complex in het postsynaptische gebied, een associatie eerder geïdentificeerd door middel co-immunoprecipitatie vormen.

Detectie van In Situ Eiwit-eiwit complexen in de Drosophila Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling

De mogelijkheid om nauwkeurig detecteren afschriften of eiwitten in Drosophila weefsels is essentieel voor de studie van hun overvloed en localisatie gerelateerde aan het ontwikkelingsproces. Hier is de beschrijving van een eenvoudige procedure om te ontleden pop vleugels. Deze vleugels kunnen worden gebruikt als de monsters in verschillende technieken (PCR assay, immunohistochemistry, enz.).

Een snelle en doeltreffende methode om te ontleden pop vleugels van Drosophila geschikt voor Immunodetections of PCR-testen

Dit protocol worden de stappen beschreven voor het gebruik van de nieuwe software, SwarmSight, voor het bijhouden van de frame-voor-frame van insecten antenne en proboscis posities van conventionele web camera video's met behulp van conventionele computers. De gratis, open-source software verwerkt frames ongeveer 120 keer sneller dan mensen en presteert op beter dan menselijke nauwkeurigheid.

SwarmSight: Real-time Tracking van insecten antenne bewegingen en Proboscis extensie Reflex met een gemeenschappelijke voorbereiding en conventionele Hardware

We beschrijven hoe de geleedpotigen van de Leaf-woning worden gekwantificeerde door de bladeren en het einde van de takken in een zak te verzegelen, het zakmateriaal op te knippen en te bevriezen en het eerder bevroren materiaal in water te spoelen om geleedpotigen van het substraat te scheiden voor kwantificering.

Een methode voor het kwantificeren van gebladerte geleedpotigen

Het huidige protocol beschrijft een methode om voldoende speeksel van priemzuigende insecten te verzamelen met behulp van een kunstmatig medium. Dit is een handige methode voor het verzamelen van insectenspeeksel en het bestuderen van speekselfunctie op insectenvoedingsgedrag en vectoroverdraagbare virusoverdracht.

Tweelaagse membraansandwichmethode voor Laodelphax striatellus Speekselcollectie

We beschrijven een methode om kwantificeerbare hemolymfe efficiënt te verzamelen uit kleine geleedpotigen voor latere analyse.

Een nauwkeurige en kwantificeerbare methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen

Procedures worden beschreven voor het bestuderen van het sonderende en innamegedrag van Culex tarsalis muggen op menselijke handen met behulp van AC-DC elektropenetragrafie.

AC-DC Electropenetrografie voor de studie van sonderend en innamegedrag van Culex tarsalis muggen op mensenhanden

Dit artikel beschrijft een efficiënt protocol voor beeldende schijfdissectie en antistofkleuring dat zuinig is met reagentia en het hanteren van imaginale schijven in kleine aantallen vergemakkelijkt.

Kleinschalige dissectie en antilichaamkleuring van oog-antenne en vleugelbeeldschijven van Drosophila melanogaster

Leer hoe u insecten markeert met eiwitten voor verspreidingsonderzoek en deze detecteert met ELISA-technieken. Deze eenvoudige, kosteneffectieve methode maakt het mogelijk om migratiepatronen en de verspreiding van invasieve soorten te bestuderen.

Toedienen en het detecteren van eiwit Marks op Insecten voor Verspreiding Onderzoek

Meer video's verkennen