Sex Verschillen in Mouse hippocampus Astrocytes na

Het algemene doel van deze techniek is het prepareren van verrijkte sekse-specifieke hippcampale astrocytenkweken van pasgeboren muizen als instrument om de sekse-specifieke rollen van astrocyten te bestuderen na zuurstof- en glucosegebrek en reoxygenatie, om zo in vivo hypoxische ischemie na te bootsen in een celkweekomgeving. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke mechanistische en translationele vragen met betrekking tot de sekse-specifieke rol van hippcampale astrocyten na hypoxische ischemie in ontwikkelende mannelijke en vrouwelijke hersenen. Dissecteer de hersenen uit de kop van een pasgeboren muispuis door met een klein schaartje een posterieur-anterieure midline-incisie door de huid te maken om het cranium bloot te leggen.

Snijd de schedel voorzichtig in de middellijn open, van de nek tot aan de neus. Gebruik steriele platte pincetten om het schedeldak weg te pellen. Verwijder de hersenstam met behulp van gebogen pincetten en plaats de resterende hersenen in een dissectieschaal.

Draai de hersenen met gebogen pincetten om zodat het ventrale oppervlak naar boven is gericht en scheid vervolgens de hemisferen met een scherp, steriel chirurgisch mesje. Pel de cerebrale hemisferen terug met platte gebogen pincetten en verwijder voorzichtig het uitpuilende weefsel van de middenhersenen en de thalamus om de hippocampus bloot te leggen, een kleine zeepaardvormige structuur in de mediale temporale kwab. Verwijder beide hippocampuskwabben en reinig zorgvuldig de meninges en fibroblasten van het oppervlak van de kwabben door deze met fijne pincetten weg te trekken.

Overbreng beide hippocampuslobben van één enkele muis naar een tweede schaaltje gevuld met ongeveer 5 milliliters HBSS en plaats deze op ijs. Hak de lobben ongeveer 4 keer fijn met een scherp steriel chirurgisch mesje. Gebruik een steriele pipette van 1 milliliter om de HBSS en het weefsel over te brengen naar een steriele conische buis van 50 milliliter en centrifugeer deze vervolgens bij 300 times G gedurende 5 minuten.

Zuig na centrifugatie het supernatant af. Voeg 3 milliliters 0,25 percent trypsine toe, meng en incubeer het weefsel bij 37 degrees Celsius gedurende 20 minuten met voorzichtig schudden. Centrifugeer de buis na de incubatie bij 300 times G gedurende 5 minuten.

Gebruik na het centrifugeren een steriele glazen pipet om het supernatant voorzichtig af te zuigen en voeg vervolgens 10 milliliters voorverwarmd astrocyte-platingmedium toe. Tritureer 20 tot 30 keer met een vuurgepolijste glazen pipet. Na een volgende centrifugatie van 5 minuten bij 300 times G, zuigt u het supernatant af en voegt u 2 milliliters astrocyte-platingmedium toe.

Giet de celsuspensie door een mesh-filter van 70 micron in een nieuwe conische buis van 50 milliliter. Voeg de volledige celsuspensie toe aan een gecoate steriele T-25 kweekfles die 3 milliliters astrocyten-plaatmedium bevat. Incubeer de fles bij 37 degrees Celsius in een incubator met 5% carbon dioxide.

Observe de volgende dag de voortgang van de astrocytaire confluentie onder een lichtmicroscoop, aspireer het medium en vervang dit door 2 milliliters vers astrocyten-platingsmedium. Rond dag 11 in vitro worden de confluente astrocyten geoogst door het medium te aspireren en vervolgens 2 milliliters 0,25%trypsine toe te voegen. Roteer de kolf voorzichtig een paar keer en aspireer daarna de trypsine met een steriele glazen pipet.

Voeg nog eens 2 milliliters 0,25%trypsin toe en laat de kolf 4-5 minuten op kamertemperatuur staan. Verwijder na het verwijderen van de trypsin de kolf gedurende 10 minuten in een 5%CO2 incubator bij 37 graden Celsius. Voeg na de incubatie 5 milliliters astrocyte plating medium toe en laat de astrocytenlaag los door 3 tot 4 keer tegen de kolf te tikken.

Tritureer de celsuspensie voorzichtig langs de bodem van de kolf om volledige loslating te bewerkstelligen en verzamel de astrocyten vervolgens in een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer de buis bij 300 ×g gedurende 5 minuten. Aspireer het supernatant en voeg daarna 1 milliliter vers astrocyte plating medium toe.

Voeg 10 µL van de celsuspensie toe aan een hemocytometer en gebruik een geïnverteerde fasecontrastmicroscoop met een 10x objectief om de cellen in het grote centrale rastergebied te tellen. Verdun de cellen tot ongeveer 1 × 10⁵ cellen per 2 mL astrocyten-platingmedium. Pipetteer 2 mL van de celsuspensie op een met poly-D-lysine gecoat glazen dekglas in de well van een 24-wells kweekplaat.

Incubeer bij 37 °C in een incubator met 5% kooldioxide. Om de zuurstof- en glucoseprivatie te starten, aspireer het medium uit het dekglas met de adherente astrocyten en spoel dit eenmaal af met 1 milliliter isotone OGD-oplossing. Voeg 0,2 milliliter OGD-oplossing toe aan de well en plaats deze in een hypoxische incubator.

Meng voorzichtig met een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm gedurende de eerste 30 minuten van de hypoxie. Voor reoxygenatie wordt de OGD-oplossing vervangen door 2 milliliters astrocyten-platingmedium, waarna incubatie plaatsvindt in 5% koolstofdioxide en atmosferische lucht bij 37 graden Celsius gedurende 5 uur. Deze immunofluorescentie-afbeelding toont de zuiverheid van de primaire muis-hippocampale astrocytenkweek.

De astrocytenkweek is immunogekleurd om de neuronale dendrietmarker, MAP2, in rood, en de microglia-marker, IBA1, in groen aan te tonen. Kernen zijn gekleurd met DAPI, wat blauw verschijnt. De pijl geeft microglia-contaminatie aan.

Deze representatieve immunofluorescentie-afbeelding van gecultiveerde hippocampale astrocyten onder normoxische omstandigheden toont GFAP-immunoreactiviteit in het rood en HIF1-alpha-labeling in het groen. Opnieuw zijn de kernen gekleurd met DAPI, wat blauw verschijnt. De pijl geeft een lage HIF1-alpha-expressie aan.

Na 2 uur van zuurstof- en glucosetekort en 5 uur reoxygenatie was de HIF1-alpha-expressie verhoogd in gecultiveerde hippocampale astrocyten, zoals aangegeven door de pijl die wijst naar de verhoogde nucleaire expressie van HIF1-alpha. De GFAP-expressie en S100b-expressie waren opgereguleerd in hippocampale astrocytenkweken van mannelijke muizen na zuurstof- en glucosetekort en reoxygenatie. Opregulatie van S100b en GFAP werd ook waargenomen in astrocyten verkregen van vrouwelijke muizen.

Na deze procedure kunnen andere methoden zoals kwantitatieve PCR, western blotting, siRNA en immunohistochemische kleuringen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals sekse-specifieke veranderingen in bepaalde gen- en eiwitexpressies na in vitro ischemie. Na de ontwikkeling van deze techniek kan deze de weg vrijmaken voor onderzoekers in het vakgebied van de neurowetenschappen om de effecten en gevolgen van een beroerte in de hippocampus te onderzoeken door astrocyten in cultuur te bestuderen.